技術(shù)領(lǐng)域：
：：本發(fā)明涉及重組改構(gòu)豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白，它們可被用作抗原制成疫苗或用來檢測(cè)抗體。
背景技術(shù)：
：：豬圓環(huán)病毒(porcinecircovirus，pcv)是無包膜、單股負(fù)鏈環(huán)狀dna病毒[tischeri，etal.nature.1982jan7；295(5844)：64-6]，包括pcv1和pcv2[allang，2012]兩個(gè)型。pcv1對(duì)豬無致病性，pcv2是豬圓環(huán)病毒相關(guān)性疾病(porcinecircovirusassociateddisease，pcvad)的病原體，可在世界范圍內(nèi)引起pcvad。pcvad也被稱為豬圓環(huán)病毒疾病(porcinecircovirusdisease，pcvd)或斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(postweaningmultisystemicwastingsyndrome，pmws)。pcvad是豬的系統(tǒng)性的疾病，可累及呼吸系統(tǒng)(引起肺炎)、腸道(引起腸炎)、皮膚(引起壞死性皮炎)、腎臟(引起腎病綜合征)和生殖系統(tǒng)[opriessnigt，etal.jvetdiagninvest.2007nov；19(6)：591-615；segalésj.etal.resvetsci.2012dec；93(3)：1231-40]，也可表現(xiàn)為消耗、淋巴結(jié)腫大、黃疸和體重下降。pcv2能破壞豬的淋巴組織，造成淋巴組織缺失。淋巴組織缺失是pcvad的一種標(biāo)志性病理變化[ramamoorthys，etal.animhealthresrev.2009jun；10(1)：1-20]。pcvad的另一特征是發(fā)生免疫功能缺陷[darwichl，etal.virusres.2012mar；164(1-2)：61-7；mengxj.annurevanimbiosci.2013jan；1：43-64]。這種免疫缺陷使感染pcv2的豬易伴發(fā)多種病原體感染，這些病原體包括原蟲、真菌、細(xì)菌和病毒等[opriessnigt，etal.vetmicrobiol.2012jul6；158(1-2)：69-81]。pcv2有pcv2a和pcv2b兩個(gè)基因型。近10年來，在世界范圍內(nèi)流行的pcv2經(jīng)歷了從以pcv2a為主要感染基因型到以pcv2b為主要感染基因型的漂變(shift)[triblebr，etal.virusres.2012mar；164(1-2)：68-77]。pcv2主要通過豬呼吸道、消化道和泌尿道分泌物傳播[rosen，etal.vetmicrobiol.2012may25；157(1-2)：152-63]。pcv2感染可使豬的免疫功能紊亂，表現(xiàn)為免疫功能低下，也可表現(xiàn)為免疫功能亢進(jìn)(hyperimmunoreactivity)。在發(fā)生pmws的個(gè)體，其b細(xì)胞和t細(xì)胞可被清除殆盡，使其不能產(chǎn)生pcv2保護(hù)性抗體[chaec.vet.j.2004168：41-49]；在發(fā)生皮炎和腎病綜合征的豬可出現(xiàn)免疫復(fù)合物在皮膚和腎臟的大量沉積[chaec.vet.j.2005169：326-336]。pcv2的基因組有三個(gè)開放閱讀框架(openreadingframe，orf)：orf1、orf2和orf3。orf2編碼衣殼蛋白(capsidprotein，cp)。pcv1和pcv2的orf2之間序列的同源性為67％[allang，etal.virusres.2012mar；164(1-2)：4-9]。cp是pcv2的唯一結(jié)構(gòu)蛋白，可自組裝成病毒樣顆粒(viruslikeparticles，vlps)。cp可被用作pcv2疫苗的抗原。pcv2疫苗可以誘導(dǎo)針對(duì)pcv的保護(hù)性免疫反應(yīng)，預(yù)防或減輕pcvad(fachingeretal.vaccine.2008mar10；26(11)：1488-99；etal.vaccine.2008jun25；26(27-28)：3443-51；segalésetal.vaccine.2009dec9；27(52)：7313-21；pejsaketal.poljvetsci.2012；15(1)：37-42]。已有的商品化pcv疫苗是pcv2a疫苗，包括pcv2a滅活疫苗、pcv2a全長(zhǎng)衣殼蛋白亞單位疫苗和滅活的減毒pcv1-2a嵌合病毒疫苗[beachnm，etal.virusres.2012mar；164(1-2)：33-42]。pcv1-2a嵌合病毒是采用pcv1的基因骨架和pcv2a衣殼蛋白基因制成的病毒。處于研制階段的pcv2b疫苗有多種[beachnm，etal.virusres.2012mar；164(1-2)：33-42]，包括經(jīng)反復(fù)傳代或基因修飾獲得的pcv2b減毒病毒疫苗、pcv1-2b嵌合病毒疫苗、攜帶嵌合pcv1-2基因組的質(zhì)粒dna疫苗、pcv2衣殼蛋白細(xì)菌噬菌體展示疫苗、pcv2衣殼蛋白展示桿狀病毒載體疫苗、pcv2衣殼蛋白偽狂犬病毒載體疫苗、pcv2衣殼蛋白腺病毒載體疫苗和pcv2衣殼蛋白支氣管鮑特桿菌(bacteriumbordetellabronchiseptica)載體疫苗。由pcv2orf2-編碼的衣殼蛋白(cp)誘導(dǎo)出的免疫力可以抵抗pcv2的攻擊，這種免疫力主要由pcv2的中和抗體(neutralizingantibodies，na)介導(dǎo)[blanchardp，etal.vaccine2003；21：4565-75；segale′sj.expertrev.vaccines201514(3)，473-487]。在篩查pcv2感染和檢測(cè)pcv2疫苗效力時(shí)，多根據(jù)豬血循環(huán)中pcv2總抗體(totalanti-pcv2antibodies，ta)的水平來判定。ta是pcv2特異性抗體。田間觀察和臨床研究表明，在高滴度ta存在的情況下，pcv2仍可在宿主的組織和血液中存在[guez-arriojagm，etal.amjvetres2002；63：354-7；larocheller，etal.canjvetres2003；67：114-20；sibilam，etal.amjvetres2004；65：88-92；mcintoshka，etal.canjvetres2006；70(1)：58-61；segale′sj.expertrev.vaccines201514(3)，473-487]。這說明，在這類高滴度ta中缺乏中和抗體(neutralizingantibodies，na)、存在大量的非中和抗體(non-neutralizingantibodies，n-na)[meertsp，etal.bmcvetres2006；2：6；fortm，etal.vetmicrobiol2007；125：244-55]。在實(shí)驗(yàn)條件下，pcv2na可在疫苗接種后的10到28天出現(xiàn)[meertsp，etal.bmcvetres2006；2：6；fortm，etal.vetmicrobiol2007；125：244-55；pogranichnyyrm，etal.viralimmunol2000；13：143-53]。pcv2na的水平和pcv2復(fù)制和pcv2-sd的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)關(guān)系[meertsp，etal.bmcvetres2006；2：6；fortm，etal.vetmicrobiol2007；125：244-55]。產(chǎn)生了高水平pcv2ta的豬體內(nèi)的pcv2na水平可能不足以保護(hù)其抵抗pcv2的感染[meertsp，etal.bmcvetres2006；2：6；fortm，etal.vetmicrobiol2007；125：244-55]；pcv2na產(chǎn)生不足的豬，即便存在高滴度的pcv2特異抗體也可能不具備清除pcv2的免疫力[segale′sj.expertrev.vaccines201514(3)，473-487]。pcv2na主要由pcv2cp上中和表位刺激產(chǎn)生。研究表明，在pcv2cp上即存在b細(xì)胞表位，也存在t細(xì)胞表位[meertsp，etal.viralimmunol2005；18：333-41；fortm，etal.vetimmunolimmunopathol2009；129：101-7；steinere，etal.bmcvetres2009；5：45]；b細(xì)胞表位包括可刺激na產(chǎn)生的中和表位(neutralizingepitopes)和可刺激n-na的非中和表位(nonneutralizingepitopes)；有的非中和表位是誘騙表位(decoyepitope)[triblebr，etal.clin.vaccineimmunol.2011，18：749-757；triblebr，etal.virusres.2012.164：68-77]。pcv2cp上由169-180氨基酸殘基組成的肽段[cp(169-180)]是一個(gè)誘騙表位。cp(169-180)也被稱為免疫優(yōu)勢(shì)寡肽(immunodominantoligopeptideepitope)[triblebr，etal.clin.vaccineimmunol.2011.18：749-757]。對(duì)基因庫中的462pcv2序列分析揭示，cp(169-180)的序列高度保守[trible，b.r.，etal.journalofvirology，2012，86，13508-13514]。x線衍射分析顯示，cp(169-180)所在的功能區(qū)形成了一個(gè)外袢結(jié)構(gòu)(externalloopstructure)。該結(jié)構(gòu)突在cp亞單位的外面，其中的173-tyr，174-phe和175-glu均為抗體結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸殘基。該結(jié)構(gòu)是cp(169-180)被抗體識(shí)別、結(jié)合的基礎(chǔ)。然而，當(dāng)形成pcv2顆粒的時(shí)候，cp(169-180)不暴露于病毒顆粒的表面。因此，在完整的病毒顆粒中，抗體不能接近c(diǎn)p(169-180)[trible，b.r.，etal.journalofvirology，2012，86，13508-13514]。用pcv2cp單體[trible，b.r.，etal.journalofvirology，2012，86，13508-13514]和由pcv2cp形成的vlp(pcv2cpvlp)[khayat，r.，etal.journalofvirology，2011，85(15)，7856-7862]分別免疫豬后發(fā)現(xiàn)，用pcv2cpvlp免疫的豬產(chǎn)生了高水平的抗pcv抗體(anti-pcv2antibodies)，其中包括高水平的pcv2na和低水平的cp(169-180)抗體。受到pcv2攻擊后，在經(jīng)pcv2cpvlp免疫的豬的血清中檢測(cè)不到pcv2。相比之下，在pcv2cp單體免疫的豬的血清中，可檢測(cè)出高水平的pcv抗體和高水平的cp(169-180)抗體，幾乎檢測(cè)不出pcv2中和活性。此外，在用pcv2攻擊后，經(jīng)pcv2cp單體免疫的豬的pcv2病毒血癥和未免疫的豬的沒有差別。這說明，cp(169-180)抗體是n-na；高水平抗cp(169-180)抗體不能控制pcv2的復(fù)制[trible，b.r.，etal.journalofvirology，2012，86，13508-13514]。存在誘騙表位是能建立長(zhǎng)期感染的病原體的一個(gè)普遍特征。誘騙表位是非保護(hù)性表位(non-protectiveepitopes)，為免疫優(yōu)勢(shì)表位(immunodominantepitope)。誘騙表位可強(qiáng)力、持續(xù)性刺激b細(xì)胞發(fā)生體液免疫應(yīng)答，因而會(huì)啟動(dòng)抑制抗體生成的負(fù)反饋調(diào)控，該調(diào)控可抑制對(duì)中和表位發(fā)生的體液免疫應(yīng)答，因而抑制na的產(chǎn)生。在完整pcv2粒子，作為免疫優(yōu)勢(shì)表位的cp(169-180)藏于抗體不能到達(dá)的位置，不能刺激誘騙抗體的產(chǎn)生。針對(duì)完整pcv2粒子發(fā)生的免疫應(yīng)答產(chǎn)生大量的na，可使宿主控制pcv2的復(fù)制。pcv2感染細(xì)胞可產(chǎn)生游離的cp或cp片段。沒組裝好的重組pcv2cpvlp可暴露cp(169-180)，因而能刺激大量的cp(169-180)抗體。感染pcv2的豬易感染其它病原體。這的伴隨感染可刺激pcv2的復(fù)制使感染細(xì)胞產(chǎn)生pcv2cp單體和pcv2cp片段。針對(duì)pcv2游離cp或pcv2cp片段發(fā)生的免疫應(yīng)答產(chǎn)生大量的n-na，這種抗體不能中和pcv2，不能控制pcv2的復(fù)制，因而可使pcv2逃逸免疫系統(tǒng)的攻擊。逃逸了免疫系統(tǒng)攻擊的pcv2可持續(xù)在感染細(xì)胞中復(fù)制，產(chǎn)生更多的pcv2cp單體和pcv2cp片段，使pcvad遷延進(jìn)展。患pcvad豬體內(nèi)的抗體主要是免疫優(yōu)勢(shì)寡肽(immunodominantoligopeptideepitope，cp(169-180)的抗體[triblebr，etal.clin.vaccineimmunol.2011.18：749-757]。cp(169-180)抗體的功能是免疫誘騙(immunologicaldecoy)，使免疫反應(yīng)從保護(hù)性的表位偏離，因此pcv2利用此誘騙表位作為一種防御機(jī)制，以此來抵抗、逃逸宿主的免疫系統(tǒng)[trible，b.r.，etal.journalofvirology，2012，86，13508-13514]。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：：1、本發(fā)明提供一種的重組改構(gòu)pcv2b衣殼蛋白，其特點(diǎn)是去除了pcv2b衣殼蛋白的逃逸表位并將其代之以pcv2b衣殼蛋白的另一個(gè)肽段(含中和表位)。2、本發(fā)明提供了在大腸桿菌系統(tǒng)和昆蟲細(xì)胞桿狀病毒系統(tǒng)生產(chǎn)這種重組改構(gòu)pcv2b衣殼蛋白的方法，在大腸桿菌系統(tǒng)生產(chǎn)的重組改構(gòu)pcv2b衣殼蛋白被命名為c2，在昆蟲細(xì)胞桿狀病毒系統(tǒng)生產(chǎn)的重組改構(gòu)pcv2b衣殼蛋白被命名為cβ。3、本發(fā)明提供了編碼c2的核苷酸序列(序列表<400>2)和c2的氨基酸序列(序列表<400>3)，也提供了編碼cβ的核苷酸序列(序列表<400>5)和cβ的氨基酸序列(序列表<400>6)。4、本發(fā)明提供了的c2和cβ可被用作抗原用于疫苗的制備和用于圓環(huán)病毒特別是pcv2b特異性抗體的檢測(cè)。c2和cβ作為制備疫苗抗原的特點(diǎn)是：它可以誘生高滴度的圓環(huán)病毒特別是pcv2b特異性抗體，而不誘生針對(duì)圓環(huán)病毒衣殼蛋白逃逸表位的抗體。c2和cβ作為特異性抗體檢測(cè)抗原的特點(diǎn)是：用它檢測(cè)到的圓環(huán)病毒特異性抗體不包含由圓環(huán)病毒衣殼蛋白逃逸表位誘生的非中和抗體。5、本發(fā)明提供的重組改構(gòu)pcv2b衣殼蛋白，包括但不限于c2和cβ.可被制成疫苗來預(yù)防由豬圓環(huán)病毒感染引起的豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病。6、本發(fā)明提供的重組改構(gòu)pcv2b衣殼蛋白可和佐劑、藥學(xué)可接受的載體配成疫苗或疫苗組合物來預(yù)防由豬圓環(huán)病毒感染引起的豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病。7、本發(fā)明提供的重組改構(gòu)pcv2b衣殼蛋白，包括但不限于c2和cβ.可被用作抗原來檢測(cè)豬圓環(huán)病毒的特異性抗體，而不檢測(cè)由豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白逃逸表位誘生的抗體。發(fā)明中的術(shù)語：除非特別強(qiáng)調(diào)，本發(fā)明中的術(shù)語具有可以被本發(fā)明所屬領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員所理解的通常意義。若出現(xiàn)含義上的沖突，應(yīng)遵從本發(fā)明中的解釋、界定或說明?！爸亟M豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白”：是用含有攜帶豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白編碼基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌生產(chǎn)的豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白(pcvcp)，也指用攜帶pcvcp編碼基因的稈狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞生產(chǎn)的pcvcp，也包括用酵母細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)的pcvcp。重組pcvcp單體可自組裝成病毒樣顆粒(viruslikeparticle，vlp)，該vlp可被用作抗原制備對(duì)豬圓環(huán)病毒感染有預(yù)防作用的疫苗。重組pcvcp單體中的誘騙表位可刺激豬圓環(huán)病毒非中和抗體的產(chǎn)生。這種抗體也被稱為誘騙抗體，可干擾豬圓環(huán)病毒中和抗體的產(chǎn)生。pcvcp代表豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白，包括在pcv2顆粒上的豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白，也代表重組豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白。pcvcp含誘騙表位。本發(fā)明提供的pcvcp編碼基因采用了優(yōu)化設(shè)計(jì)的密碼子?！爸亟M改構(gòu)豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白”是用含有攜帶pcvcp的改構(gòu)編碼基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌生產(chǎn)的pcvcp，也指用攜帶pcvcp編碼基因的稈狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞生產(chǎn)的pcvcp，也包括用酵母細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)的改構(gòu)pcvcp。改構(gòu)重組豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白是去除了誘騙表位并在誘騙表位的部位代之以中和表位的重組豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白。改構(gòu)重組豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白可被用作抗原制備對(duì)豬圓環(huán)病毒感染有預(yù)防作用的疫苗。改構(gòu)重組豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白不誘生抗cp(169-180)抗體，且增加了誘生pcv中和抗體的的中和表位。用c2代表在大腸桿菌生產(chǎn)的改構(gòu)重組豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白。c2和用大腸桿菌生產(chǎn)的改構(gòu)重組豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白有相同的含義。用cβ代表在昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)生產(chǎn)的改構(gòu)重組豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白，cβ和在昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)生產(chǎn)的改構(gòu)重組豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白有相同的含義。c2工程菌是指轉(zhuǎn)化有pet28a-c2的大腸桿菌，可被用來生產(chǎn)c2。pet28a-c2是攜帶c2編碼基因的pet28a(+)質(zhì)粒。pet28a(+)質(zhì)粒是原核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒。重組改構(gòu)豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白和改構(gòu)豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白可有相同的含義?！柏i圓環(huán)病毒感染”：豬圓環(huán)病毒感染由豬圓環(huán)病毒(pcv)引起，所致的疾病被稱為豬圓環(huán)病毒相關(guān)性疾病?！柏i圓環(huán)病毒相關(guān)疾病”豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病(porcinecircovirusassociateddisease，pcvad)也稱豬圓環(huán)病毒疾病(porcinecircovirusdiseases，pcvd)。pcvad最初被稱為斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(postweaningmultisystemicwastingsyndrome，pmws)。根據(jù)病理狀況的不同，pcvad也被稱為pcv系統(tǒng)疾病(pcv-systemicdisease，pcv-sd)、pcv2亞臨床感染(pcv2-subclinicalinfection，pcv2-si)、pcv2生殖系統(tǒng)疾病(pcv2-reproductivedisease，pcv2-rd)、豬皮炎(porcinedermatitis)和豬腎病綜合征(nephropathysyndrome，pdns)[segale′sj.expertrev.vaccines201514(3)，473-487]。pcvad的主要臨床、病理和診斷指標(biāo)如文獻(xiàn)[segale′sj.expertrev.vaccines201514(3)，473-487]的表一(table1)所述?！翱垢腥尽保罕景l(fā)明提供的重組改構(gòu)豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白可發(fā)揮抗pcv2感染的作用?？垢腥竞蛯?duì)微生物感染產(chǎn)生治療或預(yù)防作用是可以互換的術(shù)語。抗pcv2感染也指預(yù)防或減輕豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病。本發(fā)明提供的改構(gòu)重組豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白具有抗感染作用?！翱乖笔悄鼙籦細(xì)胞受體或t細(xì)胞受體識(shí)別而激發(fā)個(gè)體適應(yīng)性免疫應(yīng)答(adaptiveimmuneresponse)的物質(zhì)或分子。抗原可以來自個(gè)體的外部，如微生物抗原；也可來自個(gè)體的內(nèi)部，如腫瘤抗原。微生物抗原是來自微生物的可被b細(xì)胞受體或t細(xì)胞受體識(shí)別而激發(fā)個(gè)體適應(yīng)性免疫應(yīng)答的物質(zhì)或分子。采用微生物抗原制備成的疫苗在給個(gè)體應(yīng)用后能使其獲得對(duì)該病原體的免疫力，使其在再次接觸到同樣或相似病原體時(shí)受到保護(hù)?？乖梢詮奈⑸锘蚰[瘤細(xì)胞提取、可以采用重組dna技術(shù)在大腸桿菌系統(tǒng)、昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)、酵母系統(tǒng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)生產(chǎn)、也可用化學(xué)方法合成。本發(fā)明提供的改構(gòu)重組豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白是一種微生物抗原?？乖且呙绲闹饕煞郑部杀挥脕頇z測(cè)抗原特異性抗體。“免疫應(yīng)答”：免疫應(yīng)答(immuneresponse)和免疫反應(yīng)具有相似的意義。免疫應(yīng)答是個(gè)體的免疫細(xì)胞包括b淋巴細(xì)胞、t淋巴細(xì)胞、nk細(xì)胞、γδt細(xì)胞、nkt細(xì)胞、樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞等對(duì)抗原或其它刺激[如病原體相關(guān)的模式分子(pathogenassociatedmolecularpattern，pamp)和損傷相關(guān)的模式分子(damageassociatedmolecularpattern，damp)做出的反應(yīng)。免疫應(yīng)答的結(jié)果是選擇性破壞或清除入侵的病原微生物或內(nèi)生的腫瘤細(xì)胞。免疫應(yīng)答包括固有免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答。適應(yīng)性免疫應(yīng)答括細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答。由采用微生物抗原制成的疫苗所激發(fā)的免疫應(yīng)答可以使被免疫的個(gè)體獲得抵抗微生物感染的能力。促進(jìn)對(duì)個(gè)體對(duì)微生物的免疫應(yīng)答可發(fā)生抗感染作用。具有抗感染作用的免疫應(yīng)答是保護(hù)性免疫應(yīng)答。本發(fā)明提供的重組改構(gòu)圓環(huán)病毒衣殼蛋白可誘導(dǎo)個(gè)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答?！皞€(gè)體”：在本發(fā)明中的個(gè)體(subject或individual)指包括豬、小鼠在內(nèi)的脊椎動(dòng)物，也包括人。“淋巴細(xì)胞”：淋巴細(xì)胞(lymphocyte)指在血液、淋巴液和淋巴組織中存在的沒有吞噬能力的單個(gè)核白細(xì)胞，包括b淋巴細(xì)胞(也稱b細(xì)胞)和t淋巴細(xì)胞(也稱t細(xì)胞)。t細(xì)胞可被分為表面表達(dá)cd4分子的t細(xì)胞(cd4+t細(xì)胞)和為表面表達(dá)cd8分子的t細(xì)胞(cd8+t細(xì)胞)?！翱共《具m應(yīng)性免疫應(yīng)答”病毒基因編碼的胞膜蛋白、衣殼蛋白、酶類等病毒抗原均能激發(fā)個(gè)體發(fā)生適應(yīng)性免疫應(yīng)答，該應(yīng)答包括抗病毒體液免疫應(yīng)答和抗病毒細(xì)胞免疫應(yīng)答。在抗病毒體液免疫應(yīng)答過程中產(chǎn)生的抗體可發(fā)揮下述功效：①阻止病毒吸附、侵入感染細(xì)胞；②限制病毒在體液中播散；③通過激活補(bǔ)體、調(diào)理作用、抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞素效應(yīng)破壞病毒感染細(xì)胞。抗病毒細(xì)胞免疫效應(yīng)主要由cd8+t細(xì)胞和cd4+t細(xì)胞介導(dǎo)。cd8+t細(xì)胞可特異性殺傷病毒感染細(xì)胞，也可通過產(chǎn)生腫瘤壞死因子、γ-干擾素和t細(xì)胞抗病毒因子(cd8+t-cellanti-viralfactor，caf)發(fā)揮非殺傷性抗病毒效應(yīng)。cd4+t細(xì)胞可通過釋放細(xì)胞因子活化巨噬細(xì)胞、促進(jìn)cd8+t細(xì)胞增殖、分化來發(fā)揮抗病毒作用，也可特異性殺傷病毒感染細(xì)胞?！氨砦弧币卜Q抗原表位(antigenepitope)或抗原決定基(antigendeterminant)，是抗原分子中決定抗原特異性的化學(xué)基團(tuán)，為決定免疫應(yīng)答特異性的物質(zhì)基礎(chǔ)。表位可被淋巴細(xì)胞表面的抗原受體識(shí)別、結(jié)合，進(jìn)而激活淋巴細(xì)胞，引起免疫應(yīng)答。抗體分子分子在識(shí)別、結(jié)合抗原表位后發(fā)揮免疫效應(yīng)。表位可被分為線性表位和構(gòu)象表位。線性表位(linearepitope)是由順序相連的氨基酸殘基組成的表位，也稱連續(xù)表位。線性表位可被t細(xì)胞受體識(shí)別、結(jié)合，也能被b細(xì)胞受體識(shí)別、結(jié)合。位于蛋白質(zhì)抗原表面的線性表位能接近抗體并被其結(jié)合。位于蛋白質(zhì)抗原內(nèi)部的線性表位，不易或不能接近抗體并被其結(jié)合。有的線性表位可位于蛋白單體的表面，但當(dāng)多個(gè)(如數(shù)十個(gè)或數(shù)百個(gè))該蛋白單體組成復(fù)合物(如組裝成了病毒樣顆粒)后，該線性表位就會(huì)被隱匿到該復(fù)合物的內(nèi)部而不易或不能接近抗體并被其結(jié)合。構(gòu)象表位(conformationalepitope)是由順序不相連的氨基酸殘基折疊出空間構(gòu)象后形成的表位。pcv2cp上的線性表位的確定可采用pcv感染的豬血清或pcv病毒高免疫的兔血清來檢測(cè)衣殼蛋白(cp)的疊加肽進(jìn)行。根據(jù)cp的序列合成覆蓋全場(chǎng)的和cp疊加的所有12肽。確定的抗體反應(yīng)區(qū)(antibodyreactiveregions)中的線性表位為pcv2bcp3-43，71-85，117-131和171-202[mahé，d.，etal.thejournalofgeneralvirology，2000，81(pt7)，1815-1824]。構(gòu)象表位[conformationalepitopes]的確定可采用嵌合病毒dna轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和單克隆抗體進(jìn)行。用7株抗pcvcp單克隆抗體和轉(zhuǎn)染嵌合pcv的細(xì)胞確定的pcvcp構(gòu)象表位[conformationalepitopes]中免疫反應(yīng)區(qū)(immunoreactiveregions)在47-85，165-200和200-233[lekcharoensuk，p.，etal.journalofvirology，2004，78(15)，8135-8145]。結(jié)合上述研究，可將pcvcp分為4個(gè)免疫反應(yīng)區(qū)，被命名為表位a-d[trible，b.r.，etal.clinicalandvaccineimmunology：2011cvi，18(5)，749-757]?！癰細(xì)胞表位”是被b細(xì)胞受體(bcellreceptor，bcr)或抗體識(shí)別、結(jié)合的表位。b細(xì)胞通過bcr識(shí)別、結(jié)合b細(xì)胞表位后獲得激活信號(hào)。在其它的激活信號(hào)的參與下，獲得激活信號(hào)的b細(xì)胞增殖、分化，進(jìn)而產(chǎn)生產(chǎn)生可識(shí)別、結(jié)合b細(xì)胞表位的抗體?！懊庖邇?yōu)勢(shì)表位”免疫優(yōu)勢(shì)表位(immunodominantepitopes)是一個(gè)抗原分子上能有效刺激b細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體的b細(xì)胞表位。就b細(xì)胞產(chǎn)生抗體而言，一個(gè)抗原分子上的b細(xì)胞表位并不是等效的。有的b細(xì)胞表位能優(yōu)先被b細(xì)胞的bcr識(shí)別，并能強(qiáng)效刺激該b細(xì)胞產(chǎn)生高水平的特異性抗體，成為免疫優(yōu)勢(shì)表位。有的b細(xì)胞表位不具備這種效力。可采用pcv2感染豬血清、pcv2疫苗免疫豬血清或患pcvad豬血清來確定pcv2cp上免疫優(yōu)勢(shì)表位[trible，b.r.，etal.clinicalandvaccineimmunology：2011cvi，18(5)，749-757]。本發(fā)明提供的重組改構(gòu)圓環(huán)病毒衣殼蛋白含有更多的能誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)的優(yōu)勢(shì)表位?！爸泻捅砦弧笔悄艽碳ぶ泻涂贵w產(chǎn)生的b細(xì)胞表位。病毒顆粒上的中和表位刺激產(chǎn)生的中和抗體能阻止病毒感染宿主細(xì)胞、限制病毒在體液中和體液間擴(kuò)散。病毒疫苗中的抗原應(yīng)含有中和表位。本發(fā)明提供的重組改構(gòu)圓環(huán)病毒衣殼蛋白含有更多的中和表位?！皌細(xì)胞表位”是被t細(xì)胞受體(tcellreceptor，tcr)識(shí)別、結(jié)合的表位。t細(xì)胞受體(tcellreceptor，tcr)是表達(dá)在t細(xì)胞表面的抗原受體，為異二聚體跨膜蛋白。tcr由可變(v)區(qū)和恒定(c)區(qū)組成。v區(qū)是tcr識(shí)別抗原表位的結(jié)構(gòu)域。tcr不能直接識(shí)別t細(xì)胞表位，只能識(shí)別抗原遞呈細(xì)胞或靶細(xì)胞表面的表位肽-mhc分子復(fù)合物。mhc分子是主要組織相容復(fù)合體(majorhistocompatibiltiycomplex，mhc)基因編碼的蛋白類分子，包括mhci類分子和mhcii類分子?！氨Ｗo(hù)性表位”保護(hù)性表位(protectiveepitopes)是能刺激個(gè)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)的表位，可以是b細(xì)胞表位，也可以是t細(xì)胞表位。保護(hù)性表位能刺激個(gè)體產(chǎn)生保護(hù)性抗病毒免疫反應(yīng)。針對(duì)某一病毒的保護(hù)性免疫反應(yīng)可使個(gè)體免于該病毒的感染或減輕該病毒感染所引起的疾病。中和表位是一種保護(hù)性表位。本發(fā)明提供的重組改構(gòu)圓環(huán)病毒衣殼蛋白含有更多的保護(hù)性表位?！罢T騙表位”誘騙表位(decoyepitope)是一種免疫優(yōu)勢(shì)表位，但非保護(hù)性表位，主要刺激非中和抗體產(chǎn)生，可減弱或抑制個(gè)體對(duì)保護(hù)性表位的免疫應(yīng)答。誘騙表位也稱逃逸表位。病毒可通過誘騙表位行使免疫誘騙(immunologicaldecoys)，借此逃逸宿主的免疫攻擊。典型的免疫誘騙見于貓免疫缺陷病毒(felineimmunodeficiencyvirus，fiv)和人免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，hiv)。fiv包膜蛋白的可變區(qū)(variableregions)v3，v4和v5是fiv完成其感染宿主細(xì)胞必需的區(qū)段，存在免疫優(yōu)勢(shì)中和表位，可刺激中和抗體的產(chǎn)生。然而在感染的過程中，這些區(qū)域可發(fā)生縮短、增長(zhǎng)或氨基酸序列的高度變異，進(jìn)而刺激產(chǎn)生大量的非保護(hù)性抗體[hosiemj，etal.viruses20113：1870-1890]。hiv的糖蛋白120(gp120)[stamatatosl，etal.nat.med.200915：866-870]也會(huì)出現(xiàn)誘騙表位，刺激非中和抗體的產(chǎn)生。prrsv糖蛋白5(gp5)中的高變區(qū)可持續(xù)性招募b細(xì)胞但不刺激產(chǎn)生中和抗體[ostrowskim，etal.j.virol.200276：4241-4250]，gammaherpesvirus的糖蛋白150(gp150)是具有免疫優(yōu)勢(shì)，刺激非保護(hù)性抗體反應(yīng)[gilletl，etal.plosone.2007aug8；2(8)：e705]。豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白的cp(169-180)肽段是誘騙表位[trible，b.r.，etal.journalofvirology，2012，86，13508-13514]。豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病的一種標(biāo)志性變化是宿主的免疫失調(diào)，表現(xiàn)為產(chǎn)生大量的非中和抗體(non-neutralizingantibody)。本發(fā)明提供的重組改構(gòu)圓環(huán)病毒衣殼蛋白不含誘騙表位?！皃cv2衣殼蛋白(169-180)寡肽”是根據(jù)豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白的cp的第169到第180位氨基酸序列合成的肽段，也被稱為cp(169-180)?？刹捎胏p(169-180)做包被抗原做酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(elisa)來檢測(cè)由豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白誘騙表位刺激產(chǎn)生的非中和誘騙抗體[trible，b.r.，etal.journalofvirology，2012，86，13508-13514；triblebr，etal.2011.clin.vaccineimmunol.18：749-757；triblebr，etal.2012.vaccine30：4079-4085]。“中和抗體”是在抗病毒體液免疫應(yīng)答過程中由個(gè)體的b淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的、可通過識(shí)別、結(jié)合病毒抗原而阻止病毒感染細(xì)胞并限制病毒擴(kuò)散的抗體。一般而言，僅針對(duì)表達(dá)于病毒或受染細(xì)胞表面糖蛋白的抗體(即中和抗體)才具有控制該病毒感染的作用。中和抗體具有抗圓環(huán)病毒感染的作用?！氨Ｗo(hù)性抗體“保護(hù)性抗體(protectiveantibody)是能保護(hù)個(gè)體免受病毒感染的抗體，也指能減輕病毒感染所引起疾病的抗體。中和抗體是一種保護(hù)性抗體。本發(fā)明提供的重組改構(gòu)圓環(huán)病毒衣殼蛋白可以誘導(dǎo)保護(hù)性抗體的產(chǎn)生?！胺侵泻涂贵w”非中和抗體(non-neutralizingantibody)是不能阻斷病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的抗體?！胺潜Ｗo(hù)性抗體”非保護(hù)性抗體(nonprotectiveantibody)是對(duì)個(gè)體沒有保護(hù)作用的病毒特異性抗體。誘騙表位誘導(dǎo)個(gè)體產(chǎn)生的抗體是非保護(hù)性抗體。“誘騙抗體”誘騙抗體和逃逸抗體是可以互換使用的術(shù)語，具有相同的含義。在本發(fā)明中，誘騙抗體(逃逸抗體)是由豬圓環(huán)病毒(pcv)誘騙表位(逃逸表位)在個(gè)體誘生的pcv特異性抗體，它屬于非中和抗體，也屬于非保護(hù)性抗體，不具備抗pcv感染的作用，且可干擾pcv中和抗體和保護(hù)性抗體的產(chǎn)生。另，誘騙(逃逸)抗體可被pcv來借用來逃逸免疫反應(yīng)對(duì)其感染的限制。因此，能誘導(dǎo)pcv中和抗體和保護(hù)性抗體、但不刺激誘騙(逃逸)抗體的pcv衣殼蛋白是更具免疫效力的抗原，更適合被用于pcv疫苗的制備?！皃cv2特異抗體”是可以識(shí)別、結(jié)合pcv2或其組分的抗體，包括中和抗體、保護(hù)性抗體、非中和抗體和非保護(hù)性抗體。pcv2特異抗體可以用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(elisa)和免疫印跡(westernblot)等方法檢測(cè)。本發(fā)明提供的重組改構(gòu)圓環(huán)病毒衣殼蛋白可被用來檢測(cè)pcv2特異抗體，且可避免由pcv2cp誘騙表位誘生的非保護(hù)性抗體的干擾?！熬哂猩锕δ艿馁|(zhì)粒載體”具有生物功能的質(zhì)粒載體(biologicallyfunctionalplasmidorviralvector)是能在真核細(xì)胞表達(dá)所攜帶的外源基因的質(zhì)粒。將可表達(dá)蛋白抗原編碼基因克隆到具有生物功能的質(zhì)粒上，該質(zhì)粒載體在被注射到個(gè)體后能表達(dá)出相應(yīng)的蛋白抗原使個(gè)體免疫。這種能表達(dá)抗原的質(zhì)粒被稱為核酸疫苗或dna疫苗?？蓪⒈景l(fā)明所述的重組改構(gòu)圓環(huán)病毒衣殼蛋白編碼基因克隆到具有生物功能的質(zhì)粒載體上制成表達(dá)改構(gòu)圓環(huán)病毒衣殼蛋白的核酸疫苗。“具有生物功能的病毒載體”具有生物功能的病毒載體(biologicallyfunctionalplasmidorviralvector)是能轉(zhuǎn)染/感染真核細(xì)胞后表達(dá)所攜帶的外源基因的病毒。將可表達(dá)蛋白抗原編碼基因克隆到具有生物功能的病毒載體上，該病毒載體在被注射到個(gè)體后能轉(zhuǎn)染/感染細(xì)胞并表達(dá)出相應(yīng)的蛋白抗原使個(gè)體免疫。這種具有轉(zhuǎn)染/感染真核細(xì)胞活性且能表達(dá)蛋白抗原的病毒被稱為活病毒載體，它可被用做疫苗?？蓪⒈景l(fā)明所述的重組改構(gòu)圓環(huán)病毒衣殼蛋白編碼基因克隆到具有生物功能的病毒載體上制成表達(dá)改構(gòu)圓環(huán)病毒衣殼蛋白的活病毒載體疫苗。具有生物功能的病毒載體本身也可以是一種作為疫苗的減毒病毒，如疫苗病毒減毒pcv1-2a嵌合病毒疫苗[beachnm，etal.virusres.2012mar；164(1-2)：33-42]?？杀挥米鞅景l(fā)明所提供的改構(gòu)圓環(huán)病毒衣殼蛋白編碼基因具有生物功能的病毒載體的病毒包括但不限于腺病毒、痘病毒、噬菌體、桿狀病毒、豬口蹄疫病毒、豬藍(lán)耳病(豬繁殖與呼吸綜合征)病毒、豬瘟病毒、豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒、豬細(xì)小病毒、豬流感病毒和豬副流感病毒等?！耙呙纭保阂呙?vaccine)是用減毒或殺死的病原生物或其組份為抗原制成的用于人工主動(dòng)免疫的生物制品?？乖妥魟┦且呙绲闹饕煞?。接種疫苗的目的是使個(gè)體獲得對(duì)病原體的免疫力進(jìn)而使其再接觸到相應(yīng)的病原體時(shí)受到保護(hù)。本發(fā)明提供的重組改構(gòu)豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白是抗原，這種抗原能被用于預(yù)防豬圓環(huán)病毒感染的疫苗，也能和其它的豬用疫苗聯(lián)合應(yīng)用。這些豬用疫苗包括但不限于下述豬傳染性疾病預(yù)防用疫苗：豬口蹄疫、豬藍(lán)耳病(豬繁殖與呼吸綜合征)、豬瘟、豬偽狂犬病、豬圓環(huán)病毒感染、豬細(xì)小病毒感染、豬鏈球菌病、豬傳染性胃腸炎、豬氣喘病、副豬嗜血桿菌感染、豬丹毒、豬肺疫、豬萎縮性鼻炎、豬傳染性胃腸炎、豬乙腦、豬流感、豬布魯氏病、仔豬腹瀉、豬副流感病毒感染、豬流感、豬肺炎支原體感染、仔豬水腫病、豬霍亂沙門氏菌、豬流行性腹瀉和豬肺疫。疫苗的免疫效力是指其誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答的活性。疫苗的免疫效力也可指疫苗中抗原的免疫效力，佐劑可提高抗原的免疫效力?！柏i圓環(huán)病毒疫苗”本發(fā)明提供的重組改構(gòu)圓環(huán)病毒衣殼蛋白可和豬圓環(huán)病毒疫苗[beachnm，etal.virusres.2012mar；164(1-2)：33-42]聯(lián)合應(yīng)用，這些疫苗包括但不限于pcv2a滅活疫苗、pcv2a全長(zhǎng)衣殼蛋白亞單位疫苗、pcv2b全長(zhǎng)衣殼蛋白亞單位疫苗、滅活的減毒pcv1-2a嵌合病毒疫苗、經(jīng)反復(fù)傳代或基因修飾獲得的pcv2b減毒病毒疫苗、pcv1-2b嵌合病毒疫苗、攜帶pcv基因的質(zhì)粒dna疫苗、pcv2衣殼蛋白細(xì)菌噬菌體展示疫苗、pcv2衣殼蛋白展示桿狀病毒載體疫苗、pcv2衣殼蛋白偽狂犬病毒載體疫苗、pcv2衣殼蛋白腺病毒載體疫苗和pcv2衣殼蛋白支氣管鮑特桿菌(bacteriumbordetellabronchiseptica)載體疫苗等?！白魟北景l(fā)明提供的重組改構(gòu)豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白可以和一種或多種佐劑聯(lián)合使用來增強(qiáng)其誘導(dǎo)保護(hù)性免疫的效力。佐劑(adjuvant)是在疫苗中和抗原一起應(yīng)用的物質(zhì)，具有下述活性(1)減少疫苗的接種次數(shù)；(2)延長(zhǎng)疫苗的免疫持續(xù)期；(3)通過激動(dòng)固有免疫應(yīng)答促進(jìn)體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答；(4)擴(kuò)展抗原誘導(dǎo)的交叉保護(hù)免疫應(yīng)答；(5)增強(qiáng)弱免疫應(yīng)答個(gè)體如老齡個(gè)體或免疫缺陷個(gè)體對(duì)抗原的免疫應(yīng)答；(6)減少抗原的用量?？珊捅景l(fā)明提供的重組改構(gòu)豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白聯(lián)合應(yīng)用的佐劑[stanleya.plotkin，waltera.orenstein，paula.offit，vaccines，sixthedition，animprintofelsevierinc.2013，isbn-13：9781455700905]包括但不限于：鋁鹽佐劑(由氫氧化鋁或磷酸鋁為主要成分的疫苗佐劑)、as04佐劑[吸附mpl的磷酸鋁佐劑(mpl是經(jīng)化學(xué)減毒的革蘭氏陰性菌脂多糖)]、mf59佐劑(一種水包油型乳化劑，其中的油相是角鯊烯)、as03佐劑(一種采用角鯊烯為油相的水包油乳化劑)、af03佐劑(一種采用角鯊烯為油相的水包油型乳化劑)、montanideisa51佐劑(以礦物油為油相的油包水乳化劑)、弗氏佐劑、弗氏不完全佐劑、病毒小體佐劑(virosomeadjuvant)、n-氧化聚乙烯對(duì)二氮己環(huán)衍生物(polyoxidonium)佐劑、白油佐劑、montanidetmisa-206佐劑、polylactideco-glycolide、病毒(adenovirus，vaccinia，fowlpox)載體佐劑、卡介苗(bcg，bacilluscalmette-guérin)、包括qs21在內(nèi)的皂素、包括tdb在內(nèi)的c-typelectinligands、包括α-galactosylceramide在內(nèi)的cd1d配體、as01(mpl，qs21，liposomes)、as02(mpl，qs21，乳化劑)、as15(mpl，qs21，cpgodn，脂質(zhì)體)、gla-se(gla，emulsion)、ic31(cpgodn，陽離子多肽)、caf01(tdb，陽離子脂質(zhì)體)和iscoms(皂素，磷脂)[reedsg，etal.natmed.2013dec；19(12)：1597-608；meleroi，etal.natrevclinoncol.2014sep；11(9)：509-24]。能和本發(fā)明提供的重組改構(gòu)豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白聯(lián)合應(yīng)用的佐劑還包括病原體相關(guān)模式分子及其模擬物、toll樣受體激動(dòng)劑、損傷相關(guān)模式分子及其模擬物、環(huán)二核苷酸及其模擬物、免疫卡點(diǎn)抑制物、共刺激受體激活劑和細(xì)胞因子等?！安≡w相關(guān)的模式分子”：本發(fā)明提供的重組改構(gòu)豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白可以和病原體相關(guān)的模式分子(pathogen-associatedmolecularpatterns，pamps)及其類似物聯(lián)合應(yīng)用來增強(qiáng)其免疫效力。pamps是微生物的各種保守成分，如細(xì)菌細(xì)胞壁成分、真菌細(xì)胞壁成分和病毒核酸等。固有免疫細(xì)胞通過模式識(shí)別受體(pattern-recognitionreceptors，prrs)識(shí)別pamps而被激活。prr包括toll-likereceptors(tlrs)、nucleotide-bindingoligomerizationdomain(nod)-，leucine-richrepeat-containingreceptors(nlrs)、rig-i-likereceptors(rlrs)、c-typelectinreceptors(clrs)和aim-2likereceptors；也包括細(xì)胞內(nèi)識(shí)別核酸的細(xì)胞內(nèi)核酸感受器(intracellularsensorsofnucleicacids)、oas蛋白和cgas[iwasakiaetal.natimmunol.2015apr；16(4)：343-53]?！皌oll樣受體激動(dòng)劑”：本發(fā)明提供的重組改構(gòu)豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白可以和一種或多種toll樣受體(toll-likereceptors，tlrs)激動(dòng)劑聯(lián)合應(yīng)用來增強(qiáng)其免疫效力，表現(xiàn)抗圓環(huán)病毒感染活性。能和本發(fā)明提供的重組改構(gòu)豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白聯(lián)合應(yīng)用的tlr激動(dòng)劑包括但不限于：包括imiquimod和r848在內(nèi)的imidazoquinolines類tlr7/tlr8激動(dòng)劑；包括852a在內(nèi)的tlr7激動(dòng)劑；包括vtx-2337在內(nèi)的tlr8激動(dòng)劑；包括imo-2055、cpg7909、mgn1703和其它c(diǎn)pgodn(含cpg脫氧寡核苷酸)在內(nèi)的tlr9激動(dòng)劑；包括卡介苗(bcg)在內(nèi)的tlr2/tlr4激動(dòng)劑；包括om-174、monophosphoryllipida(mpl)、aminoalkylglucosaminephosphates和其它類脂a(lipida)類似物在內(nèi)的tlr4激動(dòng)劑；包括病毒核酸、細(xì)菌核酸在內(nèi)的tlr9激動(dòng)劑；包括細(xì)菌鞭毛蛋白在內(nèi)的tlr5激動(dòng)劑；包括酵母多糖在內(nèi)的tlr2/tlr6激動(dòng)劑；包括聚肌苷酸胞嘧啶核苷酸(polyic)、病毒雙鏈rna或其模擬物在內(nèi)的tlr3激動(dòng)劑和包括病毒單鏈rna或其模擬物在內(nèi)的tlr7/tlr8激動(dòng)劑[adamsjletalnatrevdrugdiscov.2015sep；14(9)：603-22]?！皳p傷相關(guān)的模式分子”：損傷相關(guān)的模式分子(damage-associatedmolecularpatterns，damps)可以做本發(fā)明提供的重組改構(gòu)豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白的佐劑。damps是由損傷細(xì)胞釋放的、能激發(fā)固有免疫應(yīng)答自身細(xì)胞成分。damps能通過prr激發(fā)機(jī)體的固有免疫應(yīng)答。這些damp包括但不限于：熱休克蛋白、hmgb1(high-mobilitygroupbox1)、hyaluronan片段、glycans、glycoconjugates、atp(adenosine5’-triphosphate)、腺苷酸、尿酸、s100蛋白、heparinsulfate、galectins、細(xì)胞核dna、n-formylatedpeptides、antimicrobialpeptides、線粒體dna和calreticulin[kryskodvetal.natrevcancer.2012dec；12(12)：860-75；pouwelssdetal.mucosalimmunol.2014mar；7(2)：215-26]?！碍h(huán)二核苷酸”環(huán)二核苷酸及其模擬物可以作為本發(fā)明提供的重組改構(gòu)豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白的佐劑。環(huán)二核苷酸(cyclicdinucleotides，cdns)[cell，2013154(5)，962-970]來源于細(xì)菌，也可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)合成。細(xì)菌cdns包括但不限于環(huán)二鳥苷酸(cyclicdi-gmp，cdg)、環(huán)二腺苷酸(cyclicdi-amp，cda)和環(huán)腺苷酸-鳥苷酸(cyclicamp-gmp，camp-gmp)。細(xì)菌cdn是一類pamp，可激動(dòng)固有免疫應(yīng)答。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中也可出現(xiàn)cdn，如環(huán)鳥苷酸-腺苷酸(cyclicguanosinemonophosphate-adenosinemonophosphate，cgamp)[wujetal.science.2013feb15；339(6121)：826-3]也可激動(dòng)固有免疫應(yīng)答?！懊庖呖c(diǎn)抑制物”：免疫卡點(diǎn)抑制物(immunecheckpointinhibitor)可以作為本發(fā)明提供的重組改構(gòu)豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白的佐劑。免疫卡點(diǎn)抑制物是能抑制免疫卡點(diǎn)分子功能的物質(zhì)[meleroietal.natrevcancer.2015aug；15(8)：457-72]。抑制免疫卡點(diǎn)分子的功能使免疫細(xì)胞激活的信號(hào)得以突顯，因而使免疫細(xì)胞處于持續(xù)的激活狀態(tài)。處于持續(xù)激活狀態(tài)的cd4+t細(xì)胞會(huì)輔助b細(xì)胞產(chǎn)生抗體，也輔助cd8t細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞如病毒感染細(xì)胞。因此，維持t細(xì)胞激活狀態(tài)的制劑如免疫加點(diǎn)抑制物會(huì)提高抗原或疫苗在個(gè)體的免疫效力。免疫卡點(diǎn)抑制劑抑制的免疫卡點(diǎn)分子包括但不限于ctla4、pd1、lag3(lymphocyteactivationgene3)、2b4(cd244)、btla(bandtlymphocyteattenuator)、tim3(tcellmembraneprotein3)和a2ar(adenosinea2areceptor)[pardolldm.natrevcancer.2012mar22；12(4)：252-64]。能抑制免疫卡點(diǎn)功能的抗體屬免疫卡點(diǎn)抑制物，包括但不限于ctla-4抗體、cd-1抗體和cd-l抗體?！肮泊碳な荏w激活劑”：共受體激活劑可以作為本發(fā)明提供的重組改構(gòu)豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白的佐劑。共刺激受體是表達(dá)在免疫細(xì)胞表面的受體，在受到激活劑激活后介導(dǎo)免疫細(xì)胞激活信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，因而促進(jìn)個(gè)體對(duì)抗原或疫苗的免疫反應(yīng)。共刺激受體激活劑是通過結(jié)合共刺激受體后激活免疫細(xì)胞的制劑。共刺激受體激活性單克隆抗體(co-stimulatoryreceptoractivatingmonoclonalantibody)是共刺激受體激活劑，可增強(qiáng)抗原或疫苗的效力。這類激活性單克隆抗體靶向的共刺激受體(co-stimulatoryreceptor)包括但不限于cd137(41bb)、ox40、cd40、gitr、icos和cd27(glucocorticoid-inducedtumournecrosisfactorreceptorfamily-relatedprotein)[meleroietal.natrevcancer.2015aug；15(8)：457-72；sanmamedmfetal.seminoncol.2015aug；42(4)：640-55]。“細(xì)胞因子”：細(xì)胞因子可作為本發(fā)明提供的重組改構(gòu)豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白的佐劑。這些細(xì)胞因子包括但不限于：白細(xì)胞介素2(il-2)、粒細(xì)胞集落刺激因子(g-csf)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactor)gm-csf)和干擾素α?！耙呙缃M合物”：本發(fā)明提供的重組改構(gòu)豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白可與藥物學(xué)上可接受的載體(pharmaceuticallyacceptablecarrier)組成疫苗組合物。該組合物中的重組改構(gòu)豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白的使用劑量為免疫有效劑量(immunologicallyeffectivedosages)。該疫苗組合物可被制成一定的劑型，這些劑型包括但不限于溶液、乳化液、脂質(zhì)體和凍干粉等。在疫苗組合物中可含有佐劑?！奥?lián)合應(yīng)用”本發(fā)明提供的重組改構(gòu)豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白可以和佐劑聯(lián)合應(yīng)用，可以和豬圓環(huán)病毒疫苗聯(lián)合應(yīng)用，也可以和豬用疫苗聯(lián)合應(yīng)用。聯(lián)合應(yīng)用是指將重組改構(gòu)豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白和佐劑、豬圓環(huán)病毒疫苗和其它豬用疫苗指組合成一個(gè)制劑(疫苗組合物)一起應(yīng)用，也指將重組改構(gòu)豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白佐劑、豬圓環(huán)病毒疫苗和其它豬用疫苗分開應(yīng)用?！八幬飳W(xué)可接受的載體”：本發(fā)明提供的重組改構(gòu)豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白可與藥物學(xué)上可接受的載體(pharmaceuticallyacceptablecarrier)組成疫苗組合物。藥物學(xué)可接受的載體(pharmaceuticallyacceptablecarrier)是指一種或多種固體或液體的填充劑、稀釋劑或包封物質(zhì)。這類載體適合將本發(fā)明提供的重組改構(gòu)豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白應(yīng)用于個(gè)體。該載體可以是有機(jī)的、無機(jī)的，天然的或合成的。藥物學(xué)可接受的載體可以是藥學(xué)可接受的溶劑(水溶液和非水溶液)、分散劑、懸濁劑、乳化劑、粉劑、稀釋劑、脂質(zhì)體、抗菌劑、抗真菌劑、等滲制劑、延緩吸收制劑、凍干保護(hù)劑和其他的適合與本發(fā)明提供的重組改構(gòu)豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白一起應(yīng)用提高其免疫效力的制劑。水溶液包括但不限于水、生理鹽水、pbs緩沖液、平衡鹽溶液和葡萄糖溶液。溶劑或分散劑可包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)，也包括由這些溶劑或分散劑組成的混合物。為了維持藥物組合物的流動(dòng)性可應(yīng)用包括卵磷脂在內(nèi)的脂類。為了使疫苗組合物處于理想的顆粒狀態(tài)可以應(yīng)用表面活性劑。為了有合適的滲透壓，可在疫苗組合物中添加糖、包括甘露醇和山梨醇在內(nèi)的多元醇和氯化鈉等。為了延長(zhǎng)作用時(shí)間，可在藥物組合物中加入緩釋劑如硬脂酸鹽和明膠。乳化劑可包括水包油乳化劑、油包水乳化劑或水包油包水乳化劑。藥物學(xué)可接受的載體也包括藥學(xué)可接受的抗氧化劑(pharmaceutically-acceptableantioxidants)，這些抗氧化劑包括水溶性抗氧化劑，如ascorbicacid，cysteinehydrochloride，sodiumbisulfate，sodiummetabisulfite和sodiumsulfite等；油溶性抗氧化劑，如ascorbylpalmitate，butylatedhydroxyanisole(bha)，butylatedhydroxytoluene(bht)，lecithin，propylgallate和alpha-tocopherol等；金屬螯合劑，如枸櫞酸、ethylenediaminetetraaceticacid(edta)、sorbitol、tartaricacid和phosphoricacid等?！懊庖哂行┝俊保罕景l(fā)明所提供的重組改構(gòu)豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白的免疫有效劑量(immunologicallyeffectivedosages)是給個(gè)體應(yīng)用后誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答劑量。在疫苗和疫苗組合物中應(yīng)用重組改構(gòu)豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白采用免疫有效劑量。免疫有效劑量的多少?zèng)Q定于本領(lǐng)域技術(shù)熟練人員應(yīng)知的標(biāo)準(zhǔn)，還要參考其他因素，這些因素包括并不限于個(gè)體的大小、健康情況和疾病嚴(yán)重程度等。本發(fā)明提供的重組改構(gòu)豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白可單次或多次應(yīng)用于個(gè)體，每次的劑量范圍可在1μg到1000mg。為了達(dá)到理想的效果，本領(lǐng)域技術(shù)熟練人員可以對(duì)此重組改構(gòu)豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白的劑量作調(diào)整，其劑量范圍可以是前述范圍的10倍到1000倍?！敖o藥途徑”：本發(fā)明提供的重組改構(gòu)豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白在應(yīng)用時(shí)可采用腸外、外用或吸入的給藥途徑。腸外給藥途徑包括經(jīng)靜脈、腹腔、鞘內(nèi)、肌肉、皮下、皮內(nèi)和局部淋巴結(jié)內(nèi)注射。附圖說明：圖1：pet28a(+)質(zhì)粒圖譜及多克隆位點(diǎn)圖2：c2編碼基因的瓊脂糖凝膠電泳圖3：重組改構(gòu)pcv2b衣殼蛋白(c2)工程菌的sds-page鑒定圖4：c2工程菌發(fā)酵所獲菌體菌體蛋白的sds-page分析圖5：純化c2的sds-pade分析圖6由c2組裝成的類病毒樣顆粒(電鏡下觀察)圖7重組改構(gòu)pcv2b衣殼蛋白(c2)在小鼠的免疫效力圖8重組改構(gòu)pcv2b衣殼蛋白(c2)在豬的免疫效力圖9c2和d重組蛋白誘導(dǎo)誘騙抗體的比較圖10cβ編碼基因片段的pcr鑒定圖11pfastbacdual的圖譜圖12重組桿狀病毒bac-2cβ的獲取圖13重組改構(gòu)pcv2b衣殼蛋白(cβ)表達(dá)的鑒定(sds-page/westernblot)圖14重組改構(gòu)pcv2b衣殼蛋白(cβ)組裝成的類病毒樣顆粒(電鏡下觀察)圖15純化重組改構(gòu)pcv2b衣殼蛋白(cβ)的鑒定(sds-page)圖16重組改構(gòu)pcv2b衣殼蛋白(cβ)在小鼠的免疫效力圖17cβ和d重組蛋白誘導(dǎo)誘騙抗體的比較圖18pmd18-t&pmd19-t載體質(zhì)粒的圖譜具體實(shí)施方法：實(shí)施例1由大腸桿菌偏好密碼子組成的pcv2b衣殼蛋白(cp)編碼基因的獲?。翰捎枚噍喆罱觩cr(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))構(gòu)建由大腸桿菌偏好密碼子組成的pcv2b衣殼蛋白(cp)編碼基因，該基因編碼的蛋白質(zhì)也被稱為d蛋白[fangm，etal.intervirology.2015；58(5)：318-23]。將pcv2b衣殼蛋白(cp)編碼基因克隆到到t載體質(zhì)粒(takara，圖-18)。pcv2b衣殼蛋白(cp)編碼基因具有如序列表<400>1所示的序列。用dna測(cè)序確定了其序列的正確性。實(shí)施例2重組改構(gòu)pcv2b衣殼蛋白(c2)編碼基因的獲?。阂詐cv2bcp編碼基因(<400>1)為模板，采用pcr和分子克隆的方法獲得獲得改構(gòu)pcv2b衣殼蛋白(c2)編碼基因，c2編碼基因具有如序列表<400>2所示的序列。獲得c2編碼基因的基本方法是：(1)獲取重組改構(gòu)pcv2b衣殼蛋白編碼基因a片段以pcv2b衣殼蛋白(cp)編碼基因(序列表<400>1)編碼基因?yàn)槟０澹捎胮cr獲得重組改構(gòu)pcv2b衣殼蛋白編碼基因a片段。采用的特異性pcr上游引物帶ncoi限制性內(nèi)切酶切位點(diǎn)(ccatgg)，下游引物帶有bamhi限制性內(nèi)切酶切位點(diǎn)(ggatcc)。(2)獲取重組改構(gòu)pcv2b衣殼蛋白編碼基因b片段以pcv2b衣殼蛋白(cp)編碼基因(序列表<400>1)為模板，采用pcr獲得重組改構(gòu)pcv2b衣殼蛋白編碼基因b片段，采用的特異性pcr上游引物帶有bglii限制性內(nèi)切酶切位點(diǎn)(agatct)，下游引物帶有xhoi限制性內(nèi)切酶切位點(diǎn)(ctcgag)。(3)獲取重組改構(gòu)pcv2b衣殼蛋白(c2)編碼基因?qū)⒏臉?gòu)pcv2b衣殼蛋白編碼基因a片段(a片段)做2％瓊脂糖凝膠電泳。采用北京鼎國(guó)公司的dna回收試劑盒回收a片段。將回收的a片段連接入t載體質(zhì)粒(takara，圖-18)，獲得含載有a片段的t載體質(zhì)粒，簡(jiǎn)稱為t-a。將t-a轉(zhuǎn)化入jm109大腸桿菌(簡(jiǎn)稱為jm109)(novagen公司)。將轉(zhuǎn)化物劃線接種到lb半固體培養(yǎng)板，蓋蓋，將平板倒置(底朝上)，37℃恒溫孵箱培養(yǎng)12-14小時(shí)。挑選陽性克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)后，提取t-a。按上述方法將改構(gòu)pcv2b衣殼蛋白編碼基因b片段(簡(jiǎn)稱b片段)連接入t載體質(zhì)粒(takara，圖-18)，獲得含載有b片段的t載體質(zhì)粒，簡(jiǎn)稱為t-b。將t-b轉(zhuǎn)化入jm109，挑選陽性克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)后，提取t-b。用ncoi和bamhi消化t-a，釋放出帶ncoi和bamh粘性末端的a片段。以ncoi和bamhi消化pet-28a(+)質(zhì)粒，回收線性質(zhì)粒。將帶ncoi和bamh粘性末端的a片段和經(jīng)限制性內(nèi)切酶以ncoi和bamhi消化pet-28a(+)質(zhì)粒(圖-1，美國(guó)novagen公司)相連接，獲得載有改構(gòu)pcv2b衣殼蛋白編碼基因a片段的重組pet-28a(+)質(zhì)粒(pet-28a(+)-a)。將pet-28a(+)-a轉(zhuǎn)化入大腸桿菌bl21(bl21(de3)。劃線接種到lb半固體培養(yǎng)板，蓋蓋，將平板倒置(底朝上)，37℃恒溫孵箱培養(yǎng)12-14小時(shí)。挑選陽性克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)后，提取pet-28a(+)-a質(zhì)粒。用bamhi和xhoi消化pet28a-a，回收帶bamhi和xhoi粘性末端的pet28a-a線性質(zhì)粒。用bgl2和xhoi消化t-b，釋放出帶bgl2和xhoi粘性末端的b片段，回收b片段。將此b片段以bamhi和xhoi切點(diǎn)插入到pet28a-a質(zhì)粒，獲得了pet28a-a-b重組質(zhì)粒。pet28a-a-b重組質(zhì)粒即為攜帶改構(gòu)pcv2b衣殼蛋白(c2)編碼基因(具有如<400>2所示的序列)的pet28a重組質(zhì)粒，被命名為pet28a-c2。在pet28a-c2中，c2編碼基因的開放閱讀框架始于ncoi切點(diǎn)中的atg，止于六聚組氨酸編碼基因下游的taa，共729bp，編碼由242個(gè)氨基酸殘基組成的重組改構(gòu)pcv2b衣殼蛋白，該重組改構(gòu)pcv2b衣殼蛋白被稱為c2。c2具有如序列<400>3所示的氨基酸序列，由242個(gè)氨基酸殘基組成，分子量約為28.64kd，等電點(diǎn)約為10.55。c2不含pcv2b衣殼蛋白的誘騙表位，該誘騙表位被pcv2b衣殼蛋白的一保護(hù)性抗體誘生表位替代。c2編碼基因編碼的重組改構(gòu)pcv2b衣殼蛋白(c2)具有如序列表<400>3所示的氨基序列。將pet28a-c2轉(zhuǎn)化入bl21大腸桿菌(de3)(novagen)，將轉(zhuǎn)化物劃線接種到lb半固體培養(yǎng)板，蓋蓋，將平板倒置(底朝上)，37℃恒溫孵箱培養(yǎng)12-14小時(shí)。挑選陽性克隆，提取pet-28a-c2。將pet28a-c2用ncoi和xhoi消化鑒定，消化條件如下：混合后，于37℃溫育100分鐘。對(duì)消化產(chǎn)物做瓊脂糖凝膠電泳(圖-2)。結(jié)果表明：用ncoi和xhoi可以從pet28a-c2中釋放出c2編碼基因(約729bp)。采用t7啟動(dòng)子引物對(duì)pet28a-c2中的c2編碼基因進(jìn)行dna測(cè)序[生工生物工程(上海)股份有限公司]，結(jié)果表明：c2編碼基因的序列(序列表<400>2)和設(shè)計(jì)的一致。實(shí)施例3重組改構(gòu)pcv2b衣殼蛋白(c2)的表達(dá)：將經(jīng)ncoi和xhoi酶切鑒定的pet28a-c2轉(zhuǎn)化bl21大腸桿菌(de3)(novagen)制備表達(dá)c2(序列表<400>3)的工程菌凍干菌種，具體方法如下：取30mllb培養(yǎng)基(胰蛋白胨1％，酵母浸出粉0.5％，氯化鈉1％)至100ml潔凈錐形瓶?jī)?nèi)，加入瓊脂粉0.45g，混勻，透氣封口，用線繩纏繞固定，高壓滅菌。在超凈工作臺(tái)中，待錐形瓶溫度降低(錐形瓶壁剛不燙手背)后，立即加入15μl的100mg/ml卡那霉素(kan)(kan的終濃度50μg/ml)，迅速混勻，將液體均分的2個(gè)高壓過的培養(yǎng)皿中，制成lb半固體培養(yǎng)板。將pet28a-c2按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化入bl21大腸桿菌。將轉(zhuǎn)化菌液劃線接種到lb半固體培養(yǎng)板，蓋蓋，將平板倒置(底朝上)，37℃恒溫孵箱培養(yǎng)12-14小時(shí)。用滅菌的吸管分別吸取lb半固體培養(yǎng)板3個(gè)劃線上的獨(dú)立的菌落接種到這三個(gè)錐形瓶(標(biāo)為a、b、c)中。瓶中各含53mllb培養(yǎng)基(加入30μl的卡那霉素(100mg/ml)。放入37℃恒溫?fù)u床中，設(shè)定轉(zhuǎn)速為200rpm，培養(yǎng)3--5小時(shí)。當(dāng)培養(yǎng)基od600值達(dá)0.6-1.0時(shí)，開始制備凍干菌并對(duì)其鑒定。在超凈臺(tái)內(nèi)，自a、b、c搖瓶中，分別用無菌的加樣器頭吸取200μl菌液至3個(gè)1.5mlep管中，作為誘導(dǎo)前樣品；另用無菌的加樣器頭吸取1ml菌液至3個(gè)滅菌的20ml玻璃試管中，加入0.5μl1miptg，在37℃恒溫?fù)u床中以200rpm培養(yǎng)3小時(shí)。將含誘導(dǎo)前菌液樣品的ep管離心1min(11000rpm)，用加樣器吸棄上清，用20μl蒸餾水溶解沉淀物，用加樣器吹打混勻，加入20μl2×上樣緩沖液，此為誘導(dǎo)前菌液sdspage樣品(a，b，c誘導(dǎo)前)。取20μl誘導(dǎo)3小時(shí)菌液至3個(gè)1.5mlep管中，加入20μl2×上樣緩沖液，此為誘導(dǎo)后菌液sdspage樣品(a，b，c誘導(dǎo)后)。在電泳前，對(duì)誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)后菌液sdspage樣品做煮沸處理：將樣品管插在浮漂上(管口應(yīng)高出＝面至少1cm)，將浮漂置于沸水中，煮沸5min。將樣品管離心(11000rpm)5分鐘，取10μl上清上樣，做sdspage分析(圖-3)。將剩余菌液[(a，b，c)各約40ml]，離心(采用久保田離心機(jī))，3000轉(zhuǎn)，10分鐘，棄上清。置冰上，在沉淀中分別加入20％脫脂乳1.5ml，10％谷氨酸鈉1.5ml，混勻，分裝至高壓過的3ml西林瓶中，每瓶0.6ml，共15瓶(a，b，c各三瓶)，蓋蓋(保證蓋的通氣口透氣)。將西林瓶(a1-5，b1-5，c1-5)至-70℃預(yù)凍，12小時(shí)。迅速將預(yù)凍的西林瓶置于凍干機(jī)中，凍干24小時(shí)。封蓋，-20℃貼標(biāo)簽，入庫。從c2工程菌種制備甘油菌種，將甘油菌種發(fā)酵培養(yǎng)表達(dá)c2。發(fā)酵在10升的發(fā)酵罐中進(jìn)行。在發(fā)酵菌液的od600達(dá)70時(shí)加iptg誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)培養(yǎng)的溫度為37℃。誘導(dǎo)開始前取發(fā)酵菌液1ml。從中取出20μl菌液，加20μl2×sds-page加樣緩沖液，混合，制備誘導(dǎo)前菌體裂解液(用于sds-page電泳)，4℃保存。誘導(dǎo)2小時(shí)后，取誘導(dǎo)后菌液并離心(8℃，3500rpm，10分鐘)收集菌體。收集的菌體于-70℃保存。將誘導(dǎo)后菌液做16倍稀釋后，取20μl加2×sds-page加樣緩沖液混合，混勻，此為誘導(dǎo)后(后)樣品。sds-page的分析表明，c2工程菌高水平表達(dá)了c2蛋白(圖-4)。實(shí)施例4重組改構(gòu)pcv2b衣殼蛋白(c2)的純化及組裝：將發(fā)酵獲得的c2工程菌置于500ml不銹鋼杯中，冰上融化，加入200ml裂菌緩沖液(4℃)，用攪拌器攪拌，調(diào)節(jié)電動(dòng)攪拌器保持在低轉(zhuǎn)速，攪拌上述菌體混合物15分鐘，使菌體分散均勻，無塊狀菌體，冰上放置備用。用高壓均質(zhì)機(jī)(950-1050bar)裂解菌體，裂10個(gè)循環(huán)。將裂解物分別移入50ml離心管內(nèi)，離心分離(11000r/min，4℃，20分鐘)。離心后，留取上清，移入500ml玻璃瓶中，立即上柱純化。采用sepharose4b鎳親和層析純化c2。以4個(gè)柱體積用的niso4·6h2o溶液(100.0mmol/l)將鎳離子吸附到sepharose4b上，流速1.0ml/min。以平衡緩沖液1(tris0.02m，nacl0.5m，咪唑0.5m，ph8.0)平衡sepharose4b鎳親和層析柱(簡(jiǎn)稱鎳柱)，用4個(gè)柱體積，流速1.0ml/min。接著以平衡緩沖液2(tris0.02m，nacl0.5m，咪唑0.01m，0.01mβ-巰基乙醇，5％甘油，0.05％tween80，ph8.0)平衡鎳柱。用4個(gè)柱體積，流速1.0ml/min。用平衡2緩沖液將離心收集的c2工程菌裂解物上清稀釋1倍，啟動(dòng)恒流泵上樣，流速1ml/min。用洗滌緩沖液(tris0.02m，nacl0.5m，咪唑0.04m，0.01mβ-巰基乙醇，5％甘油，0.05％tween80，ph8.0)過夜洗滌，流速為0.3ml/min。用洗脫緩沖液(tris0.02m，nacl0.5m，咪唑0.5m，0.05mβ-巰基乙醇，5％甘油，0.05％tween80，ph8.0)洗脫c2。用于sds-page檢測(cè)純化的c2的純度、分子量和含量(圖-5)。將純化的c2在4℃條件下，采用組裝液(na2hpo450.0mm，nah2po450.0mm，nacl0.50m，tween800.03％，edtana2.2h2o，ph＝6.5)透析10小時(shí)。在透析后，c2組裝成了病毒樣顆粒(圖-6)。實(shí)施例5重組改構(gòu)pcv2b衣殼蛋白(c2)在小鼠的免疫效力：采用c2疫苗免疫小鼠。在免疫后分離血清，用滅活圓環(huán)病毒(pcv2b)包板做elisa檢測(cè)抗體。5.1免疫小鼠5.1.1小鼠icr小鼠(吉林大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物室)，雌性，體重為17-18克。5.1.2抗原c2蛋白5.1.3佐劑水包油(白油)乳化劑5.1.4疫苗的配制用水包油(白油)乳化劑乳化c2制成c2疫苗，每100μl疫苗中含3μgc2。5.1.5免疫小鼠將小鼠隨機(jī)分成c2疫苗組和pbs組，每組11只。在第0天和第14天各免疫1次，方法是右后肢單點(diǎn)肌肉注射注射100μlc2疫苗或100μlpbs。兩組小鼠分籠飼養(yǎng)。接種前采血，確定小鼠為pcv2b特異性抗體陰性。5.1.6免疫后采血在2次免疫后14天自小鼠尾靜脈采血，采血量≥100μl。將采集的全血(1.5mlep管中)室溫放置30分鐘。11000rpm離心15分鐘，收集血清，分裝，-20℃保存。5.2小鼠血清中的圓環(huán)病毒(pcv2b)特異性抗體檢測(cè)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(elisa)檢測(cè)血清中的pcv2b特異性抗體。5.2.1包被抗原滅活圓環(huán)病毒(pcv2b)(天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司，tcid50/ml＝7.0)。5.2.2試驗(yàn)器材酶標(biāo)條(組合式酶標(biāo)板)，0.5mlep管，1.5mlep管，加樣器頭，移液器，多道移液器，平皿(直徑9cm)和刻度玻璃瓶等。5.2.3試劑碳酸鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，nacl(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，kcl(北京化工廠)，na2hpo4·12h2o(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，kh2po4(天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心)，吐溫20(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)，脫脂奶粉(biotopped)，檸檬酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，opd(上海三浦化工有限公司)，30％h2o2(北京化工廠)，濃硫酸(北京化工廠)和戊二醛(天津市福晨化學(xué)試劑廠)。5.2.4實(shí)驗(yàn)步驟(1)用滅活pcv2b(1∶50稀釋)包被酶標(biāo)板，包被液是含0.8％戊二醛的pbs，100μl/孔，4℃過夜；(2)用含5％脫脂奶粉的洗滌液封閉，200μl/孔，37℃2小時(shí)。洗滌液為含0.05％吐溫20的pbs(7.3mol/lnacl，3mmol/lkcl，10mmol/lna2hpo4·12h2o，17.6mmol/lkh2po4)；(3)洗滌，甩干液體，用洗滌液洗滌，300μl/孔，室溫3min，重復(fù)洗滌兩次；(4)加入用封閉液1∶100稀釋的小鼠血清，100μl/孔，4℃過夜；(5)吸棄液體，洗滌，洗滌液及方法同上；(6)加酶標(biāo)抗體。甩干液體，用洗滌液洗滌，300μl/孔，室溫3min，甩干液體，重復(fù)洗滌兩次。加入用封閉液1∶2500稀釋的辣根過氧化物酶(hrp)標(biāo)記的(羊抗小鼠)igg，100μl/孔，37℃1小時(shí)；(7)顯色。甩干液體，用洗滌液洗滌，300μl/孔，室溫3min，甩干液體，重復(fù)洗滌兩次。加入底物液100μl/孔，37℃避光顯色15min。10ml底物液(即配即用)的配制方法是：取1ml10x甲乙液，加雙蒸水9ml、opd10μg(充分溶解)和15μl30％h2o2。10x甲乙液由10x甲液(0.914mol/l檸檬酸)和10x乙液(2mol/lna2hpo4.12h2o)按47.2體積：50體積比配成；(8)用終止液(硫酸2mmol/l)終止酶顯色反應(yīng)，50ul/孔；(9)用酶標(biāo)儀(492nm)測(cè)od值并拍照。5.3結(jié)果c2能在小鼠誘導(dǎo)出pcv2b特異性抗體(圖-7)，p＜0.01。這說明重組改構(gòu)pcv2b衣殼蛋白可以作為抗原被用于抗豬圓環(huán)病毒感染疫苗的制備，也說明重組改構(gòu)pcv2b衣殼蛋白可被用做抗原來檢測(cè)豬圓環(huán)病毒特異性抗體。實(shí)施例6重組改構(gòu)pcv2b衣殼蛋白(c2)在豬的免疫效力：采用c2疫苗免疫豬。在免疫后分離血清，用科前豬圓環(huán)2型elisa抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)抗體判斷疫苗的效力。平行采用瑞普諸元妥疫苗和科前科圓寧進(jìn)行相同的實(shí)驗(yàn)做疫苗效力比較。實(shí)驗(yàn)在天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司完成。6.1免疫豬6.1.1豬14-21日齡健康易感仔豬，pcv2抗體陰性、pcv2抗原陰性。6.1.2疫苗瑞普諸元妥疫苗(效價(jià)10725tcid50/ml)、科前科圓寧、c2蛋白(序列表<400>3)疫苗(運(yùn)用量100μg/頭份，按水油比3∶1的比例用白油乳化劑配制)6.1.3免疫頸部肌肉注射疫苗2ml疫苗。6.1.4觀察記錄記錄豬群健康狀況、生長(zhǎng)發(fā)育情況、比較接種不同疫苗的豬生長(zhǎng)均勻度等。6.1.5采血在免疫后第6周采集血清。6.2特異性抗體檢測(cè)采用科前豬圓環(huán)2型elisa抗體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行結(jié)果判定(陽性：od450值＞0.43；陰性：od450值＜0.25)。6.3結(jié)果如圖-8所示，在免疫后第6周，c2蛋白(序列表<400>3)疫苗誘生的圓環(huán)病毒特異性抗體高于諸元妥疫苗誘生的圓環(huán)病毒特異性抗體、顯著高于科圓寧誘生的圓環(huán)病毒特異性抗體。此外，在免疫后第6周觀察到的生產(chǎn)性能顯示，接種瑞普諸元妥疫苗和接種c2蛋白疫苗組的豬生長(zhǎng)均勻、被毛光滑、精神狀態(tài)好；接種科圓寧組豬略顯瘦弱，生長(zhǎng)均勻度較差。這說明重組改構(gòu)pcv2b衣殼蛋白可以作為抗原被用于抗豬圓環(huán)病毒感染疫苗的制備，也說明重組改構(gòu)pcv2b衣殼蛋白可被用做抗原來檢測(cè)豬圓環(huán)病毒特異性抗體。實(shí)施例7c2和d重組蛋白誘導(dǎo)誘騙抗體的比較：采用c2和d重組蛋白抗原疫苗免疫小鼠。在免疫后分離血清，用pcv2衣殼蛋白(169-180)寡肽包板做elisa檢測(cè)抗體。7.1免疫小鼠7.1.1小鼠icr小鼠(吉林大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物室)，雌性，體重為17-18克。7.1.2抗原d蛋白(簡(jiǎn)稱d)是采用大腸桿菌表達(dá)的pcv2b衣殼蛋白[fangm，etal.intervirology.2015；58(5)：318-23]，由如序列表<400>1所示的dna編碼。d蛋白能組裝成病毒樣顆粒(viruslikeparticls，vlps)。采用sds-page檢測(cè)，d蛋白(d)顯示為分子量為28.9kd的區(qū)帶。在電鏡下(4萬倍放大)觀察，d蛋白形成的vlp的大小約為17nm，該vlp和圓環(huán)病毒顆粒在形態(tài)上幾乎一樣。d蛋白是全長(zhǎng)的重組pcv2b衣殼蛋白，含圓環(huán)病毒衣殼蛋白的逃逸表位[cp(169-180)]。c2蛋白(序列表<400>3)，簡(jiǎn)稱c2。7.1.3佐劑水包油(白油)乳化劑7.1.4疫苗的配制用水包油(白油)乳化劑乳化d或c2，制成d蛋白疫苗和c2疫苗，每100μl疫苗中含2.5μg抗原。7.1.5免疫小鼠于第0天對(duì)小鼠進(jìn)行初次免疫，方法是注射100μld蛋白疫苗或c2疫苗，注射部位是右后肢肌肉，單點(diǎn)注射。于第14天對(duì)小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫，方法同上。7.1.6免疫前采血在初次免疫前一天采集待免疫小鼠血清。經(jīng)小鼠尾靜脈采血，采血量≥100μl。將采集的全血(1.5mlep管中)室溫放置30分鐘。11000rpm離心15分鐘，收集血清，分裝，-20℃保存。7.1.7.免疫后采血在1免后14天，2免后14、28、42天，采小鼠、分離血清，方法如免疫前采血(8.1.6)。7.2免疫小鼠血清抗體檢測(cè)采用elisa檢測(cè)血清中的特異性抗體7.2.1包被抗原采用pcv2衣殼蛋白(169-180)寡肽[也稱cp(169-180)]做包被抗原[trible，b.r.，etal.journalofvirology，2012，86，13508-13514；triblebr，etal.2011.clin.vaccineimmunol.18：749-757；triblebr，etal.2012.vaccine30：4079-4085]。7.2.2試驗(yàn)器材酶標(biāo)條(組合式酶標(biāo)板)，0.5mlep管，1.5mlep管，加樣器頭，移液器，多道移液器，平皿(直徑9cm)，刻度玻璃瓶。7.2.3試劑碳酸鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，nacl(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，kcl(北京化工廠)，na2hpo4·12h2o(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，kh2po4(天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心)，吐溫20(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)，脫脂奶粉(biotopped)，檸檬酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，opd(上海三浦化工有限公司)，30％h2o2(北京化工廠)，濃硫酸(北京化工廠)和戊二醛(天津市福晨化學(xué)試劑廠)。7.2.4elisa的基本步驟(1)用cp(169-180)(4μg/ml)在碳酸鹽緩沖液(15mmol/l碳酸鈉和35mmol/l碳酸氫鈉水溶液)中包被96孔酶標(biāo)板，100μl/孔，4℃過夜包被。(2)用含5％脫脂奶粉的洗滌液封閉，150μl/孔，37℃1小時(shí)洗滌液為含0.05％吐溫20的pbs(7.3mol/lnacl，3mmol/lkcl，10mmol/lna2hpo4·12h2o，17.6mmol/lkh2po4)；(3)洗滌，甩干液體，用洗滌液洗滌，300μl/孔，室溫3min，重復(fù)洗滌兩次；(4)加入用封閉液1∶10000稀釋的小鼠血清，100μl/孔，4℃過夜；(5)吸棄液體，洗滌，洗滌液及方法同上；(6)加酶標(biāo)抗體，同實(shí)施例5；(7)顯色。同實(shí)施例5；(8)用終止液(硫酸2mmol/l)終止酶顯色反應(yīng)，50ul/孔；(9)用酶標(biāo)儀(492nm)測(cè)od值。7.3結(jié)果如圖-9所示，和d蛋白不同，c2(序列表<400>3)不能誘導(dǎo)針對(duì)圓環(huán)病毒衣殼蛋白逃逸表位的抗體。這說明，c2可以因避免誘生豬圓環(huán)病毒逃逸抗體而作為更有效的抗原被用于制備抗豬圓環(huán)病毒感染的疫苗。實(shí)施例8pcv2b衣殼蛋白編碼基因的獲?。翰捎胮cr(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))方法從感染pcv2b豬淋巴結(jié)細(xì)胞放大出pcv2b全長(zhǎng)衣殼蛋白(cp)的編碼基因，該基因編碼的蛋白被稱為p蛋白，該基因也被稱為p蛋白編碼基因。p蛋白編碼基因被克隆到t載體質(zhì)粒(takara，圖-18)中?？寺∮衟蛋白編碼基因的t-載體質(zhì)粒(t-p)保存在jm109宿主菌中。p蛋白編碼基因具有如序列表<400>4所示的核苷酸序列。實(shí)施例9重組改構(gòu)pcv2b衣殼蛋白(cβ)編碼基因的獲?。阂詐蛋白編碼基因?yàn)槟０?，采用pcr和分子克隆的方法獲得改構(gòu)pcv2b衣殼蛋白(cβ)編碼基因，cβ編碼基因具有如序列表<400>5所示的序列。將cβ編碼基因克隆在t載體質(zhì)粒(takara，圖-18)，獲得攜帶cβ編碼基因的重組t載體質(zhì)粒(t-cβ)，將t-cβ酶切轉(zhuǎn)化入jm109細(xì)胞，獲得克隆菌。以5’引物(agatctgtcgacaacaagccgccaacatgacgtat)和3’引物(acggccaagctttcacttagggttaa)，以t-cβ為模板做pcr，擴(kuò)增的產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳顯示長(zhǎng)度為743bp的片段(圖10)，該長(zhǎng)度與預(yù)期的一致。以m13+(-47)(agggttttcccagtcacg)為測(cè)序引物對(duì)t-cβ中的cβ編碼基因做dna測(cè)序，所測(cè)得的序列與預(yù)計(jì)的完全一致。以t-cβ為模板，采用5’引物(agatctgtcgacaatgacgtat)含有sali切點(diǎn)(gtcgac)和kozak序列()和3’引物(acggccaagctttcacttagggttaa)含有hindiii切點(diǎn)(aagctt)做pcr獲得兩側(cè)帶有sali切點(diǎn)(gtcgac)和hindiii切點(diǎn)(aagctt)的cβ編碼基因(sali-cβ-hindiii)。以t-cβ為模板，采用用5’引物(ctcgagaacaagccgccaacatgacgtat)和3’引物(acggccggtacctcacttagggttaa)做pcr獲得兩側(cè)帶xhoi(ctcgag)和kpni限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)(ggtacc)的cβ編碼基因(xhoi-cβ-kpni)。實(shí)施例10、重組供體質(zhì)粒pfastbacdual-2cβ的獲取作用：將sali-cβ-hindiii克隆入t載體質(zhì)粒(takara，圖-18)，獲得攜帶sali-cβ-hindiii基因的重組t載體質(zhì)粒(t-sali-cβ-hindiii)。將t-sali-cβ-hindiii轉(zhuǎn)化入jm109細(xì)胞中擴(kuò)增，提取t-sali-cβ-hindiii。用sali和hindiii消化t-sali-cβ-hindiii，獲得兩側(cè)帶有sali和hindiii粘性末端的cβ編碼基因。用sali和hindiii消化pfastbacdual(圖-11)獲得線性化的帶有sali和hindiii粘性末端的pfastbacdual。pfastbacdual(invitrogen)是一種含polyhedrin(ph)啟動(dòng)子(簡(jiǎn)稱ph)和p10啟動(dòng)子(簡(jiǎn)稱p10)的轉(zhuǎn)遞質(zhì)粒[于永利微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展，2015年8月第43卷第4期，1-15]，可在大腸桿菌中將ph及其下游的基因(外源基因)和p10及其下游的基因(外源基因)轉(zhuǎn)座到桿狀病毒的基因組dna上?？寺〉絧fastbacdualph和p10下游的外源基因可以是相同的，也可以是不同的。在本發(fā)明中，為了提高表達(dá)量，將同樣的cβ編碼基因分別克隆到pfastbacdualph和p10的下游。具體做法是：將兩側(cè)帶有sali和hindiii粘性末端的cβ編碼基因連接入pfastbacdualph啟動(dòng)子(圖-11)的下游，獲得ph-cβ-pfastbacdual(ph-cβ)。將xhoi-cβ-kpni克隆入t載體質(zhì)粒(takara，圖-18)獲得攜帶xhoi-cβ-kpni基因的t載體質(zhì)粒(txhoi-cβ-kpni)，將txhoi-cβ-kpni轉(zhuǎn)化入jm109細(xì)胞中擴(kuò)增，提取t-xhoi-cβ-kpni。用xhoi和kpni消化t-xhoi-cβ-kpni獲得兩側(cè)帶有xhoi和kpni粘性末端的cβ編碼基因。用xhoi和kpni消化ph-cβ-pfastbacdual(ph-cβ)，獲得線性化的帶有xhoi和kpni粘性末端的ph-cβ-pfastbacdual(ph-cβ)。將兩側(cè)帶有xhoi和kpni粘性末端的cβ編碼基因連接入ph-cβ-pfastbacdual(ph-cβ)p10啟動(dòng)子下游(圖-11)，獲得p10-cβ-ph-cβ-pfastbacdual載體(pfastbacdual-2cβ)。pfastbacdual-2cβ即為攜帶cβ編碼基因的轉(zhuǎn)遞質(zhì)粒。經(jīng)dna測(cè)序鑒定，cβ編碼基因已被正確地克隆到了ph和p10的下游。cβ編碼基因具有如序列表<400>5所示的核苷酸序列。實(shí)施例11、重組桿狀病毒bac-2cβ的獲取及cβ的表達(dá)：將pfastbacdual-2cβ轉(zhuǎn)化至dh10bac感受態(tài)細(xì)胞(invitrogen)。dh10bac感受態(tài)細(xì)胞是攜帶bacmid和輔助質(zhì)粒的大腸桿菌。bacmid[于永利微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展，2015年8月第43卷第4期，1-15]是組裝有細(xì)菌人工染色體(bacterialartificialchromosomes，bacs)的桿狀病毒dna(bvdna)。由于bacs的存在，bacmid可以維持在大腸桿菌中，并可隨大腸桿菌的生長(zhǎng)而擴(kuò)增。對(duì)細(xì)菌而言，bacmid是“大質(zhì)?！?。有了bacmid，并在bacmid上組裝有細(xì)菌tn7轉(zhuǎn)座子，這使外源基因重組到桿狀病毒(bv)的過程得以在細(xì)菌內(nèi)完成。輔助質(zhì)粒編碼轉(zhuǎn)座酶，其編碼的轉(zhuǎn)座酶可將轉(zhuǎn)遞質(zhì)粒上攜帶外源基因的表達(dá)元件借助其兩側(cè)的tn轉(zhuǎn)座子左右“臂”轉(zhuǎn)座入bacmid。在dh10bac感受態(tài)細(xì)胞(invitrogen)中，pfastbacdual-2cβ中的cβ基因表達(dá)元件(expressioncassettes)和bacmid發(fā)生了轉(zhuǎn)座重組，生成了重組bv(bacmid-2cβ)。bacmid-2cβ是具有轉(zhuǎn)染/感染性的重組bvdna，攜帶的cβ基因表達(dá)元件主要由ph啟動(dòng)子和p10啟動(dòng)子及其下游的cβ編碼基因組成。采用含抗慶大霉素半固體培養(yǎng)基對(duì)含有bacmid-2cβ的大腸桿菌進(jìn)行藍(lán)白篩選[于永利微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展，2015年8月第43卷第4期，1-15]。挑取挑取白色單菌落(圖-12)，擴(kuò)增培養(yǎng)，提取bacmid-2cβ。用bacmid-2cβ轉(zhuǎn)染的sf9細(xì)胞，以桿狀病毒(baculovirus)感染sf9細(xì)胞和未轉(zhuǎn)/感染sf9細(xì)胞為對(duì)照。在第三天，轉(zhuǎn)染bacmid-2cβ的和感染桿狀病毒的sf9細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變(圖-12)，提示bacmid-2cβ在sf9細(xì)胞中已組裝成轉(zhuǎn)座有cβ基因表達(dá)元件的重組桿狀病毒(bac-2cβ)，且bac-2cβ已在sf9細(xì)胞中大量復(fù)制。在第8天，轉(zhuǎn)染bacmid-2c’的和感染桿狀病毒的sf9細(xì)胞幾乎全部裂解(圖-12)。取bacmid-2cβ轉(zhuǎn)染第3天后的細(xì)胞培養(yǎng)上清，此為第一代bac-2cβ(bac-2cβ-1)。分裝4℃保存。同時(shí)收取bacmid-2cβ轉(zhuǎn)染細(xì)胞沉淀用于cβ蛋白表達(dá)的鑒定(圖-13)。用bac-2cβ-1感染sf9細(xì)胞，在第5天，細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變，收取上清，此為第二代bac-2cβ(bac-2cβ-2)，分裝4℃保存，同時(shí)收取細(xì)胞沉淀(bac-2cβ-2細(xì)胞沉淀)用于cβ的表達(dá)鑒定(圖-13)。用bac-2cβ-2感染sf9細(xì)胞，在第5天，細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變病變，收取上清，此為第三代bac-2cβ(bac-2cβ-3)，同時(shí)收取細(xì)胞沉淀(bac-2cβ-3細(xì)胞沉淀)用于cβ的表達(dá)鑒定(圖-13)。對(duì)bac-2cβ-1，bac-2cβ-2和bac-2cβ-3也進(jìn)行了pcr鑒定，確定了cβ基因表達(dá)元件的存在。將bac-2cβ-1，bac-2cβ-2和bac-2cβ-3細(xì)胞沉淀用上樣緩沖液裂解做sds-page電泳和westernblot分析。以p蛋白(昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的pcv2b衣殼蛋白)、d蛋白(大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的pcv2b衣殼蛋白)[fangm，etal.intervirology.2015；58(5)：318-23]作為對(duì)照。sds-page結(jié)果顯示，在bac-2cβ-1，bac-2cβ-2和bac-2cβ-3細(xì)胞中均表達(dá)了分子量約為27.7kd的蛋白，分子量大小與預(yù)期一致。westernblot的結(jié)果顯示，這些蛋白可被d蛋白免疫豚鼠血清(1∶100稀釋)識(shí)別。這些結(jié)果(圖13)表明，已獲取了bac-2cβ，bac-2cβ可感染sf9細(xì)胞，并表達(dá)cβ。cβ具有如序列表<400>6所示的氨基酸序列。用bac-2cβ-3感染sf9細(xì)胞，3天后收集細(xì)胞，將收集的細(xì)胞懸于組裝液[(na2hpo4·12h2o(0.05m)，nah2po4·2h2o(0.05m)，nacl(0.5m)，tween80(0.03％)，乙二胺四乙酸二鈉(0.001m)]中，超聲(200w，工作20次，每次5s)裂解細(xì)胞，離心后收取上清，在電鏡(4萬倍放大)下觀察，可見到由cβ組成的顆粒，顆粒的直徑約為20nm(圖-14)。這說明，可組裝成類vlp顆粒。實(shí)施例12重組改構(gòu)pcv2b衣殼蛋白(cβ)在小鼠的免疫效力：采用cβ作為抗原制成的疫苗免疫小鼠。在免疫后分離血清，檢測(cè)血清中的圓環(huán)病毒特異性抗體。12.1免疫小鼠12.1.1小鼠icr小鼠(吉林大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物室)，雌性，體重為17-18克。12.1.2抗原用bac-2cβ-3感染sf9細(xì)胞，3天后收集細(xì)胞，將收集的細(xì)胞懸于組裝液[(na2hpo4·12h2o(0.05m)，nah2po4·2h2o(0.05m)，nacl(0.5m)，tween80(0.03％)，乙二胺四乙酸二鈉(0.001m)]中，采用高壓均質(zhì)機(jī)裂解細(xì)胞(700ba，4個(gè)循環(huán))超聲。離心(4000轉(zhuǎn)，5分鐘)收集上清。上清中含純度＞85％的cβ蛋白(圖-15)。用此cβ蛋白(序列表<400>6)做抗原免疫小鼠。13.1.3佐劑水包油(白油)乳化劑13.1.4疫苗的配制用水包油(白油)乳化劑乳化cβ制成cβ疫苗，每100μl疫苗中含3μgcβ。13.1.5免疫小鼠將小鼠隨機(jī)分成cβ疫苗組和pbs組，每組11只。在第0天和第14天各免疫1次，方法是右后肢單點(diǎn)肌肉注射注射100μlc2疫苗或100μlpbs。兩組小鼠分籠飼養(yǎng)。接種前采血，確定小鼠為pcv2b特異性抗體陰性。13.1.6免疫后采血在2次免疫后14天自小鼠尾靜脈采血，采血量≥100μl。將采集的全血(1.5mlep管中)室溫放置30分鐘。11000rpm離心15分鐘，收集血清，分裝，-20℃保存。13.2小鼠血清中的圓環(huán)病毒(pcv2b)特異性抗體檢測(cè)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(elisa)檢測(cè)血清中的pcv2b特異性抗體。13.2.1包被抗原滅活圓環(huán)病毒(pcv2b)(天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司，tcid50/ml＝7.0)。13.2.2試驗(yàn)器材酶標(biāo)條(組合式酶標(biāo)板)，0.5mlep管，1.5mlep管，加樣器頭，移液器，多道移液器，平皿(直徑9cm)和刻度玻璃瓶等。13.2.3試劑碳酸鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，nacl(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，kcl(北京化工廠)，na2hpo4·12h2o(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，kh2po4(天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心)，吐溫20(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)，脫脂奶粉(biotopped)，檸檬酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，opd(上海三浦化工有限公司)，30％h2o2(北京化工廠)，濃硫酸(北京化工廠)和戊二醛(天津市福晨化學(xué)試劑廠)。13.2.4實(shí)驗(yàn)步驟(1)用滅活pcv2b(1∶50稀釋)包被(瑞普)酶標(biāo)板，包被液是含0.8％戊二醛的pbs，100μl/孔，4℃過夜；(2)用含5％脫脂奶粉的洗滌液封閉，200μl/孔，37℃2小時(shí)。洗滌液為含0.05％吐溫20的pbs(7.3mol/lnacl，3mmol/lkcl，10mmol/lna2hpo4·12h2o，17.6mmol/lkh2po4)；(3)洗滌，甩干液體，用洗滌液洗滌，300μl/孔，室溫3min，重復(fù)洗滌兩次；(4)加入用封閉液1∶100稀釋的小鼠血清，100μl/孔，4℃過夜；(5)吸棄液體，洗滌，洗滌液及方法同上；(6)加酶標(biāo)抗體。甩干液體，用洗滌液洗滌，300μl/孔，室溫3min，甩干液體，重復(fù)洗滌兩次。加入用封閉液1∶2500稀釋的辣根過氧化物酶(hrp)標(biāo)記的(羊抗小鼠)igg，100μl/孔，37℃1小時(shí)；(7)顯色。甩干液體，用洗滌液洗滌，300μl/孔，室溫3min，甩干液體，重復(fù)洗滌兩次。加入底物液100μl/孔，37℃避光顯色15min。10ml底物液(即配即用)的配制方法是取1ml10x甲乙液，加雙蒸水9ml、opd10μg(充分溶解)和15μl30％h2o2。10x甲乙液由10x甲液(0.914mol/l檸檬酸)和10x乙液(2mol/lna2hpo4.12h2o)按47.2體積∶50體積比配成；(8)用終止液(硫酸2mmol/l)終止酶顯色反應(yīng)，50ul/孔；(9)用酶標(biāo)儀(492nm)測(cè)od值并拍照。13.3結(jié)果cβ(序列表<400>6)能在小鼠誘導(dǎo)出pcv2b特異性抗體(圖-16)，p＜0.01。這說明重組改構(gòu)pcv2b衣殼蛋白可以作為抗原被用于抗豬圓環(huán)病毒感染疫苗的制備，也說明重組改構(gòu)pcv2b衣殼蛋白可被用做抗原來檢測(cè)豬圓環(huán)病毒特異性抗體。實(shí)施例13cβ和d蛋白誘導(dǎo)誘騙抗體的比較：采用cβ和d蛋白作為抗原制成的疫苗免疫小鼠。在免疫后分離血清，檢測(cè)血清中由圓環(huán)病毒衣殼蛋白誘騙表位產(chǎn)生的抗體。13.1免疫小鼠13.1.1小鼠icr小鼠(吉林大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物室)，雌性，體重為17-18克。13.1.2抗原d蛋白(簡(jiǎn)稱d)。d蛋白是采用大腸桿菌表達(dá)的pcv2b衣殼蛋白[fangm，etal.intervirology.2015；58(5)：318-23]。d蛋白能組裝成病毒樣顆粒(viruslikeparticls，vlps)。采用sds-page檢測(cè)，d蛋白(d)顯示為分子量為28.9kd的區(qū)帶。在電鏡下(4萬倍放大)觀察，d蛋白形成的vlp的大小約為17nm，該vlp和圓環(huán)病毒顆粒在形態(tài)上幾乎一樣。d蛋白是全長(zhǎng)的重組pcv2b衣殼蛋白，含圓環(huán)病毒衣殼蛋白的逃逸表位[cp(169-180)]。cβ蛋白。用bac-2cβ-3感染sf9細(xì)胞，3天后收集細(xì)胞，將收集的細(xì)胞懸于組裝液[(na2hpo4·12h2o(0.05m)，nah2po4·2h2o(0.05m)，nacl(0.5m)，tween80(0.03％)，乙二胺四乙酸二鈉(0.001m)]中，采用高壓均質(zhì)機(jī)裂解細(xì)胞(700ba，4個(gè)循環(huán))超聲。離心(4000轉(zhuǎn)，5分鐘)收集上清。上清中含純度＞85％的cβ蛋白(圖-15)。用此cβ蛋白(序列表<400>6)做抗原免疫小鼠。13.1.3佐劑水包油(白油)乳化劑13.1.4疫苗的配制用水包油(白油)乳化劑分別乳化d蛋白或c2，制成d蛋白疫苗和cβ疫苗，每100μl疫苗中含2.5μg抗原。13.1.5免疫小鼠于第0天對(duì)小鼠進(jìn)行初次免疫，方法是在右后肢肌肉注射100μld蛋白疫苗或c2疫苗。于第14天對(duì)加強(qiáng)免疫，方法同上。13.1.6免疫前采血在初次免疫前一天采集待免疫小鼠血清。尾靜脈采血，采血量≥100μl。將采集的全血(1.5mlep管中)室溫放置30分鐘。11000rpm離心15分鐘，收集血清，分裝，-20℃保存。13.1.7.免疫后采血在初次免疫后14天，加強(qiáng)免疫后14、28、42天，采小鼠血分離血清，方法如13.1.6。13.2免疫小鼠血清抗體檢測(cè)采用elisa檢測(cè)血清中的特異性抗體13.2.1包被抗原采用pcv2衣殼蛋白(169-180)寡肽，也稱cp(169-180)，做包被抗原[trible，b.r.，etal.journalofvirology，2012，86，13508-13514；triblebr，etal.2011.clin.vaccineimmunol.18：749-757；triblebr，etal.2012.vaccine30：4079-4085]。cp(169-180)是圓環(huán)病毒衣殼蛋白上的誘騙表位。13.2.2試驗(yàn)器材酶標(biāo)條(組合式酶標(biāo)板)，0.5mlep管，1.5mlep管，加樣器頭，移液器，多道移液器，平皿(直徑9cm)和刻度玻璃瓶等。13.2.3試劑碳酸鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，nacl(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，kcl(北京化工廠)，na2hpo4·12h2o(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，kh2po4(天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心)，吐溫20(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)，脫脂奶粉(biotopped)，檸檬酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，opd(上海三浦化工有限公司)，30％h2o2(北京化工廠)，濃硫酸(北京化工廠)和戊二醛(天津市福晨化學(xué)試劑廠)。13.2.4elisa的基本步驟(1)用cp(169-180)(4μg/ml)在碳酸鹽緩沖液(15mmol/l碳酸鈉和35mmol/l碳酸氫鈉水溶液)中包被96孔酶標(biāo)板，100μl/孔，4℃過夜包被。(2)用含5％脫脂奶粉的洗滌液封閉，150μl/孔，37℃1小時(shí)。洗滌液為含0.05％吐溫20的pbs(7.3mol/lnacl，3mmol/lkcl，10mmol/lna2hpo4·12h2o，17.6mmol/lkh2po4)；(3)洗滌，甩干液體，用洗滌液洗滌，300μl/孔，室溫3min，重復(fù)洗滌兩次；(4)加入用封閉液1∶10000稀釋的小鼠血清，100μl/孔，4℃過夜；(5)吸棄液體，洗滌，洗滌液及方法同上；(6)加酶標(biāo)抗體，同實(shí)施例12；(7)顯色。同實(shí)施例12；(8)用終止液(硫酸2mmol/l)終止酶顯色反應(yīng)，50μl/孔；(9)用酶標(biāo)儀(492nm)測(cè)od值。13.3結(jié)果如圖-17所示，和d蛋白不同，cβ(序列表<400>6)不能誘導(dǎo)針對(duì)圓環(huán)病毒衣殼蛋白逃逸表位的抗體。這說明，c2可以因避免誘生豬圓環(huán)病毒逃逸抗體而作為更有效的抗原被用于制備抗豬圓環(huán)病毒的疫苗。當(dāng)前第1頁12當(dāng)前第1頁12