相關(guān)申請的交叉參考

本申請要求2015年5月8日提交的部分繼續(xù)申請美國專利申請第14/707,796號和2015年5月8日提交的美國專利申請第14/707,876號以及2014年11月18日提交的美國專利申請第14/546,105號的優(yōu)先權(quán)。

背景技術(shù)：

多種不同類型的核酸目前正被開發(fā)成用于治療多種疾病的治療劑。這些核酸包括基因療法中的dna、質(zhì)粒類干擾核酸、用于rna干擾(rnai)的小干擾核酸，包括sirna、mirna、反義分子、核酶和適體。由于正在開發(fā)這些分子，因此已出現(xiàn)以如下形式制造這些分子的需要，所述形式穩(wěn)定、存放期長并且可易于合并到無水有機或無水極性非質(zhì)子溶劑中，使得能夠封裝核酸而不存在可能在極性水溶液或非極性溶劑中發(fā)生的副反應(yīng)。

本發(fā)明涉及新穎的脂質(zhì)組合物，其有助于生物活性和治療性分子的細胞內(nèi)遞送。本發(fā)明還涉及包含這類脂質(zhì)組合物并用于將治療有效量的生物活性分子遞送至患者細胞中的醫(yī)藥組合物。

治療性化合物向個體的遞送對于其治療作用是重要的，并且通?？赡芤蛩龌衔锏竭_靶細胞和組織的能力有限而受到阻礙。通過各種遞送方式改善這類化合物進入組織的靶細胞是至關(guān)重要的。本發(fā)明涉及有助于生物活性分子的靶向細胞內(nèi)遞送的組合物和制備方法中的新穎脂質(zhì)。

通常未實現(xiàn)有效靶向患者組織的生物活性分子的實例包括：(1)許多蛋白質(zhì)，包括免疫球蛋白；(2)聚核苷酸，如基因組dna、cdna或mrna；(3)反義聚核苷酸；和(4)許多低分子量化合物，不論是合成或是天然存在的，如肽激素和抗生素。

執(zhí)業(yè)醫(yī)生現(xiàn)在所面對的一個基本挑戰(zhàn)是多種不同類型的核酸目前正被開發(fā)成用于治療多種疾病的治療劑。這些核酸包括基因療法中的dna、質(zhì)粒、小干擾核酸(sina)、用于rna干擾(rnai)的sirna和微rna(mirna)、反義分子、核酶、反義微rna和適體。由于正在開發(fā)這些核酸，因此需要制造容易制備并且可易于遞送至目標組織的脂質(zhì)配制品。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本文所描述的是式i、ii、iii、iv和v化合物。所描述的是式i化合物

其中

r1和r2各自由1至9個碳所組成的直鏈烷基、2至11個碳所組成的烯基或炔基組成；l1和l2各自由5至18個碳所組成的直鏈亞烷基或亞烯基組成，或與n一起形成雜環(huán)；x1和x3都由-co-o-組成；

x2由s或o組成；l3由鍵或1至6個碳所組成的直鏈亞烷基組成，或與n一起形成雜環(huán)；r3由1至6個碳所組成的直鏈或支鏈亞烷基組成；并且r4和r5是相同或不同的，各自由氫或1至6個碳所組成的直鏈或支鏈烷基組成；

或其藥學(xué)上可接受的鹽。

本文還描述的是式ii化合物

其中

r1和r2都由1至12個碳所組成的直鏈烷基、2至12個碳所組成的烯基或炔基組成；l1和l2都由5至18個碳所組成的直鏈亞烷基或亞烯基組成，或與n一起形成雜環(huán)；x由s組成；l3由鍵或1至6個碳所組成的直鏈亞烷基組成，或與n一起形成雜環(huán)；r3由1至6個碳所組成的直鏈或支鏈亞烷基組成；并且r4和r5是相同或不同的，各自由氫或1至6個碳所組成的直鏈或支鏈烷基組成；

或其藥學(xué)上可接受的鹽。

在式ii化合物的一個實施例中，l1和l2都由五個碳所組成的直鏈亞烷基組成。在式i化合物的另一個實施例中，r3是亞乙基或亞丙基。在式i化合物的另一個實施例中，r4和r5是相同或不同的，各自是氫、甲基或乙基。在式i化合物的另一個實施例中，l3是鍵。在式i化合物的另一個實施例中，r1和r2都由十個碳所組成的直鏈烯基組成。

本文還描述的是式iii或iv化合物

其中

r1由具有12至20個碳的支鏈烷基組成；r2由具有5至10個碳的直鏈烷基或具有12至20個碳的支鏈烷基組成；l1和l2各自由鍵或具有1至3個碳原子的直鏈烷基組成；x由s或o組成；l3由鍵或低碳烷基組成；r3是低碳烷基，以及

r4和r5是相同或不同的，各自由低碳烷基組成；或其藥學(xué)上可接受的鹽。

在式iii或iv化合物的一個實施例中，l3由鍵組成。式iii或iv化合物的另一個實施例，x是s。在式iii或iv化合物的另一個實施例中，r3是亞乙基。在式iii或iv化合物的另一個實施例中，r3是亞正丙基或亞異丙基。在式iii或iv化合物的另一個實施例中，r4和r5分別是甲基、乙基或異丙基。在式iii或iv化合物的另一個實施例中，l1和l2各自由鍵組成。在式iii或iv化合物的另一個實施例中，l1和l2各自由亞甲基組成。在式iii或iv化合物的另一個實施例中，r1和r2各自由支鏈烷基組成。在式iii或iv化合物的另一個實施例中，r2由烷基組成。在式iii或iv化合物的另一個實施例中，r1和r2各自由19或20個碳原子組成。在式iii或iv化合物的另一個實施例中，r1或r2各自由13或14個碳原子組成。在式iii或iv化合物的另一個實施例中，l3由亞甲基組成，r3是亞乙基，x2是s，并且r4和r5各自是甲基。在式iii或iv化合物的另一個實施例中，其中l(wèi)3由鍵組成，r3是亞乙基，x是s，并且r4和r5各自是甲基。在式iii或iv化合物的另一個實施例中，l3由鍵組成，r3由亞正丙基組成，x由s組成，并且r4和r5各自由甲基組成。在式iii或iv化合物的另一個實施例中，l3由鍵組成，r3由亞異丙基組成，x由s組成，并且r4和r5各自由甲基組成。

還描述的是式v化合物

其中

r1由1-18個碳所組成的直鏈或支鏈烷基、2至12個碳所組成的烯基或炔基、或膽固醇基組成；r2由1至18個碳所組成的直鏈或支鏈烷基或烯基組成；l1由5至9個碳所組成的直鏈烷基組成，或當r1由膽固醇基組成時，那么l1由3至4個碳所組成的直鏈亞烷基或烯基組成；x1由-o-(co)-或-(co)-o-組成；x2由s或o組成；l2由鍵或具有1至6個碳的直鏈亞烷基組成；r3由具有1至6個碳的直鏈或支鏈亞烷基組成；并且r4和r5是相同或不同的，各自由1至6個碳的直鏈或支鏈烷基組成；

或其藥學(xué)上可接受的鹽。

在式v化合物的一個實施例中，l2由鍵組成。在式v化合物的另一個實施例中，x2由s組成。在式v化合物的另一個實施例中，x1是-o-(co)-。在式v化合物的另一個實施例中，r3是亞乙基。在式v化合物的另一個實施例中，r3是亞正丙基或亞異丙基。在式v化合物的另一個實施例中，r4和r5分別是甲基、乙基或異丙基。在式v化合物的另一個實施例中，l2由亞甲基組成。在式v化合物的另一個實施例中，r1和r2各自由支鏈烷基組成。在式v化合物的另一個實施例中，r2由烷基組成。在式v化合物的另一個實施例中，r1和r2各自由19或20個碳原子組成。在式v化合物的另一個實施例中，r1或r2各自由13或14個碳原子組成。在式v化合物的另一個實施例中，l2由亞甲基組成，r3是亞乙基，x1是-o-(co)-，x2是s，并且r4和r5都是甲基。在式v化合物的另一個實施例中，l2由鍵組成，r3是亞乙基，x1是-o-(co)-，x2是s，并且r4和r5都是甲基。在式v化合物的另一個實施例中，l2由鍵組成，r3是亞正丙基，x1是-o-(co)-，x2是s，并且r4和r5都是甲基。在式v化合物的另一個實施例中，l2由鍵組成，r3是亞異丙基，x1是-o-(co)-，x1是s，并且r4和r5都是甲基。

核酸優(yōu)選地具有抑止目標基因表達的活性。目標基因優(yōu)選地是與炎癥相關(guān)聯(lián)的基因。

本文還描述的是一種通過使用以上任一種組合物將核酸引入到哺乳動物細胞中的方法。細胞可在肝臟、肺、腎臟、腦、血液、脾臟或骨骼中。優(yōu)選地，靜脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或鞘內(nèi)投與組合物。優(yōu)選地，在用于治療癌癥或炎性疾病的方法中使用本文所描述的組合物。疾病可為選自由以下組成的群組的疾?。好庖卟“Y、癌癥、腎臟疾病、纖維化疾病、遺傳異常、炎癥和心血管病癥。

附圖說明

圖1示出了由不同陽離子脂質(zhì)囊封的sirna的基因敲低活性。脂質(zhì)包括mc3(0.3mg/kg)、nci(0.3mg/kg)、atx-547(0.3mg/kg)、atx-001(0.3和1.0mg/kg)、atx-002(0.3和1.0mg/kg)和atx-003(0.3和1.0mg/kg)。在向c57bl6小鼠投與sirna配制品之后，示出與僅注射媒劑相比小鼠血漿中基因敲低的因子vii的量。包括異常和正常人類血漿中因子vii的量作為對照。由星號(＊)示出因子vii水平的統(tǒng)計學(xué)上顯著降低(p＜0.01)。

圖2示出了sirna對于因子vii活性的作用的評估，其基于圖2中所示的結(jié)果并且歸一化成與僅媒劑相比的基因敲低百分比。

圖3示出了由不同陽離子脂質(zhì)囊封的sirna的基因敲低活性。脂質(zhì)包括mc3(0.3和1.5mg/kg)、ncl(0.3mg/kg)、at547(0.1和0.3mg/kg)、at004(0.3)、at006(0.3和1.0mg/kg)、atx-010(0.3mg/kg)和at001(0.3和1.5mg/kg)。在向c57bl6小鼠投與sirna配制品之后，示出與僅注射媒劑相比小鼠血漿中基因敲低的因子vii的量。包括異常和正常人類血漿中因子vii的量作為對照。由星號(＊)示出因子vii水平的統(tǒng)計學(xué)上顯著降低(p＜0.01)。

圖4示出了sirna對于因子vii活性的作用的評估，其基于圖2中所示的結(jié)果并且歸一化成與僅媒劑相比的基因敲低百分比。

具體實施方式

“至少一個”意思指一個或多個(例如，1-3、1-2或1個)。

“組合物”包括包含規(guī)定量的規(guī)定成分的產(chǎn)物，以及由規(guī)定量的規(guī)定成分的組合直接或間接產(chǎn)生的任何產(chǎn)物。

“與......組合”在用于描述本發(fā)明的治療方法中式1、i和ii化合物與其它藥劑的投與時，意思指式1、i和ii化合物與其它藥劑以分開的劑型依次或同時投與，或以同一劑型同時投與。

“哺乳動物”意思指人類或其它哺乳動物，或意思指人類。

“患者”包括人類和其它哺乳動物，優(yōu)選地人類。

“烷基”意思指飽和或不飽和的直鏈或支鏈烴鏈。在各種實施例中，烷基具有1-18個碳原子，即是c1-c18基團，或是c1-c12基團、c1-c6基團或c1-c4基團。獨立地，在各種實施例中，烷基具有零個分支(即，是直鏈)、一個分支、兩個分支或大于兩個分支?！跋┗币馑贾缚删哂幸粋€雙鍵、兩個雙鍵、大于兩個雙鍵的不飽和烷基?！叭不币馑贾缚删哂幸粋€三鍵、兩個三鍵或大于兩個三鍵的不飽和烷基。烷基鏈可任選地經(jīng)1個取代基(即，烷基是經(jīng)單取代的)、或1-2個取代基、或1-3個取代基、或1-4個取代基取代。取代基可選自由以下組成的群組：羥基、氨基、烷基氨基、硼基、羧基、硝基、氰基或鹵基。當烷基并入一個或多個雜原子時，烷基在本文中被稱為雜烷基。當烷基上的取代基是烴時，那么所得基團簡稱為經(jīng)取代的烷基。在各種方面中，包括取代基的烷基具有小于25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8或7個碳。

“低碳烷基”意思指在鏈中具有一至六個碳原子的基團，所述鏈可為直鏈或支鏈。合適烷基的非限制性實例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、叔丁基、正戊基和己基。

“烷氧基”意思指烷基-o-基團，其中烷基如上文所定義。烷氧基的非限制性實例包括：甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基和庚氧基。經(jīng)由醚氧鍵結(jié)至母體部分。

“烷氧基烷基”意思指烷氧基-烷基-基團，其中烷氧基和烷基如先前所描述。優(yōu)選的烷氧基烷基包含低碳烷基。經(jīng)由烷基鍵結(jié)至母體部分。

“烷芳基”意思指烷基-芳基-基團，其中烷基和芳基如先前所描述。優(yōu)選的烷芳基包含低碳烷基。經(jīng)由芳基鍵結(jié)至母體部分。

“氨基烷基”意思指經(jīng)由烷基鍵結(jié)至母體部分的nh2-烷基-基團，其中烷基如上文所定義。

“羧基烷基”意思指經(jīng)由烷基鍵結(jié)至母體部分的hooc-烷基-基團，其中烷基如上文所定義。

“可商購的化學(xué)物質(zhì)”和本文闡述的實例中所用的化學(xué)物質(zhì)可從標準商業(yè)來源獲得，其中這類來源包括例如acrosorganics(賓夕法尼亞州匹茲堡)、sigma-adrichchemical(威斯康星州密爾沃基)、avocadoresearch(英國蘭開夏)、bionet(英國康沃爾)、boronmolecular(北卡羅萊納州三角研究園)、combi-blocks(加利福尼亞州圣地亞哥)、eastmanorganicchemicals，eastmankodakcompany(紐約羅契斯特)、fisherscientificco.(賓夕法尼亞州匹茲堡)、frontierscientific(猶他州洛根)、icnbiomedicals，inc.(加利福尼亞州科斯塔梅沙)、lancastersynthesis(新罕布什爾州溫德姆)、maybridgechemicalco.(英國康沃爾)、piercechemicalco.(伊利諾斯州羅克福德)、riedeldehaen(德國漢諾威)、spectrumqualityproduct，inc.(新澤西州新不倫瑞克)、tciamerica(俄勒岡州波特蘭)和wakochemicalsusa，inc.(弗吉尼亞州里奇蒙)。

“化學(xué)文獻中所描述的化合物”可如所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員已知經(jīng)由關(guān)于化合物和化學(xué)反應(yīng)的參考書和數(shù)據(jù)庫鑒別。詳述用于制備本文所公開的化合物的反應(yīng)物的合成或?qū)γ枋霰疚乃_的化合物的制備的文章提供參考的合適參考書和論文包括例如“合成有機化學(xué)(syntheticorganicchemistry)”，johnwileyandsons，inc.紐約；s.r-sandler等人，“有機官能團制備(organicfunctionalgrouppreparations)”第2版，academicpress，紐約，1983；h.o.house，“現(xiàn)代合成反應(yīng)(modernsyntheticreactions)，”第2版，w.a.benjamin，inc.加利福尼亞州門洛帕克，1972；t.l.glichrist，“雜環(huán)化學(xué)(heterocyclicchemistry)，”第2版.johnwileyandsons，紐約，1992；j.march，“先進有機化學(xué)：反應(yīng)、機制和結(jié)構(gòu)(advancedorganicchemistry：reactions，mechanismsandstructure)，”第5版，wileyinterscience，紐約，2001；特定和類似反應(yīng)物也可經(jīng)由美國化學(xué)學(xué)會的化學(xué)文摘社(chemicalabstractserviceoftheamericanchemicalsociety)所制備的已知化學(xué)物質(zhì)的索引來鑒別，所述索引可用于大部分公共圖書館和大學(xué)圖書館以及遍及在線數(shù)據(jù)庫(例如華盛頓的美國化學(xué)學(xué)會)。已知但目錄中不可商購的化學(xué)物質(zhì)可由定制化學(xué)合成室制備，其中許多標準化學(xué)供應(yīng)室(如上文所列的那些)提供定制合成服務(wù)。

“鹵基”意思指氟基、氯基、溴基或碘基。優(yōu)選的是氟基、氯基或溴基，并且更優(yōu)選的是氟基和氯基。

“鹵素”意思指氟、氯、溴或碘。優(yōu)選的是氟、氯和溴。

“雜烷基”是含有碳和至少一個雜原子的飽和或不飽和直鏈或支鏈。在各種實施例中，雜烷基可具有一個雜原子、或1-2個雜原子、或1-3個雜原子、或1-4個雜原子。在一個方面，雜烷基鏈含有1至18(即，1-18)個成員原子(碳和雜原子)，并且在各種實施例中含有1-12、或1-6、或1-4個成員原子。獨立地，在各種實施例中，雜烷基具有零個分支(即，是直鏈)、一個分支、兩個分支或大于兩個分支。獨立地，在一個實施例中，雜烷基是飽和的。在另一個實施例中，雜烷基是不飽和的。在各種實施例中，不飽和雜烷基可具有一個雙鍵、兩個雙鍵、大于兩個雙鍵，和/或一個三鍵、兩個三鍵或大于兩個三鍵。雜烷基鏈可經(jīng)取代或未經(jīng)取代。在一個實施例中，雜烷基鏈未經(jīng)取代。在另一個實施例中，雜烷基鏈經(jīng)取代。經(jīng)取代的雜烷基鏈可具有1個取代基(即，通過單取代)，或可具有例如1-2個取代基、或1-3個取代基、或1-4個取代基。示例性雜烷基取代基包括酯(-c(o)-o-r)和羧基(-c(o)-)。

“羥基烷基”意思指ho-烷基-基團，其中烷基如先前所定義。優(yōu)選的羥基烷基含有低碳烷基。合適的羥基烷基的非限制性實例包括羥甲基和2-羥乙基。

“水合物”是其中溶劑分子是h2o的溶劑合物。

“脂質(zhì)”意思指包含脂肪酸酯并且特征在于不可溶于水、但可溶于許多有機溶劑中的有機化合物。脂質(zhì)通常分成至少三類：(1)“簡單脂質(zhì)”，其包括脂肪和油以及蠟；(2)“化合物脂質(zhì)”，其包括磷脂和糖脂；和(3)“衍生脂質(zhì)”，如類固醇。

“脂質(zhì)粒子”意思指可用于遞送治療性核酸(例如，mrna)至所關(guān)注的目標位點(例如，細胞、組織、器官等等)的脂質(zhì)配制品。在優(yōu)選實施例中，脂質(zhì)粒子是核酸-脂質(zhì)粒子，其通常由陽離子脂質(zhì)、非陽離子脂質(zhì)(例如，磷脂)、防止粒子聚集的結(jié)合脂質(zhì)(例如，peg-脂質(zhì))和任選地膽固醇形成。通常，治療性核酸(例如，mrna)可囊封于粒子的脂質(zhì)部分中，從而保護其免于酶降解。

脂質(zhì)粒子的平均直徑通常是30nm至150nm、40nm至150nm、50nm至150nm、60nm至130nm、70nm至110nm、70nm至100nm、80nm至100nm、90nm至100nm、70至90nm、80nm至90nm、70nm至80nm、或30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、145nm或150nm，并且基本上是無毒的。另外，核酸，當存在于本發(fā)明的脂質(zhì)粒子中時，在水溶液中抗核酸酶降解。

“溶劑合物”意思指本發(fā)明化合物與一個或多個溶劑分子的物理性締合。此物理性締合涉及不同程度的離子和共價鍵結(jié)，包括氫鍵結(jié)。在某些情況下，溶劑合物將能夠分離，例如當一個或多個溶劑分子并入結(jié)晶固體的晶格中時。“溶劑合物”涵蓋溶液相和可分離的溶劑合物。合適溶劑合物的非限制性實例包括乙醇合物、甲醇合物等等。

“經(jīng)脂質(zhì)囊封”可意思指提供完全囊封、部分囊封或兼具的治療性核酸(如mrna)的脂質(zhì)粒子。在一優(yōu)選實施例中，核酸(例如，mrna)完全囊封于脂質(zhì)粒子中。

“脂質(zhì)結(jié)合物”意思指抑制脂質(zhì)粒子聚集的結(jié)合脂質(zhì)。這類脂質(zhì)結(jié)合物包括(但不限于)peg-脂質(zhì)結(jié)合物，如偶合到二烷氧基丙基的peg(例如，peg-daa結(jié)合物)、偶合到二?；视偷膒eg(例如，peg-dag結(jié)合物)、偶合到膽固醇的peg、偶合到磷脂酰乙醇胺的peg和結(jié)合到神經(jīng)酰胺的peg；陽離子peg脂質(zhì)；聚噁唑啉(poz)-脂質(zhì)結(jié)合物；聚酰胺寡聚物(例如，atta-脂質(zhì)結(jié)合物)和其混合物。peg或poz可直接結(jié)合到脂質(zhì)或可經(jīng)由連接體部分連接到脂質(zhì)。可使用適用于將peg或poz偶合到脂質(zhì)的任何連接體部分，包括例如不含酯的連接體部分和含有酯的連接體部分。在某些優(yōu)選實施例中，使用不含酯的連接體部分，如酰胺或氨基甲酸酯。

“兩性脂質(zhì)”意思指其中脂質(zhì)物質(zhì)的疏水性部分定向于疏水相，而親水性部分定向于水相的物質(zhì)。親水性特征源自存在極性或帶電荷基團，如碳水化合物、磷酸酯基、羧基、硫酸根合、氨基、巰基、硝基、羥基和其它類似基團。疏水性可通過包括非極性基團而賦予，非極性基團包括(但不限于)長鏈飽和與不飽和脂族烴基并且這類基團經(jīng)一個或多個芳香族基團、環(huán)脂族基團或雜環(huán)基團取代。兩性化合物的實例包括(但不限于)磷脂、氨基脂和鞘脂。

磷脂的代表性實例包括(但不限于)磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕櫚酰油?；字Ｄ憠A、溶血磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰乙醇胺、二棕櫚?；字Ｄ憠A、二油?；字Ｄ憠A、二硬脂?；字Ｄ憠A和二亞油?；字Ｄ憠A。缺少磷的其它化合物，如鞘脂、鞘糖脂家族、二?；视秃挺?酰氧基酸，也在稱為兩性脂質(zhì)的群組內(nèi)。此外，上文所描述的兩性脂質(zhì)可與包括甘油三酯和固醇的其它脂質(zhì)混合。

“中性脂質(zhì)”意思指在所選ph下以不帶電荷或中性兩性離子形式存在的脂質(zhì)種類。在生理ph下，這類脂質(zhì)包括例如二?；字Ｄ憠A、二?；字Ｒ掖及?、神經(jīng)酰胺、鞘磷脂、腦磷脂、膽固醇、腦苷脂和二酰基甘油。

“非陽離子脂質(zhì)”意思指兩性脂質(zhì)或中性脂質(zhì)或陰離子脂質(zhì)，并且更詳細地描述于下文。

“陰離子脂質(zhì)”意思指在生理ph下帶負電荷的脂質(zhì)。這些脂質(zhì)包括(但不限于)磷脂酰甘油、心肌磷脂、二?；字＝z氨酸、二?；字?、n-十二酰基磷脂酰乙醇胺、n-丁二酰基磷脂酰乙醇胺、n-戊二酰基磷脂酰乙醇胺、賴氨?；字８视汀⒆貦磅Ｓ王；字８视?popg)和其它陰離子修飾基團接合到中性脂質(zhì)。

術(shù)語“疏水性脂質(zhì)”意思指具有非極性基團的化合物，非極性基團包括(但不限于)長鏈飽和與不飽和脂族烴基并且這類基團任選地經(jīng)一個或多個芳香族基團、環(huán)脂族基團或雜環(huán)基團取代。合適實例包括(但不限于)二?；视?、二烷基甘油、n-n-二烷基氨基、1，2-二酰氧基-3-氨基丙烷和1，2-二烷基-3-氨基丙烷。

術(shù)語“陽離子脂質(zhì)”和“氨基脂”在本文中可互換用于包括那些具有一個、兩個、三個或更多個脂肪酸或脂肪烷基鏈和ph可滴定的氨基頭部基團(例如，烷基氨基或二烷基氨基頭部基團)的脂質(zhì)和其鹽。陽離子脂質(zhì)通常在低于陽離子脂質(zhì)pka的ph下質(zhì)子化(即，帶正電荷)并且在高于pka的ph下基本上是中性的。本發(fā)明的陽離子脂質(zhì)也可稱為可滴定的陽離子脂質(zhì)。在一些實施例中，陽離子脂質(zhì)包含：可質(zhì)子化叔胺(例如，ph可滴定)頭部基團；c18烷基鏈，其中每一烷基鏈獨立地具有0至3(例如，0、1、2或3)個雙鍵；和頭部基團與烷基鏈之間的醚、酯或縮酮鍵。這類陽離子脂質(zhì)包括(但不限于)dsdma、dodma、dlindma、dlendma、γ-dlendma、dlin-k-dma、dlin-k-c2-dma(也稱為dlin-c2k-dma、xtc2和c2k)、dlin-k-c3-dma、dlin-k-c4-dma、dlen-c2k-dma、y-dlen-c2k-dma、dlin-m-c2-dma(也稱為mc2)、dlin-m-c3-dma(也稱為mc3)和(dlin-mp-dma)(也稱為1-b11)。

術(shù)語“經(jīng)取代”意思指經(jīng)除氫以外的規(guī)定基團或經(jīng)一個或多個可能相同或不同的基團、部分或自由基(其中每一個例如是獨立選擇的)取代。

“反義核酸”意思指借助于rna-rna或rna-dna或rna-pna(蛋白質(zhì)核酸；egholm等人，1993自然(nature)365，566)相互作用結(jié)合于目標rna并且改變目標rna的活性的非酶核酸分子(關(guān)于綜述，參見stein和cheng，1993科學(xué)(science)261，1004和woolf等人，美國專利第5,849,902號)。通常，反義分子沿著反義分子的單個連續(xù)序列與目標序列互補。然而，在某些實施例中，反義分子可結(jié)合于底物以使得底物分子形成環(huán)，和/或反義分子可結(jié)合以使得反義分子形成環(huán)。因此，反義分子可與兩個(或甚至更多)不連續(xù)底物序列互補，或反義分子的兩個(或甚至更多)不連續(xù)序列部分可與目標序列互補，或兩者都有。另外，反義dna可借助于dna-rna相互作用而用于靶向rna，從而活化rna酶h，分解雙螺旋體形式的目標rna。反義寡核苷酸可包含一個或多個rna酶h活化區(qū)，其能夠活化rna酶h裂解目標rna。反義dna可以化學(xué)方式合成或經(jīng)由使用單鏈dna表達載體或其等效物表達。反義rna是序列與目標基因mrna互補的rna鏈。有義rna具有與反義rna互補的序列，并且粘接至其互補反義rna以形成ina。這些反義和有義rna已用rna合成儀常規(guī)合成。

“核酸”是指呈單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸和其聚合物。所述術(shù)語涵蓋含有已知核苷酸類似物或經(jīng)修飾的主鏈殘基或鍵的核酸，其是合成、天然存在和非天然存在的，具有與參考核酸類似的結(jié)合特性，并且以與參考核苷酸類似的方式代謝。這類類似物的實例包括(但不限于)硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、膦酸甲酯、手性膦酸甲酯、2′-o-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(pna)。

“rna”意思指包含至少一個核糖核苷酸殘基的分子?！昂颂呛塑账帷币馑贾冈讦?d-呋喃核糖部分的2′位置具有羥基的核苷酸。所述術(shù)語包括雙鏈rna、單鏈rna、經(jīng)分離的rna(如部分純化的rna)、基本上純的rna、合成rna、重組產(chǎn)生的rna以及通過添加、缺失、取代和/或改變一個或多個核苷酸而與天然存在的rna不同的經(jīng)改變的rna。這類改變可包括如向干擾rna的端部或內(nèi)部(例如在rna的一個或多個核苷酸處)添加非核苷酸物質(zhì)。本發(fā)明的rna分子中的核苷酸還可包含非標準核苷酸，如非天然存在的核苷酸或化學(xué)合成的核苷酸或脫氧核苷酸。這些經(jīng)改變的rna可稱為類似物或天然存在的rna的類似物。如本文所用，術(shù)語“核糖核酸”和“rna”是指含有至少一個核糖核苷酸殘基的分子，包括sirna、反義rna、單鏈rna、微rna、mrna、非編碼rna和多價rna。核糖核苷酸是在β-d-呋喃核糖部分的2′位置具有羥基的核苷酸。這些術(shù)語包括雙鏈rna(dsrna)、單鏈rna(ssrna)、經(jīng)分離的rna(如部分純化的rna)、基本上純的rna、合成rna、重組產(chǎn)生的rna以及通過添加、缺失、取代、修飾和/或改變一個或多個核苷酸而與天然存在的rna不同的經(jīng)修飾和改變的rna。rna的改變可包括如向干擾rna的端部或內(nèi)部(例如在rna的一個或多個核苷酸處)添加非核苷酸物質(zhì)，rna分子中的核苷酸包括非標準核苷酸，如非天然存在的核苷酸或化學(xué)合成的核苷酸或脫氧核苷酸。這些經(jīng)改變的rna可稱為類似物。

如本文所用，“核苷酸”如所屬領(lǐng)域所公認包括天然堿基(標準)和所屬領(lǐng)域中眾所周知的修飾堿基。這類堿基一般位于核苷酸糖部分的1′位置。核苷酸一般包含堿基、糖和磷酸基。核苷酸可未經(jīng)修飾或在糖、磷酸和/或堿基部分處經(jīng)修飾(還可互換地稱為核苷酸類似物、經(jīng)修飾的核苷酸、非天然核苷酸、非標準核苷酸和其它；參見例如usman和mcswiggen，見上文；eckstein等人，國際pct公開案第wo92/07065號；usman等人，國際pct公開案第wo93/15187號；uhlman和peyman，見上文，全部特此以引用的方式并入本文中)。存在所屬領(lǐng)域中已知經(jīng)修飾的核酸堿基的數(shù)種實例，如由limbach等人，核酸研究(nucleicacidsres.)22：2183，1994所匯總?？梢氲胶怂岱肿又械膲A基修飾的一些非限制性實例包括：肌苷、嘌呤、吡啶-4-酮、吡啶-2-酮、苯基、假尿嘧啶、2，4，6-三甲氧基苯、3-甲基尿嘧啶、二氫尿苷、萘基、氨基苯基、5-烷基胞苷(例如，5-甲基胞苷)、5-烷基尿苷(例如，核糖胸苷)、5-鹵尿苷(例如，5-溴尿苷)或6-氮雜嘧啶或6-烷基嘧啶(例如，6-甲基尿苷)、丙炔等(burgin等人，生物化學(xué)(biochemistry)35：14090，1996；uhlman和peyman，見上文)。在此方面中，“經(jīng)修飾的堿基”意思指在1′位置處的除腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶以外的核苷酸堿基或其等效物。

如本文所用，互補核苷酸堿基是彼此形成氫鍵的一對核苷酸堿基。腺嘌呤(a)與胸腺嘧啶(t)或與rna中的尿嘧啶(u)配對，并且鳥嘌呤(g)與胞嘧啶(c)配對。核酸的互補區(qū)段或鏈彼此雜交(通過氫鍵結(jié)接合)?！盎パa”意思指核酸可通過傳統(tǒng)沃森-克里克(watson-crick)結(jié)合模式或通過其它非傳統(tǒng)結(jié)合模式與另一核酸序列形成氫鍵。

微rna(mirna)是調(diào)節(jié)基因表達的21-23個核苷酸長的單鏈rna分子，mirna是由從dna轉(zhuǎn)錄但不翻譯成蛋白質(zhì)的基因編碼(非編碼rna)；實際上，其是由稱為原mirna的初級轉(zhuǎn)錄物加工成稱為前mirna的短莖-環(huán)結(jié)構(gòu)并且最后加工成功能性mirna。成熟mirna分子與一個或多個信使rna(mrna)分子部分互補，并且其主要功能是下調(diào)基因表達

如本文所用，術(shù)語“小干擾rna(sirna)”，有時稱為短干擾rna或沉默rna，用以指一類16-40個核苷酸長的dsrna分子，其在生物學(xué)中發(fā)揮多種作用。最值得注意的是，sirna參與rna干擾(rnai)途徑，其中其干擾特定基因的表達。除了在rnai途徑中的作用以外，sirnas還在rnai相關(guān)途徑中起作用，例如充當抗病毒機制或用于塑造基因組的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)；現(xiàn)在僅闡明這些途徑的復(fù)雜性。

如本文所用，術(shù)語rnai是指受rna誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(risc)控制并且由細胞中的短dsrna分子引發(fā)的rna依賴性基因沉默過程，其中短dsrna分子與稱為argonaute蛋白的催化性risc組分相互作用。當dsrna或rna樣ina或sirna是外源性(來自受具有rna基因組的病毒感染或來自轉(zhuǎn)染ina或sirna)時，rna或ina被直接導(dǎo)入到細胞質(zhì)中并且由稱為dicer的酶裂解成短片段。啟動dsrna也可為內(nèi)源性(起源于細胞中)，如在由基因組中的rna編碼基因所表達的前mirna中。這類基因的初級轉(zhuǎn)錄物首先加工以形成細胞核中前mirna的特征性莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，隨后導(dǎo)出至細胞質(zhì)以待由dicer裂解。因此，兩個dsrna途徑(外源性和內(nèi)源性)在risc復(fù)合物處會聚。risc的活性組分argonaute蛋白裂解與其結(jié)合的sirna或ina互補的目標mrna鏈。因為由dicer產(chǎn)生的片段是雙鏈，所以其可能各自在理論上產(chǎn)生功能性sirna或ina。然而，兩條鏈中僅稱為引導(dǎo)鏈的一條鏈結(jié)合argonaute蛋白并且指導(dǎo)基因沉默。另一條反引導(dǎo)鏈或過客鏈在risc活化期間降解。

本文所描述的是式i、ii、iii、iv和v化合物。本文所描述的是式i化合物

其中

r1和r2都由1至9個碳所組成的直鏈烷基、2至11個碳所組成的烯基或炔基組成；

l1和l2都由5至18個碳所組成的直鏈亞烷基或亞烯基組成，或與n一起形成雜環(huán)；

x1和x3都由-co-o-組成；

x2是s或o；

l3由鍵或1至6個碳所組成的直鏈亞烷基組成，或與n一起形成雜環(huán)；

r3由1至6個碳所組成的直鏈或支鏈亞烷基組成；以及

r4和r5是相同或不同的，由氫或1至6個碳所組成的直鏈或支鏈烷基組成，

或其藥學(xué)上可接受的鹽。

本文還描述的是下表1中列出的atx-001至atx-017、atx-021至atx-023和atx-026至atx-030中列出的任何化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽。

本文還描述的是式ii化合物

其中

r1和r2都由1至12個碳所組成的直鏈烷基、2至12個碳所組成的烯基或炔基組成，

l1和l2都由5至18個碳所組成的直鏈亞烷基或亞烯基組成，或與n一起形成雜環(huán)，

x是s，

l3是鍵或1至6個碳所組成的直鏈亞烷基，或與n一起形成雜環(huán)，

r3是1至6個碳所組成的直鏈或支鏈亞烷基，以及

r4和r5是相同或不同的，各自是氫或1至6個碳所組成的直鏈或支鏈烷基；或藥學(xué)上可接受的鹽。

在式ii化合物的一個實施例中，l1和l2都由五個碳所組成的直鏈亞烷基組成。在式i化合物的另一個實施例中，r3是亞乙基或亞丙基。在式i化合物的另一個實施例中，r4和r5是相同或不同的，各自是氫、甲基或乙基。在式i化合物的另一個實施例中，l3是鍵。在式i化合物的另一個實施例中，r1和r2都由十個碳所組成的直鏈烯基組成。

在式i和ii化合物的另一個實施例中，化合物由選自下表1中列出的atx-001至atx-017、atx-021至atx-023和atx-026至atx-030中列出的任何化合物、或式1)至12)或其藥學(xué)上可接受的鹽的化合物組成。

本文還描述的是式iii或iv化合物

其中

r1由具有12至20個碳的支鏈烷基組成，

r2由具有5至10個碳的直鏈烷基或具有12至20個碳的支鏈烷基組成，

l1和l2各自由鍵或具有1至3個碳原子的直鏈烷基組成，

x由s或o組成，

l3由鍵或低碳烷基組成，

r3由低碳烷基組成，以及

r4和r5是相同或不同的，各自由低碳烷基組成；

或其藥學(xué)上可接受的鹽。

在式iii或iv化合物的一個實施例中，l3由鍵組成。式iii或iv化合物的另一個實施例，x是s。在式iii或iv化合物的另一個實施例中，r3是亞乙基。在式iii或iv化合物的另一個實施例中，r3是亞正丙基或亞異丙基。在式iii或iv化合物的另一個實施例中，r4和r5分別是甲基、乙基或異丙基。在式iii或iv化合物的另一個實施例中，l1和l2都由鍵組成。在式iii或iv化合物的另一個實施例中，l1和l2都由亞甲基組成。在式iii或iv化合物的另一個實施例中，r1和r2都由支鏈烷基組成。在式iii或iv化合物的另一個實施例中，r2由烷基組成。在式iii或iv化合物的另一個實施例中，r1和r2都由19或20個碳原子組成。在式iii或iv化合物的另一個實施例中，r1和r2都由13或14個碳原子組成。在式iii或iv化合物的另一個實施例中，l3由亞甲基組成，r3由亞乙基組成，x由s組成，并且r4和r5都由甲基組成。在式iii或iv化合物的另一個實施例中，其中l(wèi)3由鍵組成，r3由亞乙基組成，x由s組成，并且r4和r5都由甲基組成。在式iii或iv化合物的另一個實施例中，l3由鍵組成，r3由亞正丙基組成，x由s組成，并且r4和r5都由甲基組成。在式iii或iv化合物的另一個實施例中，l3由鍵組成，r3由亞異丙基組成，x由s組成，并且r4和r5都由甲基組成。在式iii或iv化合物的另一個實施例中，選自由如下式atx-b-1至atx-b-12化合物組成的群組。

還描述的是式v化合物

其中

r1由1-18個碳所組成的直鏈或支鏈烷基、2至12個碳所組成的烯基或炔基、或膽固醇基組成；

r2由1至18個碳所組成的直鏈或支鏈烷基或烯基組成；

l1由5至9個碳所組成的直鏈烷基組成，或當r1由膽固醇基組成時，那么l1由3至4個碳所組成的直鏈亞烷基或烯基組成；x1由-o-(co)-或-(co)-o-組成；

x2由s或o組成；

l2由鍵或具有1至6個碳的直鏈亞烷基組成；

r3由具有1至6個碳的直鏈或支鏈亞烷基組成；以及

r4和r5是相同或不同的，各自由具有1至6個碳的直鏈或支鏈烷基組成；

或其藥學(xué)上可接受的鹽

在式v化合物的一個實施例中，l2由鍵組成。在式v化合物的另一個實施例中，x2由s組成。在式v化合物的另一個實施例中，x1是-o-(co)-。在式v化合物的另一個實施例中，r3由亞乙基組成。在式v化合物的另一個實施例中，r3由亞正丙基或亞異丙基組成。在式v化合物的另一個實施例中，r4和r5各自由甲基、乙基或異丙基組成。在式v化合物的另一個實施例中，l2由亞甲基組成。在式v化合物的另一個實施例中，r1和r2各自由支鏈烷基組成。在式v化合物的另一個實施例中，r2由烷基組成。在式v化合物的另一個實施例中，r1和r2各自由19或20個碳原子組成。在式v化合物的另一個實施例中，r1或r2各自由13或14個碳原子組成。在式v化合物的另一個實施例中，l2由亞甲基組成，r3由亞乙基組成，x1由-o-(co)-組成，x2由s組成，并且r4和r5都由甲基組成。在式v化合物的另一個實施例中，l2由鍵組成，r3是亞乙基，x1由-o-(co)-組成，x2由s組成，并且r4和r5都由甲基組成。在式v化合物的另一個實施例中，l2由鍵組成，r3由亞正丙基組成，x1由-o-(co)-組成，x2由s組成，并且r4和r5都由甲基組成。在式v化合物的另一個實施例中，l2由鍵組成，r3由亞異丙基組成，x1由-o-(co)-組成，x2由s組成，并且r4和r5都由甲基組成。在式v化合物的另一個實施例中，化合物是選自式atx-a-1至atx-a-22的化合物

式i、ii、iii、iv和v化合物可為其藥學(xué)上可接受的鹽，在包含納米粒子的脂質(zhì)組合物或雙層脂質(zhì)分子中。脂質(zhì)雙層優(yōu)選地另外包含中性脂質(zhì)或聚合物。脂質(zhì)組合物優(yōu)選地包含液體介質(zhì)。所述組合物優(yōu)選地進一步囊封核酸。所述核酸優(yōu)選地具有通過利用rna干擾(rnai)抑止目標基因表達的活性。脂質(zhì)組合物優(yōu)選地另外包含核酸和中性脂質(zhì)或聚合物。脂質(zhì)組合物優(yōu)選地囊封核酸。

式i、ii、iii、iv和v化合物形成也在本發(fā)明范圍內(nèi)的鹽。除非另外指明，否則在本文中提及式i、ii、iii、iv或v化合物理解為包括提及其鹽。如本文所用的術(shù)語“鹽”表示用無機和/或有機酸形成的酸式鹽以及用無機和/或有機堿形成的堿式鹽。另外，式i、ii、iii、iv或v化合物的這類鹽可含有堿性部分，如(但不限于)吡啶或咪唑；或酸性部分，如(但不限于)羧酸；和兩性離子(“內(nèi)鹽”)。鹽可為藥學(xué)上可接受的(即，無毒性、生理學(xué)上可接受的)鹽，但是其它鹽也是有用的。式i、ii、iii、iv或v化合物的鹽可例如通過使式i、ii、iii、iv或v化合物與一定量(如等量)的酸或堿在介質(zhì)(如其中鹽沉淀的介質(zhì))中或在水性介質(zhì)中反應(yīng)，接著冷凍干燥來形成。

示例性酸加成鹽包括乙酸鹽、己二酸鹽、海藻酸鹽、抗壞血酸鹽、天冬氨酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、硫酸氫鹽、硼酸鹽、丁酸鹽、檸檬酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、環(huán)戊烷丙酸鹽、二葡糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙烷磺酸鹽、反丁烯二酸鹽、葡庚酸鹽、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基乙烷磺酸鹽、乳酸鹽、馬來酸鹽、甲烷磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、煙酸鹽、硝酸鹽、乙二酸鹽、果膠酸鹽、過硫酸鹽、3-苯丙酸鹽、磷酸鹽、苦味酸鹽、特戊酸鹽、丙酸鹽、水楊酸鹽、丁二酸鹽、硫酸鹽、磺酸鹽(如本文中所提及的那些)、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、甲苯磺酸鹽(toluenesulfonate/tosylate)十一烷酸鹽等等。此外，一般視為適用于由堿性醫(yī)藥化合物形成藥學(xué)上有用的鹽的酸例如由s.berge等人，藥物科學(xué)雜志(j.pharmaceuticalsciences)(1977)66(1)1-19；p.gould，國際藥劑學(xué)雜志(internationalj.pharmaceutics)(1986)33201-217；anderson等人，醫(yī)藥化學(xué)的實踐(thepracticeofmedicinalchemistry)(1996)，紐約學(xué)術(shù)出版社(academicpress，newyork)；以及橘皮書(在華盛頓食品藥品監(jiān)督管理局網(wǎng)站上)中論述。這些公開內(nèi)容以引用的方式并入本文中。

示例性堿式鹽包括銨鹽；堿金屬鹽，如鈉鹽、鋰鹽和鉀鹽；堿土金屬鹽，如鈣鹽和鎂鹽；具有有機堿(例如，有機胺)的鹽，如苯乍生(benzathine)、二環(huán)己基胺、哈胺(hydrabamine)(用n，n-雙(去氫松香基)乙二胺形成)、n-甲基-d-葡糖胺、n-甲基-d-葡糖酰胺、叔丁胺；和具有如精氨酸或賴氨酸等氨基酸的鹽。堿性含氮基團可用如低碳烷基鹵化物(例如，甲基、乙基、丙基以及丁基氯化物、溴化物和碘化物)、硫酸二烷基酯(例如，硫酸二甲基、二乙基、二丁基和二戊基酯)、長鏈鹵化物(例如，癸基、月桂基、肉豆蔻基和硬脂基氯化物、溴化物和碘化物)、芳基烷基鹵化物(例如，苯甲基和苯乙基溴化物)等試劑季銨化。

所有這類酸鹽和堿鹽預(yù)期是在公開內(nèi)容范圍內(nèi)的藥學(xué)上可接受的鹽，并且出于本公開內(nèi)容的目的，所有酸鹽和堿鹽被視為等效于相應(yīng)式i化合物的游離形式。

式i、ii、iii、iv和v化合物可以非溶劑化和溶劑化形式(包括水合形式)存在。一般來說，出于本公開內(nèi)容的目的，具有藥學(xué)上可接受的溶劑(如水、乙醇等等)的溶劑化形式等效于非溶劑化形式。

式i、ii、iii、iv和v化合物和其鹽、溶劑合物可以其互變異構(gòu)形式(例如，呈酰胺或亞氨醚形式)存在。所有這類互變異構(gòu)形式都作為本公開內(nèi)容的一部分涵蓋在本文中。

本公開內(nèi)容的化合物的多晶型物也在本公開內(nèi)容的范圍內(nèi)(即，式i化合物的多晶型物在本公開內(nèi)容的范圍內(nèi))。

本發(fā)明化合物(包括化合物的那些鹽、溶劑合物和前藥以及前藥的鹽和溶劑合物)的所有立體異構(gòu)體(例如，幾何異構(gòu)體、光學(xué)異構(gòu)體等等)，如可由于各種取代基上的不對稱碳而存在的那些立體異構(gòu)體，包括對映異構(gòu)形式(其可甚至在不存在不對稱碳的情況下存在)、旋轉(zhuǎn)異構(gòu)形式、阻轉(zhuǎn)異構(gòu)體和非對映異構(gòu)形式，涵蓋在本公開內(nèi)容的范圍內(nèi)。本公開內(nèi)容的化合物的個別立體異構(gòu)體可例如基本上不含其它異構(gòu)體，或可例如以外消旋體形式或與所有其它或其它所選立體異構(gòu)體混合。本文中化合物的手性中心可具有如由iupac1974建議所定義的s或r構(gòu)型。術(shù)語“鹽”、“溶劑合物”等等的使用預(yù)期同樣適用于所公開的化合物的對映異構(gòu)體、立體異構(gòu)體、旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體、互變異構(gòu)體、外消旋體或前藥的鹽和溶劑合物。

可用作化學(xué)治療劑(抗腫瘤劑)的化合物的類別包括：烷基化劑、抗代謝物、天然產(chǎn)品和其衍生物、激素和類固醇(包括合成類似物)以及合成物。下文給出這些類別內(nèi)的化合物的實例。

脂質(zhì)粒子

本說明書提供包含囊封在脂質(zhì)粒子內(nèi)的一種或多種治療性mrna分子的脂質(zhì)粒子。

在一些實施例中，mrna完全囊封在脂質(zhì)粒子的脂質(zhì)部分內(nèi)，以使得脂質(zhì)粒子中的mrna在水溶液中抗核酸酶降解。在其它實施例中，本文所描述的脂質(zhì)粒子對如人類等哺乳動物基本上無毒性。脂質(zhì)粒子的平均直徑通常為30nm至150nm、40nm至150nm、50nm至150nm、60nm至130nm、70nm至110nm或70至90nm。本發(fā)明的脂質(zhì)粒子的脂質(zhì)：rna比率(質(zhì)量/質(zhì)量比)還通常為1∶1至100∶1、1∶1至50∶1、2∶1至25∶1、3∶1至20∶1、5∶1至15∶1、或5∶1至10∶1、或10∶1至14∶1、或9∶1至20∶1。在一個實施例中，脂質(zhì)粒子的脂質(zhì)∶rna比率(質(zhì)量/質(zhì)量比)為12∶1。在另一個實施例中，脂質(zhì)粒子的脂質(zhì)∶mrna比率(質(zhì)量/質(zhì)量比)為13∶1。

在優(yōu)選實施例中，脂質(zhì)粒子包含mrna、陽離子脂質(zhì)(例如，本文所描述的一種或多種陽離子脂質(zhì)或其鹽)、磷脂和抑制粒子聚集的結(jié)合脂質(zhì)(例如，一種或多種peg-脂質(zhì)結(jié)合物)。脂質(zhì)粒子還可包括膽固醇。脂質(zhì)粒子可包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多表達一種或多種多肽的mrna。

在核酸-脂質(zhì)粒子中，mrna可完全囊封在粒子的脂質(zhì)部分內(nèi)，從而保護核酸不被核酸酶降解。在優(yōu)選實施例中，包含mrna的脂質(zhì)粒子完全囊封在粒子的脂質(zhì)部分內(nèi)，從而保護核酸不被核酸酶降解。在某些情況下，粒子在37℃下暴露于核酸酶至少20、30、45或60分鐘之后，脂質(zhì)粒子中的mrna基本上并未降解。在某些其它情況下，粒子在血清中在37℃下培育至少30、45或60分鐘或至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或36小時之后，脂質(zhì)粒子中的mrna基本上并未降解。在其它實施例中，mrna與粒子的脂質(zhì)部分復(fù)合。本發(fā)明配制品的一個益處是核酸-脂質(zhì)粒子組合物對如人類等哺乳動物基本上無毒性。

“完全囊封”意味著核酸-脂質(zhì)粒子中的核酸(例如，mrna)在暴露于將顯著降解游離rna的血清或核酸酶分析法之后并未顯著降解。當完全囊封時，粒子中優(yōu)選地小于25％的核酸在通常將降解100％游離核酸的處理中被降解，粒子中更優(yōu)選地小于10％并且最優(yōu)選地小于5％的核酸被降解。“完全囊封”還意味著核酸-脂質(zhì)粒子在活體內(nèi)投與后不會快速分解成其組成部分。

在核酸的情形下，完全囊封可通過進行不可透過膜的熒光染料排阻分析法來測定，所述分析法使用當與核酸締合時熒光增強的染料。囊封是通過添加染料至脂質(zhì)體配制品，測量所得熒光并且比較其與在添加少量非離子型清潔劑后所觀測到的螢光來測定。清潔劑介導(dǎo)的脂質(zhì)體雙層的破裂釋放所囊封的核酸，從而使其與不可透過膜的染料相互作用。核酸囊封可如下計算：e＝(i0-i)/i0，其中i和i0是指清潔劑添加前后的熒光強度。

在其它實施例中，本發(fā)明提供包含多個核酸-脂質(zhì)粒子的核酸-脂質(zhì)粒子組合物。

脂質(zhì)粒子包含完全囊封在粒子的脂質(zhì)部分內(nèi)的mrna，以使得30％至100％、40％至100％、50％至100％、60％至100％、70％至100％、80％至100％、90％至100％、30％至95％、40％至95％、50％至95％、60％至95％、70％至95％、80％至95％、85％至95％、90％至95％、30％至90％、40％至90％、50％至90％、60％至90％、70％至90％、80％至90％、或至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％(或其任何分數(shù)或其中的范圍)的粒子其中囊封有mrna。

視脂質(zhì)粒子的既定用途而定，可改變組分的比例并且可使用所屬領(lǐng)域中已知分析法測量特定配制品的遞送效率。

陽離子脂質(zhì)

本說明書包括某些陽離子脂質(zhì)化合物的合成。所述化合物特別適用于遞送聚核苷酸至細胞和組織，如后續(xù)部分所展現(xiàn)。本文所描述的脂質(zhì)大環(huán)化合物可用于其它目的以及例如受體和添加劑。

陽離子脂質(zhì)化合物的合成方法可使用所屬領(lǐng)域中的技能合成。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將發(fā)現(xiàn)其它方法以制造這些化合物以及制造本說明書的其它化合物。

陽離子脂質(zhì)化合物可與藥劑組合以形成微米粒子、納米粒子、脂質(zhì)體或膠束。有待通過粒子、脂質(zhì)體或膠束遞送的藥劑可呈氣體、液體或固體形式。并且藥劑可為聚核苷酸、蛋白質(zhì)、肽或小分子。脂質(zhì)大環(huán)化合物可與其它陽離子脂質(zhì)化合物、聚合物(合成或天然)、表面活性劑、膽固醇、碳水化合物、蛋白質(zhì)或脂質(zhì)組合以形成粒子。這些粒子可隨后任選地與醫(yī)藥賦形劑組合以形成醫(yī)藥組合物。

本說明書提供新穎的陽離子脂質(zhì)化合物和基于這類陽離子脂質(zhì)化合物的使用的藥物遞送系統(tǒng)。所述系統(tǒng)可用于醫(yī)藥/藥物遞送技術(shù)中以遞送聚核苷酸、蛋白質(zhì)、小分子、肽、抗原或藥物至患者、組織、器官或細胞。這些新穎化合物還可用作用于涂布、添加劑、賦形劑、材料或生物工程的材料。

本說明書的陽離子脂質(zhì)化合物提供藥物遞送技術(shù)中的數(shù)種不同用途。陽離子脂質(zhì)化合物的含胺部分可用于與聚核苷酸復(fù)合，從而增強聚核苷酸的遞送并且防止其降解。陽離子脂質(zhì)化合物還可用于形成含有有待遞送的藥劑的皮粒子、納米粒子、微米粒子、脂質(zhì)體和膠束。優(yōu)選地，陽離子脂質(zhì)化合物是生物相容和可生物降解的，并且所形成的粒子也是可生物降解和生物相容的并且可用于受控的持續(xù)釋放有待遞送的藥劑。鑒于這些陽離子脂質(zhì)化合物在較低ph下質(zhì)子化，這些陽離子脂質(zhì)化合物和其相應(yīng)粒子也響應(yīng)于ph變化。它們也可在藥劑遞送至細胞時充當質(zhì)子海綿以引起內(nèi)體溶解。

在某些實施例中，陽離子脂質(zhì)化合物是相對無細胞毒性的。陽離子脂質(zhì)化合物可為生物相容和可生物降解的。陽離子脂質(zhì)的pka可在大致5.5至大致7.5范圍內(nèi)，更優(yōu)選地在大致6.0與大致7.0之間。其可經(jīng)設(shè)計以使得所期望的pka在大致3.0與大致9.0之間，或在大致5.0與大致8.0之間。本文所描述的陽離子脂質(zhì)化合物出于以下若干原因而對藥物遞送特別具有吸引力：其含有氨基以便與dna、rna其它聚核苷酸和其它帶負電荷藥劑相互作用、緩沖ph、引起內(nèi)滲透、保護有待遞送的藥劑，其可由可商購的起始物質(zhì)合成；和/或其具有ph響應(yīng)性并且可經(jīng)工程改造以具有所期望的pka。

含有陽離子脂質(zhì)化合物的組合物可為30-70％陽離子脂質(zhì)化合物、0-60％膽固醇、0-30％磷脂和1-10％聚乙二醇(peg)。優(yōu)選地，所述組合物是30-40％陽離子脂質(zhì)化合物、40-50％膽固醇和10-20％peg。在其它優(yōu)選實施例中，所述組合物是50-75％陽離子脂質(zhì)化合物、20-40％膽固醇和5-10％磷脂和1-10％peg。所述組合物可含有60-70％陽離子脂質(zhì)化合物、25-35％膽固醇和5-10％peg。所述組合物可含有多達90％陽離子脂質(zhì)化合物和2-15％輔助脂質(zhì)。

配制品可為脂質(zhì)粒子配制品，例如含有8-30％化合物、5-30％輔助脂質(zhì)和0-20％膽固醇；4-25％陽離子脂質(zhì)、4-25％輔助脂質(zhì)、2-25％膽固醇、10-35％膽固醇-peg和5％膽固醇-胺；或2-30％陽離子脂質(zhì)、2-30％輔助脂質(zhì)、1-15％膽固醇、2-35％膽固醇-peg和1-20％膽固醇-胺；或多達90％陽離子脂質(zhì)和2-10％輔助脂質(zhì)；或甚至100％陽離子脂質(zhì)。

非陽離子脂質(zhì)

脂質(zhì)粒子中所用的非陽離子脂質(zhì)可為各種能夠制造穩(wěn)定復(fù)合物的中性不帶電脂質(zhì)、兩性離子脂質(zhì)或陰離子脂質(zhì)中的任一種。

非陽離子脂質(zhì)的非限制性實例包括磷脂，如卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、鞘磷脂、卵鞘磷脂(esm)、腦磷脂、心磷脂、磷脂酸、腦苷脂、二鯨蠟基磷酸酯、二硬脂?；字Ｄ憠A(dspc)、二油?；字Ｄ憠A(dopc)、二棕櫚?；字Ｄ憠A(dppc)、二油?；字８视?dopg)、二棕櫚?；字８视?dppg)、二油?；字Ｒ掖及?dope)、棕櫚酰油?；?磷脂酰膽堿(popc)、棕櫚酰油?；?磷脂酰乙醇胺(pope)、棕櫚酰油?；?磷脂酰甘油(popg)、二油?；字Ｒ掖及?-(n-馬來酰亞胺基甲基)-環(huán)己烷-1-甲酸酯(dope-mal)、二棕櫚?；?磷脂酰乙醇胺(dppe)、二肉豆蔻?；?磷脂酰乙醇胺(dmpe)、二硬脂?；?磷脂酰乙醇胺(dspe)、單甲基-磷脂酰乙醇胺、二甲基-磷脂酰乙醇胺、二反式油?；?磷脂酰乙醇胺(depe)、硬脂酰油酰基-磷脂酰乙醇胺(sope)、溶血磷脂酰膽堿、二亞油酰磷脂酰膽堿和其混合物。還可使用其它二?；字Ｄ憠A和二?；字Ｒ掖及妨字?。這些脂質(zhì)中的?；鶅?yōu)選地是來源于具有c10-c24碳鏈的脂肪酸的酰基，例如月桂?；?、肉豆蔻?；⒆貦磅；?、硬脂?；蛴王；?/p>

非陽離子脂質(zhì)的額外實例包括固醇，如膽固醇和其衍生物。膽固醇衍生物的非限制性實例包括極性類似物，如5α-膽甾烷醇、5α-糞甾醇、膽固醇基-(2′-羥基)-乙基醚、膽固醇基-(4′-羥基)-丁基醚和6-酮膽甾烷醇；非極性類似物，如5α-膽甾烷、膽甾烯酮、5α-膽甾烷酮、5α-膽甾烷酮和膽固醇基癸酸酯；和其混合物。在優(yōu)選實施例中，膽固醇衍生物是極性類似物，如膽固醇基-(4′-羥基)-丁基醚。

在一些實施例中，脂質(zhì)粒子中所存在的非陽離子脂質(zhì)包含一種或多種磷脂和膽固醇或其衍生物的混合物或由一種或多種磷脂和膽固醇或其衍生物的混合物組成。在其它實施例中，脂質(zhì)粒子中所存在的非陽離子脂質(zhì)包含一種或多種磷脂或由一種或多種磷脂組成，例如無膽固醇的脂質(zhì)粒子配制品。在又其它實施例中，脂質(zhì)粒子中所存在的非陽離子脂質(zhì)包含膽固醇或其衍生物或由膽固醇或其衍生物組成，例如無磷脂的脂質(zhì)粒子配制品。

非陽離子脂質(zhì)的其它實例包括不含磷的脂質(zhì)，如硬脂胺、十二烷胺、十六烷胺、乙酰基棕櫚酸酯、甘油蓖麻醇酸酯、硬脂酸十六烷酯、肉豆蔻酸異丙酯、兩性丙烯酸聚合物、月桂基硫酸三乙醇胺、烷基-芳基硫酸聚乙氧基化脂肪酸酰胺、雙十八烷基二甲基溴化銨、神經(jīng)酰胺和鞘磷脂。

在一些實施例中，非陽離子脂質(zhì)占粒子中所存在的總脂質(zhì)的10摩爾％至60摩爾％、20摩爾％至55摩爾％、20摩爾％至45摩爾％、20摩爾％至40摩爾％、25摩爾％至50摩爾％、25摩爾％至45摩爾％、30摩爾％至50摩爾％、30摩爾％至45摩爾％、30摩爾％至40摩爾％、35摩爾％至45摩爾％、37摩爾％至42摩爾％、或35摩爾％、36摩爾％、37摩爾％、38摩爾％、39摩爾％、40摩爾％、41摩爾％、42摩爾％、43摩爾％、44摩爾％或45摩爾％(或其任何分數(shù)或其中的范圍)。

在脂質(zhì)粒子含有磷脂和膽固醇或膽固醇衍生物的混合物的實施例中，混合物可占粒子中所存在的總脂質(zhì)的多達40摩爾％、45摩爾％、50摩爾％、55摩爾％或60摩爾％。

在一些實施例中，混合物中的磷脂組分可占粒子中所存在的總脂質(zhì)的2摩爾％至20摩爾％、2摩爾％至15摩爾％、2摩爾％至12摩爾％、4摩爾％至15摩爾％或4摩爾％至10摩爾％(或其任何分數(shù)或其中的范圍)。在某些優(yōu)選實施例中，混合物中的磷脂組分占粒子中所存在的總脂質(zhì)的5摩爾％至10摩爾％、5摩爾％至9摩爾％、5摩爾％至8摩爾％、6摩爾％至9摩爾％、6摩爾％至8摩爾％、或5摩爾％、6摩爾％、7摩爾％、8摩爾％、9摩爾％或10摩爾％(或其任何分數(shù)或其中的范圍)。

在其它實施例中，混合物中的膽固醇組分可占粒子中所存在的總脂質(zhì)的25摩爾％至45摩爾％、25摩爾％至40摩爾％、30摩爾％至45摩爾％、30摩爾％至40摩爾％、27摩爾％至37摩爾％、25摩爾％至30摩爾％或35摩爾％至40摩爾％(或其任何分數(shù)或其中的范圍)。在某些優(yōu)選實施例中，混合物中的膽固醇組分占粒子中所存在的總脂質(zhì)的25摩爾％至35摩爾％、27摩爾％至35摩爾％、29摩爾％至35摩爾％、30摩爾％至35摩爾％、30摩爾％至34摩爾％、31摩爾％至33摩爾％、或30摩爾％、31摩爾％、32摩爾％、33摩爾％、34摩爾％或35摩爾％(或其任何分數(shù)或其中的范圍)。

在脂質(zhì)粒子無磷脂的實施例中，膽固醇或其衍生物可占粒子中所存在的總脂質(zhì)的多達25摩爾％、30摩爾％、35摩爾％、40摩爾％、45摩爾％、50摩爾％、55摩爾％或60摩爾％。

在一些實施例中，無磷脂的脂質(zhì)粒子配制品中的膽固醇或其衍生物可占粒子中所存在的總脂質(zhì)的25摩爾％至45摩爾％、25摩爾％至40摩爾％、30摩爾％至45摩爾％、30摩爾％至40摩爾％、31摩爾％至39摩爾％、32摩爾％至38摩爾％、33摩爾％至37摩爾％、35摩爾％至45摩爾％、30摩爾％至35摩爾％、35摩爾％至40摩爾％、或30摩爾％、31摩爾％、32摩爾％、33摩爾％、34摩爾％、35摩爾％、36摩爾％、37摩爾％、38摩爾％、39摩爾％或40摩爾％(或其任何分數(shù)或其中的范圍)。

在其它實施例中，非陽離子脂質(zhì)占粒子中所存在的總脂質(zhì)的5摩爾％至90摩爾％、10摩爾％至85摩爾％、20摩爾％至80摩爾％、10摩爾％(例如，僅磷脂)或60摩爾％(例如，磷脂和膽固醇或其衍生物)(或其任何分數(shù)或其中的范圍)。

脂質(zhì)粒子中所存在的非陽離子脂質(zhì)的百分比是目標量，并且配制品中所存在的非陽離子脂質(zhì)的實際量可變化例如±5摩爾％。

脂質(zhì)結(jié)合物

除陽離子以外，本文所描述的脂質(zhì)粒子可另外包含脂質(zhì)結(jié)合物。結(jié)合脂質(zhì)是有用的，因為其防止粒子聚集。合適的結(jié)合脂質(zhì)包括(但不限于)peg-脂質(zhì)結(jié)合物、陽離子-聚合物-脂質(zhì)結(jié)合物和其混合物。

在一優(yōu)選實施例中，脂質(zhì)結(jié)合物是peg-脂質(zhì)。peg-脂質(zhì)的實例包括(但不限于)偶合到二烷氧基丙基的peg(peg-daa)、偶合到二?；视偷膒eg(peg-dag)、偶合到如磷脂酰乙醇胺等磷脂的peg(peg-pe)、結(jié)合到神經(jīng)酰胺的peg、結(jié)合到膽固醇或其衍生物的peg和其混合物。

peg是具有兩個末端羥基的亞乙基peg重復(fù)單元的水溶性線性聚合物。peg是通過其分子量分類；并且包括以下：單甲氧基聚乙二醇(mepeg-oh)、單甲氧基聚乙二醇-丁二酸酯(mepeg-s)、單甲氧基聚乙二醇-丁二酰亞胺基丁二酸酯(mepeg-s-nhs)、單甲氧基聚乙二醇-胺(mepeg-nh2)、單甲氧基聚乙二醇-三氟乙磺酸酯(mepeg-tres)、單甲氧基聚乙二醇-咪唑基-羰基(mepeg-im)以及含有末端羥基而非末端甲氧基的這類化合物(例如，ho-peg-s、ho-peg-s-nhs、ho-peg-nh2)。

本文所描述的peg-脂質(zhì)結(jié)合物的peg部分可包含范圍介于550道爾頓至10,000道爾頓的平均分子量。在某些情況下，peg部分的平均分子量為750道爾頓至5,000道爾頓(例如，1,000道爾頓至5,000道爾頓、1,500道爾頓至3,000、750道爾頓至3,000道爾頓、750道爾頓至2,000道爾頓)。在優(yōu)選實施例中，peg部分的平均分子量為2,000道爾頓或750道爾頓。

在某些情況下，peg可任選地經(jīng)烷基、烷氧基、?；蚍蓟〈?。peg可直接結(jié)合到脂質(zhì)或可經(jīng)由連接體部分連接到脂質(zhì)?？墒褂眠m用于將peg偶合到脂質(zhì)的任何連接體部分，包括例如不含酯的連接體部分和含有酯的連接體部分。在一優(yōu)選實施例中，連接體部分是不含酯的連接體部分。合適的不含酯的連接體部分包括(但不限于)酰胺基(-c(o)nh-)、氨基(-nr-)、羰基(-c(o)-)、氨基甲酸酯基(-nhc(o)o-)、脲(-nhc(o)nh-)、二硫化物(-s-s-)、醚(-o-)、丁二酰基(-(o)cch2ch2c(o)-)、丁二酰胺基(-nhc(o)ch2ch2c(o)nh-)、醚、二硫化物以及其組合(如含有氨基甲酸酯基連接體部分和酰胺基連接體部分的連接體)。在一優(yōu)選實施例中，使用氨基甲酸酯基連接體將peg偶合到脂質(zhì)。

在其它實施例中，使用含有酯的連接體部分將peg偶合到脂質(zhì)。合適的含有酯的連接體部分包括例如碳酸酯基(-oc(o)o-)、丁二?；?、磷酸酯(-o-(o)poh-o-)、磺酸酯和其組合。

具有各種不同鏈長度和飽和度的?；溁鶊F的磷脂酰乙醇胺可結(jié)合到peg以形成脂質(zhì)結(jié)合物。這類磷脂酰乙醇胺是可商購的，或可使用所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)分離或合成。含有碳鏈長度在c10至c20范圍內(nèi)的飽和或不飽和脂肪酸的磷脂酰乙醇胺是優(yōu)選的。還可使用具有單或二不飽和脂肪酸和飽和與不飽和脂肪酸的混合物的磷脂酰乙醇胺。合適的磷脂酰乙醇胺包括(但不限于)二肉豆蔻?；?磷脂酰乙醇胺(dmpe)、二棕櫚?；?磷脂酰乙醇胺(dppe)、二油?；?磷脂酰乙醇胺(dope)和二硬脂?；?磷脂酰乙醇胺(dspe)。

術(shù)語“二酰基甘油”或“dag”包括具有2個脂肪?；渞¹和r²的化合物，r¹和r²都獨立地具有通過酯鍵鍵結(jié)于甘油的1-和2-位置的2至30個碳。?；蔀轱柡偷幕蚓哂胁煌牟伙柡投取：线m的?；?但不限于)月桂酰基(c12)、肉豆蔻?；?c14)、棕櫚?；?c16)、硬脂?；?c18)和花生?；?c20)。在優(yōu)選實施例中，r¹和r²是相同的，即r¹和r²都是肉豆蔻?；?即，二肉豆蔻?；?，r¹和r²都是硬脂酰基(即，二硬脂酰基)。

術(shù)語“二烷氧基丙基”或“daa”包括具有2個烷基鏈r和r的化合物，r和r都獨立地具有2至30個碳。烷基可為飽和的或具有不同的不飽和度。

優(yōu)選地，peg-daa結(jié)合物是peg-二癸氧基丙基(c10)結(jié)合物、peg-二月桂基氧基丙基(c12)結(jié)合物、peg-二肉豆蔻氧基丙基(c14)結(jié)合物、peg-二棕櫚氧基丙基(c16)結(jié)合物或peg-二硬脂氧基丙基(c18)結(jié)合物。在這些實施例中，peg的平均分子量優(yōu)選地是750或2，000道爾頓。在特定實施例中，peg的末端羥基經(jīng)甲基取代。

除上述以外，可使用其它親水性聚合物代替peg?？捎糜诖鎝eg的合適聚合物的實例包括(但不限于)聚乙烯吡咯烷酮、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羥丙基甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺和聚二甲基丙烯酰胺、聚乳酸、聚乙醇酸和衍生纖維素，如羥甲基纖維素或羥乙基纖維素。

在一些實施例中，脂質(zhì)結(jié)合物(例如，peg-脂質(zhì))占粒子中所存在的總脂質(zhì)的0.1摩爾％至2摩爾％、0.5摩爾％至2摩爾％、1摩爾％至2摩爾％、0.6摩爾％至1.9摩爾％、0.7摩爾％至1.8摩爾％、0.8摩爾％至1.7摩爾％、0.9摩爾％至1.6摩爾％、0.9摩爾％至1.8摩爾％、1摩爾％至1.8摩爾％、1摩爾％至1.7摩爾％、1.2摩爾％至1.8摩爾％、1.2摩爾％至1.7摩爾％、1.3摩爾％至1.6摩爾％或1.4摩爾％至1.5摩爾％(或其任何分數(shù)或其中的范圍)。在其它實施例中，脂質(zhì)結(jié)合物(例如，peg-脂質(zhì))占粒子中所存在的總脂質(zhì)的0摩爾％至20摩爾％、0.5摩爾％至20摩爾％、2摩爾％至20摩爾％、1.5摩爾％至18摩爾％、2摩爾％至15摩爾％、4摩爾％至15摩爾％、2摩爾％至12摩爾％、5摩爾％至12摩爾％或2摩爾％(或其任何分數(shù)或其中的范圍)。

在其它實施例中，脂質(zhì)結(jié)合物(例如，peg-脂質(zhì))占粒子中所存在的總脂質(zhì)的4摩爾％至10摩爾％、5摩爾％至10摩爾％、5摩爾％至9摩爾％、5摩爾％至8摩爾％、6摩爾％至9摩爾％、6摩爾％至8摩爾％、或5摩爾％、6摩爾％、7摩爾％、8摩爾％、9摩爾％或10摩爾％(或其任何分數(shù)或其中的范圍)。

本發(fā)明的脂質(zhì)粒子中所存在的脂質(zhì)結(jié)合物(例如，peg-脂質(zhì))的百分比是目標量，并且配制品中所存在的脂質(zhì)結(jié)合物的實際量可變化例如±2摩爾％。所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員應(yīng)了解，脂質(zhì)結(jié)合物的濃度可根據(jù)所采用的脂質(zhì)結(jié)合物和脂質(zhì)粒子變得促融的速率而變化。

通過控制脂質(zhì)結(jié)合物的組成和濃度，有人可控制脂質(zhì)結(jié)合物從脂質(zhì)粒子交換出的速率并且，繼而可控制脂質(zhì)粒子變得促融的速率。另外，可使用其它變量改變和/或控制脂質(zhì)粒子變得促融的速率，包括例如ph、溫度或離子強度。在閱讀本公開內(nèi)容后，可用于控制脂質(zhì)粒子變得促融的速率的其它方法將變得對所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見。另外，通過控制脂質(zhì)結(jié)合物的組成和濃度，有人可控制脂質(zhì)粒度。

用于投與的組合物和配制品

本公開內(nèi)容的核酸-脂質(zhì)組合物可通過多種途徑投與，例如經(jīng)由靜脈內(nèi)、腸胃外、腹膜內(nèi)或局部途徑實現(xiàn)全身遞送。在一些實施例中，可在細胞內(nèi)，例如在如肺或肝臟等目標組織的細胞中或在發(fā)炎組織中遞送sirna。在一些實施例中，本公開內(nèi)容提供一種用于活體內(nèi)遞送sirna的方法?？蓪⒑怂?脂質(zhì)組合物靜脈內(nèi)、皮下或腹膜內(nèi)投與個體。在一些實施例中，本公開內(nèi)容提供活體內(nèi)遞送干擾rna至哺乳動物個體的肺的方法。

在一些實施例中，本公開內(nèi)容提供一種治療哺乳動物個體的疾病或病癥的方法。治療有效量的本公開內(nèi)容的含有核、陽離子脂質(zhì)、兩親分子、磷脂、膽固醇和peg連接的膽固醇的組合物可投與患有與可通過所述組合物減少、降低、下調(diào)或沉默的基因的表達或過度表達相關(guān)聯(lián)的疾病或病癥的個體。

可通過多種粘膜投與模式，包括通過經(jīng)口、經(jīng)直腸、經(jīng)陰道、鼻內(nèi)、肺內(nèi)或透皮或經(jīng)皮遞送，或通過局部遞送至眼、耳、皮膚或其它粘膜表面而向個體投與本公開內(nèi)容的組合物和方法。在本公開內(nèi)容的一些方面中，粘膜組織層包括上皮細胞層。上皮細胞可為肺部、氣管、支氣管、肺泡、鼻、口腔、表皮或胃腸道上皮細胞。本公開內(nèi)容的組合物可使用常規(guī)致動器(如機械噴霧裝置)以及加壓、電激活或其它類型的致動器投與。

本公開內(nèi)容的組合物可在水溶液中以經(jīng)鼻或肺部噴霧形式投與，并且可通過所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的各種方法以噴霧形式分配。本公開內(nèi)容的組合物的肺部遞送是通過投與可例如經(jīng)氣溶膠化、霧化或噴霧而呈滴劑、粒子或噴霧形式的組合物來實現(xiàn)。組合物的粒子、噴霧或氣溶膠可呈液體或固體形式。優(yōu)選的用于以經(jīng)鼻噴霧形式分配液體的系統(tǒng)公開在美國專利第4,511,069號中。這類配制品可便利地通過將根據(jù)本公開內(nèi)容的組合物溶解于水中以制造水溶液并且使得所述溶液無菌而制備。配制品可存在于多劑量容器中，例如在美國專利第4,511,069號中所公開的密封分配系統(tǒng)中。其它合適的經(jīng)鼻噴霧遞送系統(tǒng)已描述于透皮全身性藥物(transdermalsystemicmedication)，y.w.chien編，紐約愛思唯爾出版社(elsevierpublishers，newyork)，1985；和美國專利第4,778,810號中。額外氣溶膠遞送形式可包括例如壓縮空氣、噴射、超聲和壓電噴霧器，其遞送溶解或懸浮于醫(yī)藥溶劑(例如水、乙醇或其混合物)中的生物活性劑。

本公開內(nèi)容的經(jīng)鼻和經(jīng)肺噴霧溶液通常包含藥物或有待遞送的藥物，其任選地用表面活性劑，如非離子型表面活性劑(例如聚山梨醇酯-80)和一種或多種緩沖液配制。在本公開內(nèi)容的一些實施例中，經(jīng)鼻噴霧溶液另外包含推進劑。經(jīng)鼻噴霧溶液的ph可為ph6.8至7.2。所采用的醫(yī)藥溶劑也可為ph4-6的微酸性水性緩沖液?？商砑悠渌M分以增強或維持化學(xué)穩(wěn)定性，包括防腐劑、表面活性劑、分散劑或氣體。

在一些實施例中，本公開內(nèi)容是一種醫(yī)藥產(chǎn)品，其包括含有本公開內(nèi)容的組合物的溶液和用于肺部、粘膜或鼻內(nèi)噴霧或氣溶膠的致動器。

本公開內(nèi)容的組合物的劑型可為液體，呈滴劑或乳液形式或呈氣溶膠形式。

本公開內(nèi)容的組合物的劑型可為固體，其可在投與之前在液體中復(fù)原。固體可以粉末形式投與。固體可呈膠囊、片劑或凝膠形式。

為了配制在本公開內(nèi)容內(nèi)用于經(jīng)肺遞送的組合物，可將生物活性劑與多種藥學(xué)上可接受的添加劑以及用于分散活性劑的基質(zhì)或載劑組合。添加劑的實例包括ph控制劑，如精氨酸、氫氧化鈉、甘氨酸、鹽酸、檸檬酸和其混合物。其它添加劑包括局部麻醉劑(例如，苯甲醇)、等張劑(例如，氯化鈉、甘露醇、山梨醇)、吸附抑制劑(例如吐溫80)、溶解度增強劑(例如，環(huán)糊精和其衍生物)、穩(wěn)定劑(例如，血清白蛋白)和還原劑(例如，谷胱甘肽)。當用于粘膜遞送的組合物是液體時，如參照視為單位的0.9％(w/v)生理鹽水溶液的張力所測量，配制品的張力通常調(diào)節(jié)至在投與位點處將基本上不誘發(fā)粘膜的不可逆組織損傷的值。一般來說，溶液的張力調(diào)節(jié)至1/3至3、更通常1/2至2并且最通常3/4至1.7的值。

生物活性劑可分散于基質(zhì)或媒劑中，所述基質(zhì)或媒劑可包含具有分散活性劑和任何所需添加劑的能力的親水性化合物?；|(zhì)可選自廣泛范圍的合適載劑，其包括(但不限于)聚羧酸或其鹽、羧酸酐(例如，順丁烯二酸酐)與其它單體(例如，(甲基)丙烯酸甲酯、丙烯酸等)的共聚物；親水性乙烯聚合物，如聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮；纖維素衍生物，如羥甲基纖維素、羥丙基纖維素等；和天然聚合物，如殼聚糖、膠原蛋白、海藻酸鈉、明膠、透明質(zhì)酸和其無毒性金屬鹽。通常，選擇可生物降解的聚合物作為基質(zhì)或載劑，例如聚乳酸、聚(乳酸-乙醇酸)共聚物、聚羥基丁酸、聚(羥基丁酸-乙醇酸)共聚物和其混合物?；蛘呋蛄硗猓墒褂煤铣芍舅狨プ鳛檩d劑，如聚甘油脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯等。親水性聚合物和其它載劑可單獨或組合使用，并且可通過部分結(jié)晶、離子鍵結(jié)、交聯(lián)等等賦予載劑增強的結(jié)構(gòu)完整性。載劑可以各種形式提供，包括流體或粘稠溶液、凝膠、糊劑、粉末、微球體和膜，以便直接施用于鼻粘膜。在此情形中使用所選載劑可促進生物活性劑的吸收。

用于粘膜、經(jīng)鼻或經(jīng)肺遞送的配制品可含有親水性低分子量化合物作為基質(zhì)或賦形劑。這類親水性低分子量化合物提供通過介質(zhì)，經(jīng)由其如生理學(xué)活性肽或蛋白質(zhì)等水溶性活性劑可擴散穿過基質(zhì)到活性劑所吸附的體表。親水性低分子量化合物任選地從粘膜或投與氣氛吸收水分并且溶解水溶性活性肽。親水性低分子量化合物的分子量一般不超過10,000并且優(yōu)選地不超過3,000。親水性低分子量化合物的實例包括多元醇化合物，如寡糖、二糖和單糖，包括蔗糖、甘露醇、乳糖、l-阿拉伯糖、d-赤蘚糖、d-核糖、d-木糖、d-甘露糖、d-半乳糖、乳果糖、纖維二糖、龍膽二糖、甘油、聚乙二醇和其混合物。親水性低分子量化合物的其它實例包括n-甲基吡咯烷酮、醇(例如，寡聚乙烯醇、乙醇、乙二醇、丙二醇等)和其混合物。

本公開內(nèi)容的組合物或者可視需要含有藥學(xué)上可接受的載劑物質(zhì)以近似生理條件，如ph調(diào)節(jié)和緩沖劑、張力調(diào)節(jié)劑和濕潤劑，例如乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、脫水山梨糖醇單月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯和其混合物。對于固體組合物，可使用常規(guī)無毒的藥學(xué)上可接受的載劑，其包括例如藥物級甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖、碳酸鎂等等。

在本公開內(nèi)容的某些實施例中，生物活性劑可在延時釋放配制品中，例如在包括緩慢釋放聚合物的組合物中投與?；钚詣┛膳c將避免快速釋放的載劑一起制備，例如控制釋放媒劑，如聚合物、微囊封遞送系統(tǒng)或生物粘附性凝膠。本公開內(nèi)容的各種組合物中活性劑的延長遞送可通過在組合物中包括延遲吸收劑(例如，單硬脂酸鋁水凝膠和明膠)而實現(xiàn)。

雖然已關(guān)于某些實施例描述本公開內(nèi)容并且已出于說明的目的闡述許多詳情，但是本公開內(nèi)容包括額外實施例并且本文所描述的一些詳情可在不脫離本公開內(nèi)容的情況下顯著改變將對所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見。本公開內(nèi)容包括這類額外實施例、修改和等效物。具體來說，本公開內(nèi)容包括各種說明性組分和實例的特征、術(shù)語或要素的任何組合。

實例

實例1.

示例性式i化合物提供于表1中。

表1

表1示出了每種化合物的名稱和結(jié)構(gòu)、其分子量、其pka和其在下文實例19中所述的分析法中的敲低生物活性(kd)。

示例性式ii和iii化合物提供于表2和3中。

表2

表3

示例性式v化合物提供于表4中。

表4

表1示出了每種化合物的名稱和結(jié)構(gòu)、其分子量、其pka和其在下文實例19中所述的分析法中的敲低生物活性(kd)。

實例2.8-溴辛酸甲酯的合成

在n2氣氛下，將8-溴辛酸溶解于無水甲醇中。逐滴添加濃h2so4并且回流攪拌反應(yīng)混合物三小時。

通過薄層色譜監(jiān)測反應(yīng)，直到完成為止。在真空下完全去除溶劑。將反應(yīng)混合物用乙酸乙酯稀釋并且用水洗滌。用乙酸乙酯再萃取水層。用飽和nahco3溶液洗滌總有機層。有機層再用水洗滌并最后用鹽水洗滌。產(chǎn)物經(jīng)無水na2so4干燥并濃縮。

實例3.8，8′-(苯二基)二辛酸二甲酯的合成

獲取無水k2co3并且在n2下添加至無水二甲基甲酰胺中。緩慢添加含苯甲胺的二甲基甲酰胺。隨后在室溫下添加溶解于二甲基甲酰胺中的8-溴辛酸甲酯。將反應(yīng)混合物加熱至80℃并在攪拌下維持反應(yīng)36小時。

通過薄層色譜監(jiān)測反應(yīng)，直到完成為止。將反應(yīng)產(chǎn)物冷卻到室溫并且添加水。用乙酸乙酯萃取化合物。用乙酸乙酯再萃取水層。總有機層用水洗滌并最后用鹽水溶液洗滌。產(chǎn)物經(jīng)無水na2so4干燥并濃縮。

通過硅膠柱色譜在3％甲醇/氯仿中純化反應(yīng)產(chǎn)物，回收44g純產(chǎn)物。

使用10％甲醇/氯仿的tlc系統(tǒng)，通過在茚三酮中炭化觀測產(chǎn)物以rf：0.8遷移?？偖a(chǎn)率為82％?；衔餅闇\棕色液體。通過¹h-nmr確認結(jié)構(gòu)。

實例4.8，8′-氮烷二基二辛酸二甲酯的合成

將8，8′-(苯二基)二辛酸二甲酯轉(zhuǎn)移至氫化玻璃容器，并添加乙醇，接著添加10％pd/c。將反應(yīng)混合物在帕爾振蕩器設(shè)備中在50磅/平方英寸[psi]h2氣氛壓力下在室溫下振蕩兩小時。

反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)由硅藻土過濾并且用熱乙酸乙酯洗滌。真空濃縮濾液。

實例5.8，8′-((叔丁氧基羰基)氮烷二基)二辛酸二甲酯的合成

將8，8′-氮烷二基二辛酸二甲酯轉(zhuǎn)移至dcm，將et3n添加至反應(yīng)物質(zhì)并冷卻至0℃。將稀釋于dcm中的boc酸酐滴加至以上反應(yīng)物。在添加完成之后，在室溫下攪拌反應(yīng)混合物三小時。

用水淬滅反應(yīng)物并分離dcm層。用dcm再萃取水相，合并的dcm層用鹽水溶液洗滌并用na2so4干燥。在濃縮之后，收集40g粗化合物。

通過柱色譜使用0-12％乙酸乙酯/己烷純化粗反應(yīng)產(chǎn)物?；厥债a(chǎn)率為48％。在用茚三酮炭化的情況下，單一產(chǎn)物通過薄層色譜在20％乙酸乙酯/己烷中以0.5的rf遷移。

實例6.8，8′-((叔丁氧羰基)氮烷二基)二辛酸的合成

將8，8′-((叔丁氧羰基)氮烷二基)二辛酸二甲酯轉(zhuǎn)移至thf。在室溫下添加6n氫氧化鈉溶液。在室溫下在攪拌下維持反應(yīng)過夜。

在25℃下真空蒸發(fā)反應(yīng)物質(zhì)以去除thf。用5nhcl酸化反應(yīng)產(chǎn)物。將乙酸乙酯添加至水層中。用水洗滌分離的有機層并用乙酸乙酯再萃取水層。合并的有機層用鹽水溶液洗滌并經(jīng)無水na2so4干燥。溶液濃縮得到18g粗物質(zhì)。

實例7.8，8′((叔丁氧羰基)氮烷二基)二辛酸二((z)-壬-2-烯-1-基)酯的合成

將8，8′-((叔丁氧羰基)氮烷二基)二辛酸溶解于無水dcm中。將hatu添加至此溶液中。在室溫下將二異丙基乙胺緩慢添加至反應(yīng)混合物。內(nèi)部溫度升高至40℃并且形成淺黃色溶液。將dmap添加至反應(yīng)混合物中，接著添加含順式-2-壬烯-1-醇溶液的無水dcm。反應(yīng)物變成棕色。在室溫下攪拌反應(yīng)物五小時。

通過薄層色譜檢查反應(yīng)完全。將水添加至反應(yīng)產(chǎn)物中，用dcm萃取。dcm層用水洗滌，接著用鹽水溶液洗滌。有機層經(jīng)無水na2so4干燥并濃縮，獲得35g粗化合物。

實例8.atx-001的合成

將8，8′((叔丁氧羰基)氮烷二基)二辛酸二((z)-壬-2-烯-1-基)酯(0.023mol，15g)溶解于無水二氯甲烷(dcm)(200ml)中。在0℃下添加三氟乙酸(tfa)以引發(fā)反應(yīng)。在攪拌下，使反應(yīng)溫度緩慢升溫至室溫持續(xù)30分鐘。薄層色譜顯示反應(yīng)完成。在40℃下真空濃縮反應(yīng)產(chǎn)物，粗殘余物用dcm稀釋并用10％nahco3溶液洗滌。用dcm再萃取水層，合并的有機層用鹽水溶液洗滌，經(jīng)na2so4干燥并濃縮。在氮氣下，將收集的粗產(chǎn)物(12g)溶解于無水dcm(85ml)中。添加三光氣，將反應(yīng)混合物冷卻至0℃并逐滴添加et3n。在室溫下攪拌反應(yīng)混合物過夜。薄層色譜顯示反應(yīng)完成。通過在n2下蒸餾從反應(yīng)物質(zhì)去除dcm溶劑。將反應(yīng)產(chǎn)物冷卻至0℃，用dcm(50ml)、2-((2-(二甲基氨基)乙基)硫基)乙酸(0.039mol，6.4g)和碳化二亞胺(edc·hci)(0.054mol，10.4g)稀釋。隨后在室溫下攪拌反應(yīng)混合物過夜。薄層色譜顯示反應(yīng)完成。用0.3mhcl溶液(75ml)稀釋反應(yīng)產(chǎn)物，并分離有機層。用dcm再萃取水層，合并的有機層用10％k2co3水溶液(75ml)洗滌并經(jīng)無水na2so4干燥。濃縮溶劑得到10g粗物質(zhì)。通過硅膠柱(100-200目)使用3％meoh/dcm純化粗化合物。產(chǎn)量為10.5g(68％)。

實例9.atx-002的合成

將8，8′((叔丁氧羰基)氮烷二基)二辛酸二((z)-壬-2-烯-1-基)酯(13.85mmol，9g)溶解于無水dcm(150ml)中。在0℃下添加tfa以引發(fā)反應(yīng)。在攪拌下，使反應(yīng)溫度緩慢升溫至室溫持續(xù)30分鐘。薄層色譜顯示反應(yīng)完成。在40℃下真空濃縮反應(yīng)產(chǎn)物，粗殘余物用dcm稀釋并用10％nahco3溶液洗滌。用dcm再萃取水層，合并的有機層用鹽水溶液洗滌，經(jīng)na2so4干燥并濃縮。在氮氣下，將收集的粗產(chǎn)物溶解于無水dcm(85ml)中。添加三光氣，將反應(yīng)混合物冷卻至0℃并逐滴添加et3n。在室溫下攪拌反應(yīng)混合物過夜。薄層色譜顯示反應(yīng)完成。通過在n2下蒸餾從反應(yīng)物質(zhì)去除dcm溶劑。將反應(yīng)產(chǎn)物冷卻至0℃，用dcm(50ml)稀釋并添加2-(二甲氨基)乙硫醇hcl(0.063mol，8.3g)，接著添加et3n(無水)。隨后在室溫下攪拌反應(yīng)混合物過夜。薄層色譜顯示反應(yīng)完成。用0.3mhcl溶液(75ml)稀釋反應(yīng)產(chǎn)物，并分離有機層。用dcm再萃取水層，合并的有機層用10％k2co3水溶液(75ml)洗滌并經(jīng)無水na2so4干燥。濃縮溶劑得到10g粗物質(zhì)。通過硅膠柱(100-200目)使用3％meoh/dcm純化粗化合物。產(chǎn)量為3.1g。

實例10.atx-003的合成

將8，8′((叔丁氧羰基)氮烷二基)二辛酸二((z)-壬-2-烯-1-基)酯(0.00337mol，2.2g)溶解于無水dcm(20ml)中。在0℃下添加tfa以引發(fā)反應(yīng)。在攪拌下，使反應(yīng)溫度緩慢升溫至室溫持續(xù)30分鐘。薄層色譜顯示反應(yīng)完成。在40℃下真空濃縮反應(yīng)產(chǎn)物，粗殘余物用dcm稀釋并用10％nahco3溶液洗滌。用dcm再萃取水層，合并的有機層用鹽水溶液洗滌，經(jīng)na2so4干燥并減壓濃縮。在氮氣下，將收集的粗產(chǎn)物溶解于無水dcm(10ml)中。添加三光氣(0.0182mol，5.4g)，將反應(yīng)混合物冷卻至0℃并逐滴添加et3n。在室溫下攪拌反應(yīng)混合物過夜。薄層色譜顯示反應(yīng)完成。通過在n2下蒸餾從反應(yīng)物質(zhì)去除dcm溶劑。將反應(yīng)產(chǎn)物冷卻至0℃，用dcm(15ml)稀釋并添加2-(二甲氨基)丙硫醇hc1(0.0182mol，2.82g)，接著添加et3n(無水)。隨后在室溫下攪拌反應(yīng)混合物過夜。薄層色譜顯示反應(yīng)完成。用0.3mhcl水溶液(20ml)稀釋反應(yīng)產(chǎn)物，并分離有機層。用dcm再萃取水層，合并的有機層用10％k2co3水溶液(50ml)洗滌并經(jīng)無水na2so4干燥。濃縮溶劑得到5g粗物質(zhì)。通過硅膠柱(100-200目)使用3％meoh/dcm純化粗化合物。產(chǎn)量為0.9g。

實例11.atx-004的合成

將8，8′((叔丁氧羰基)氮烷二基)二辛酸二((z)-壬-2-烯-1-基)酯(0.023mol，15g)溶解于dcm(200ml)中。在0℃下添加tfa以引發(fā)反應(yīng)。在攪拌下，使反應(yīng)溫度緩慢升溫至室溫持續(xù)30分鐘。薄層色譜顯示反應(yīng)完成。在40℃下真空濃縮反應(yīng)產(chǎn)物，粗殘余物用dcm稀釋并用10％nahco3溶液洗滌。用dcm再萃取水層，合并的有機層用鹽水溶液洗滌，經(jīng)na2so4干燥并濃縮。在氮氣下，將收集的粗產(chǎn)物8，8′-氮烷二基二辛酸二((z)-壬-2-烯-1-基)酯(5.853mmol，3.2g)溶解于無水二甲基甲酰胺(dmf)中，并添加2-((3-(二甲氨基)丙基)硫基)乙酸(10.48mmol，1.85g)和edc·hcl(14.56mmol，2.78g)。在室溫下攪拌反應(yīng)混合物過夜。將反應(yīng)物用水(30ml)淬滅并用dcm(30ml)稀釋，并且分離有機層。用dcm再萃取水層，合并的有機層用10％k2co3水溶液洗滌并經(jīng)無水na2so4干燥。通過硅膠柱(100-200目)使用3％meoh/dcm純化粗化合物。產(chǎn)量為1g(24.2％)。

實例12.atx-005的合成

將8，8′((叔丁氧羰基)氮烷二基)二辛酸二((z)-壬-2-烯-1-基)酯(0.023mol，15g)溶解于無水dcm(200ml)中。在0℃下添加tfa以引發(fā)反應(yīng)。在攪拌下，使反應(yīng)溫度緩慢升溫至室溫持續(xù)30分鐘。薄層色譜顯示反應(yīng)完成。在40℃下真空濃縮反應(yīng)產(chǎn)物，粗殘余物用dcm稀釋并用10％nahco3溶液洗滌。用dcm再萃取水層，合并的有機層用鹽水溶液洗滌，經(jīng)na2so4干燥并濃縮。在氮氣下，將粗反應(yīng)產(chǎn)物8，8′-氮烷二基二辛酸二((z)-壬-2-烯-1-基)酯(5.853mmol，3.2g)溶解于二甲基甲酰胺(dmf)中。添加2-((3-(二甲氨基)丙基)硫基)乙酸(10.48mmol，1.85g)和edc·hcl(14.56mmol，2.78g)并在室溫下攪拌反應(yīng)混合物過夜。薄層色譜顯示反應(yīng)完成。將反應(yīng)產(chǎn)物用水(30ml)淬滅并用dcm(30ml)稀釋。用dcm再萃取水層，合并的有機層用10％k2co3水溶液(75ml)洗滌并經(jīng)無水na2so4干燥。濃縮溶劑得到5g粗物質(zhì)。通過硅膠柱(100-200目)使用3％meoh/dcm純化粗化合物。產(chǎn)量為1g(24.2％)。

實例13.atx-006的合成

將8，8′((叔丁氧羰基)氮烷二基)二辛酸二((z)-壬-2-烯-1-基)酯溶解于無水dcm(150ml)中。在0℃下添加tfa以引發(fā)反應(yīng)。在攪拌下，使反應(yīng)溫度緩慢升溫至室溫持續(xù)30分鐘。薄層色譜顯示反應(yīng)完成。在40℃下真空濃縮反應(yīng)產(chǎn)物，粗殘余物用dcm稀釋并用10％nahco3溶液洗滌。用dcm再萃取水層，合并的有機層用鹽水溶液洗滌，經(jīng)na2so4干燥并濃縮。在氮氣下，將收集的粗產(chǎn)物溶解于無水dcm(85ml)中。添加三光氣，將反應(yīng)混合物冷卻至0℃并逐滴添加et3n。在室溫下攪拌反應(yīng)混合物過夜。薄層色譜顯示反應(yīng)完成。在氮氣氣氛下將粗反應(yīng)產(chǎn)物溶解于無水dmf中，并添加2-((2-(二乙氨基)乙基)硫基)乙酸(3.93mmol，751mg)和edc·hci(5.45mmol，1.0g)。在室溫下攪拌反應(yīng)混合物過夜。用水(3ml)淬滅反應(yīng)并在25℃下真空去除過量dmf。用水稀釋反應(yīng)產(chǎn)物并用dcm(20ml)萃取水層三次。合并的有機層用鹽水溶液洗滌并經(jīng)無水na2so4干燥。濃縮溶劑得到2g粗物質(zhì)。在通過硅膠柱(100-200目)使用3％meoh/dcm純化之后，產(chǎn)量為1.2g(76％)。

實例14.atx-009的合成

將8，8′((叔丁氧羰基)氮烷二基)二辛酸二((z)-壬-2-烯-1-基)酯(13.85mmol，9g)溶解于無水dcm(20ml)中。在0℃下添加tfa以引發(fā)反應(yīng)。在攪拌下，使反應(yīng)溫度緩慢升溫至室溫持續(xù)30分鐘。薄層色譜顯示反應(yīng)完成。在40℃下真空濃縮反應(yīng)產(chǎn)物，粗殘余物用dcm稀釋并用10％nahco3溶液洗滌。用dcm再萃取水層，合并的有機層用鹽水溶液洗滌，經(jīng)na2so4干燥并濃縮。在氮氣氣氛下，將8，8′-氮烷二基二辛酸二((z)-壬-2-烯-1-基)酯(0.909mmol，500mg)溶解于無水dcm(20ml)中。添加三光氣，將反應(yīng)混合物冷卻至0℃并逐滴添加et3n。在室溫下攪拌反應(yīng)混合物過夜。薄層色譜顯示反應(yīng)完成。通過在氮氣氣氛下蒸餾從反應(yīng)物質(zhì)去除dcm溶劑。將2-(乙基(甲基)氨基)乙-1-硫醇鹽酸鹽(4.575mmol，715mg)溶解于dmf(7ml)中，并在0℃下將四氫呋喃(thf)(5ml)逐滴添加至含氫化鈉懸浮液的thf中。隨后在室溫下攪拌反應(yīng)混合物過夜。薄層色譜顯示反應(yīng)完成。用乙酸乙酯和冷水稀釋反應(yīng)產(chǎn)物。用5％hcl(9ml)中和反應(yīng)物并分離有機層。用乙酸乙酯(etoac)(20ml)再萃取水層，在冷水和鹽水中洗滌，將合并的有機層洗滌并經(jīng)無水na2so4干燥。濃縮溶劑得到1g粗產(chǎn)物。通過硅膠柱(100-200目)使用3％meoh/dcm純化化合物，得到100mg。

實例15.atx-010的合成

將8，8′((叔丁氧羰基)氮烷二基)二辛酸二((z)-壬-2-烯-1-基)酯(3.079mmol，2g)溶解于無水dcm(20ml)中。在0℃下添加tfa以引發(fā)反應(yīng)。在攪拌下，使反應(yīng)溫度緩慢升溫至室溫持續(xù)30分鐘。薄層色譜顯示反應(yīng)完成。在40℃下真空濃縮反應(yīng)產(chǎn)物，粗殘余物用dcm稀釋并用10％nahco3溶液洗滌。用dcm再萃取水層，合并的有機層用鹽水溶液洗滌，經(jīng)na2so4干燥并濃縮。在氮氣下，將收集的粗產(chǎn)物溶解于無水dcm(20ml)中。添加三光氣(14.55mmol，4.32g)，將反應(yīng)混合物冷卻至0℃并逐滴添加et3n。在室溫下攪拌反應(yīng)混合物過夜。薄層色譜顯示反應(yīng)完成。通過在n2下蒸餾從反應(yīng)物質(zhì)去除dcm溶劑。將反應(yīng)產(chǎn)物冷卻至0℃，用dcm(20ml)稀釋并添加2-(二甲氨基)乙硫醇hcl(0.063mol，8.3g)，接著添加et3n(無水)。隨后在室溫下攪拌反應(yīng)混合物過夜。薄層色譜顯示反應(yīng)完成。用0.3mhcl溶液(20ml)稀釋反應(yīng)產(chǎn)物，并分離有機層。用dcm再萃取水層，合并的有機層用10％k2co3水溶液(20ml)洗滌并經(jīng)無水na2so4干燥。濃縮溶劑得到10g粗物質(zhì)。通過硅膠柱(100-200目)使用3％meoh/dcm純化粗化合物。產(chǎn)量為1.4g(75％)。

實例16.atx-a-4(下文稱為atx-031)的合成

實例17.來自表1的atx-011至atx-017、atx-021至atx-023和atx-026至atx-030以及表2、3和4的化合物的合成

atx-011至atx-017、atx-021至atx-023和atx-026至atx-030、atx-a-1至atx-a-22以及表2、3和4的化合物的合成按照實例1-15的合成，取代其中所描述的合成反應(yīng)的適當起始成分。

實例18.活體內(nèi)小鼠因子vii沉默

使用肝臟定向的脂質(zhì)體文庫的活體內(nèi)篩選，測試促成肝細胞(所述細胞構(gòu)成肝實質(zhì))中高水平sirna介導(dǎo)的基因沉默的一系列化合物。因子vii(一種凝血因子)是適用于分析功能性sirna遞送至肝臟的目標基因。因為這種因子是在肝細胞中特定產(chǎn)生，所以基因沉默指示成功遞送至實質(zhì)，與遞送至網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的細胞(例如庫普弗細胞(kupffercell))相反。此外，因子vii是可易于在血清中測量的分泌性蛋白，從而無需對動物進行安樂死。在mrna水平下的沉默可易于通過測量蛋白質(zhì)水平來測定。這是因為蛋白質(zhì)的半衰期短(2-5小時)。c57bl/6小鼠(查爾斯河實驗室(charlesriverlabs))經(jīng)由尾靜脈注射接受0.006ml/g體積生理鹽水或含sirna的脂質(zhì)體配制品。在投與之后48小時，動物通過吸入異氟醚麻醉并通過眶后放血而將血液采集至血清分離管中。根據(jù)制造商的方案，使用生色分析法(biophenfvii，安尼亞拉公司(aniaracorporation))測定樣品中因子vii蛋白的血清水平。使用從生理鹽水處理的動物采集的血清生成標準曲線。

針對因子vii的具有sirna的組合物是用atx-001、atx-002、atx-003和atx-547以及比較樣品nc1和mc3(alnylam)配制。將這些以0.3mg/kg和1mg/kg注射至動物中。在向c57bl6小鼠投與sirna配制品之后，測量由mc3(0.3mg/kg)、nc1(0.3mg/kg)、atx-547(0.3mg/kg)、atx-001(0.3和1.0mg/kg)、atx-002(0.3和1.0mg/kg)和atx-003(0.3和1.0mg/kg)囊封的sirna敲低小鼠血漿中的因子vii的能力。結(jié)果顯示atx-001和atx-002與對照物相比在0.3mg/kg下最有效(圖1和2)。

在向c57bl6小鼠投與sirna配制品之后，測量由mc3(0.3和1.5mg/kg)、nc1(0.3mg/kg)、atx-547(0.1和0.3mg/kg)、atx-004(0.3)、atx-006(0.3和1.0mg/kg)、atx-010(0.3mg/kg)和atx-001(0.3和1.5mg/kg)囊封的sirna敲低小鼠血漿中的因子vii。結(jié)果顯示atx-001和atx-010最有效(圖3和4)。0.3mg/kg或0.05mg/kgatx-018、atx-019和atx-020顯示示例性化合物的敲低活性(表1)。

權(quán)利要求書(按照條約第19條的修改)

1.一種式ii化合物，

其中

r1和r2都由1至14個碳所組成的直鏈烷基、或2至14個碳所組成的烯基或炔基組成；

l1和l2都由5至18個碳所組成的直鏈亞烷基或亞烯基組成，或與n一起形成雜環(huán)；

x是s；

l3由鍵或1至6個碳所組成的直鏈亞烷基組成，或與n一起形成雜環(huán)；

r3由1至6個碳所組成的直鏈或支鏈亞烷基組成；以及

r4和r5是相同或不同的，各自由氫或1至6個碳所組成的直鏈或支鏈烷基組成；

或其藥學(xué)上可接受的鹽。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中r1和r2都是烯基。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中r1和r2都是烷基。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中l(wèi)1和l2都是直鏈亞烷基。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中l(wèi)1和l2都是亞烯基。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中l(wèi)1和l2都由五個碳所組成的直鏈亞烷基組成。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中r3由亞乙基或亞丙基組成。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中r4和r5各自由氫、甲基或乙基組成。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中l(wèi)3由鍵組成。

10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中l(wèi)3由直鏈亞烷基組成。

11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中r1和r2都由十個碳所組成的直鏈烯基組成。

12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其選自式1)至12)的化合物：

13.一種式iii或iv化合物，

其中

r1由具有12至20個碳的支鏈烷基組成，

r2由具有5至10個碳的直鏈烷基或具有12至20個碳的支鏈烷基組成，

l1和l2各自由鍵或具有1至3個碳原子的直鏈烷基組成，

x由s或o組成，

l3由鍵或1至6個碳所組成的亞烷基組成，

r3由1至6個碳所組成的直鏈或支鏈亞烷基組成，以及

r4和r5是相同或不同的，各自由1至6個碳所組成的直鏈或支鏈烷基組成；

或其藥學(xué)上可接受的鹽。

14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的化合物，其中l(wèi)3由鍵組成。

15.根據(jù)權(quán)利要求17所述的化合物，其中l(wèi)3由亞烷基組成。

16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的化合物，其中x由s組成。

17.根據(jù)權(quán)利要求13所述的化合物，其中r3由亞乙基組成。

18.根據(jù)權(quán)利要求13所述的化合物，其中r3由亞正丙基或亞異丙基組成。

19.根據(jù)權(quán)利要求13所述的化合物，其中r4和r5各自由甲基、乙基或異丙基組成。

20.根據(jù)權(quán)利要求13所述的化合物，其中l(wèi)1和l2各自由鍵組成。

21.根據(jù)權(quán)利要求13所述的化合物，其中l(wèi)1和l2各自由直鏈亞烷基組成。

22.根據(jù)權(quán)利要求13所述的化合物，其中l(wèi)1和l2各自由亞甲基組成。

23.根據(jù)權(quán)利要求13所述的化合物，其中r2由直鏈烷基組成。

24.根據(jù)權(quán)利要求13所述的化合物，其中r2由支鏈烷基組成。

25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的化合物，其中所述支鏈烷基由19或20個碳原子組成。

26.根據(jù)權(quán)利要求24所述的化合物，其中所述支鏈烷基由13或14個碳原子組成。

27.根據(jù)權(quán)利要求13所述的化合物，其中l(wèi)3由亞甲基組成，r3由亞乙基組成，x2由s組成，并且r4和r5都由甲基組成。

28.根據(jù)權(quán)利要求13所述的化合物，其中l(wèi)3由鍵組成，r3由亞乙基組成，x由s組成，并且r4和r5都由甲基組成。

29.根據(jù)權(quán)利要求13所述的化合物，其中l(wèi)3由鍵組成，r3由亞正丙基組成，x由s組成，并且r4和r5都由甲基組成。

30.根據(jù)權(quán)利要求13所述的化合物，其中l(wèi)3由鍵組成，r3由亞異丙基組成，x由s組成，并且r4和r5都由甲基組成。

31.根據(jù)權(quán)利要求13所述的化合物，其選自式atx-b-1至atx-b-12的化合物：

32.一種式v化合物，

其中

r1由1至20個碳所組成的直鏈或支鏈烷基、或2至12個碳所組成的烯基或炔基、或膽固醇基組成；

r2由1至20個碳所組成的直鏈或支鏈烷基或2至20個碳所組成的烯基組成；

l1由3至9個碳所組成的直鏈烷基組成，或當r1由膽固醇基組成時，l1由3至4個碳所組成的直鏈亞烷基或烯基組成；

x1由-o-(co)-或-(co)-o-組成；

x2由s或o組成；

l2由鍵或具有1至6個碳的直鏈亞烷基組成；

r3由具有1至6個碳的直鏈或支鏈亞烷基組成；以及

r4和r5是相同或不同的，各自由具有1至6個碳的直鏈或支鏈烷基組成；

或其藥學(xué)上可接受的鹽。

33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的化合物，其中x1由-o-(co)-組成。

34.根據(jù)權(quán)利要求32所述的化合物，其中x2由s組成。

35.根據(jù)權(quán)利要求32所述的化合物，其中r3由亞乙基組成。

36.根據(jù)權(quán)利要求32所述的化合物，其中r3由亞正丙基或亞異丙基組成。

37.根據(jù)權(quán)利要求32所述的化合物，其中r4和r5各自由甲基、乙基或異丙基組成。

38.根據(jù)權(quán)利要求32所述的化合物，其中l(wèi)2由鍵組成。

39.根據(jù)權(quán)利要求32所述的化合物，其中l(wèi)2由亞甲基組成。

40.根據(jù)權(quán)利要求32所述的化合物，其中r2由烷基組成。

41.根據(jù)權(quán)利要求32所述的化合物，其中r1和r2都由支鏈烷基組成。

42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的化合物，其中所述支鏈烷基由19或20個碳原子組成。

43.根據(jù)權(quán)利要求41所述的化合物，其中所述支鏈烷基由13或14個碳原子組成。

44.根據(jù)權(quán)利要求32所述的化合物，其中l(wèi)2由亞甲基組成，r3由亞乙基組成，x1由-o-(co)-組成，x2是s，并且r4和r5都由甲基組成。

45.根據(jù)權(quán)利要求32所述的化合物，其中l(wèi)2由鍵組成，r3由亞乙基組成，x1由-o-(co)-組成，x2由s組成，并且r4和r5都由甲基組成。

46.根據(jù)權(quán)利要求32所述的化合物，其中l(wèi)2由鍵組成，r3由亞正丙基組成，x1由-o-(co)-組成，x2由s組成，并且r4和r5都由甲基組成。

47.根據(jù)權(quán)利要求32所述的化合物，其中l(wèi)2由鍵組成，r3由亞異丙基組成，x1由-o-(co)-組成，x2由s組成，并且r4和r5都由甲基組成。

48.根據(jù)權(quán)利要求32所述的化合物，其選自由式atx-a-1至atx-a-22的化合物組成的群組：