本發(fā)明屬于生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，涉及一個(gè)棉花品質(zhì)性狀關(guān)聯(lián)的編碼肌球蛋白的基因。

技術(shù)背景

作為世界紡織品生產(chǎn)基地，我國是世界最大的棉花消費(fèi)國。隨著我國人民生活水平的飛速提高和紡織品配額的取消，紡織品消費(fèi)和出口保持著高速增長。進(jìn)而每年對棉花的需求巨大，對棉花品質(zhì)的要求也越來越高。選育種植產(chǎn)量高、纖維品質(zhì)優(yōu)良的棉花品種尤為重要，深入挖掘和利用棉花品質(zhì)的遺傳變異就顯得格外重要。

全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wideassociationstudy；gwas)由risch等在1996年首次提出，從全基因組水平上進(jìn)行相關(guān)性分析，是通過比較發(fā)現(xiàn)影響復(fù)雜性狀的基因變異的一種新策略。它是以連鎖不平衡為基礎(chǔ)，以基因組中數(shù)以百萬計(jì)的單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism，snp)為分子遺傳標(biāo)記，篩選出與復(fù)雜形狀關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記。gwas可以充分利用群體進(jìn)化中的重組事件，單純利用全基因組關(guān)聯(lián)分析只能挖掘和克隆農(nóng)藝性狀相關(guān)的變異位點(diǎn)或者關(guān)聯(lián)區(qū)域。需要結(jié)合候選區(qū)域內(nèi)序列特征、候選基因的表達(dá)特征、單倍型關(guān)聯(lián)甚至轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證的方法才能進(jìn)一步明確可靠的與復(fù)雜性狀關(guān)聯(lián)的基因或者變異位點(diǎn)。gwas在動物各種復(fù)雜形狀的遺傳研究中得到了廣泛的應(yīng)用，尤其是人類復(fù)雜疾病和性狀的關(guān)聯(lián)分析和基因挖掘。在植物中，自hasen等(2001)對海甜菜進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析之后，gwas在擬南芥、水稻和玉米等植物中得到了很多報(bào)道。aranzana等(2005)采用gwas分析方法進(jìn)行擬南芥開花和抗逆性方面的研究。belo等(2008)對553份優(yōu)良玉米自交系的8,950的snp進(jìn)行了gwas分析，鑒定出于油酸含量相關(guān)的位點(diǎn)。huang等(2011)對517份水稻地方種進(jìn)行了重測序，對水稻的14個(gè)農(nóng)藝性狀進(jìn)行g(shù)was分析，鑒定出80個(gè)性狀關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)。huang等(2012)對950份水稻群體進(jìn)行重測序，對開花期和10個(gè)產(chǎn)量相關(guān)性狀進(jìn)行g(shù)was分析。lin等(2014)基于360份番茄種質(zhì)的關(guān)聯(lián)分析，首次發(fā)現(xiàn)粉果果皮顏色相關(guān)基因。li等(2013)對144份玉米自交系品種和45868個(gè)snp標(biāo)記進(jìn)行g(shù)was分析，檢測到與玉米抗黑穗病相關(guān)的候選基因。zhou等(2015)對302份大豆野生、地方品種以及改良品種進(jìn)行g(shù)was分析，鑒別出含油量、株高和茸毛生成相關(guān)的新的關(guān)聯(lián)位點(diǎn)。wang等(2016)利用玉米自交系的自然變異群體進(jìn)行g(shù)was分析，找到83個(gè)遺傳變異位點(diǎn)與玉米苗期抗旱性顯著相關(guān)。本發(fā)明通過棉花品種群體重測序和全基因組關(guān)聯(lián)分析挖掘了一個(gè)與棉花品質(zhì)性狀纖維長度、伸長率、強(qiáng)度和整齊度同時(shí)關(guān)聯(lián)的基因，一個(gè)編碼肌球蛋白的基因myosinxi-k(ghxik)。

肌球蛋白myosin是一種對細(xì)胞內(nèi)部運(yùn)動起到重要調(diào)節(jié)作用的分子馬達(dá)蛋白，各種細(xì)胞器通過與肌球蛋白的結(jié)合沿細(xì)胞骨架進(jìn)行定向移動形成細(xì)胞器移動，細(xì)胞器移動推動胞質(zhì)的流動而產(chǎn)生胞質(zhì)環(huán)流。植物細(xì)胞中存在myosinviii、myosinxi和myosinxiii三種肌球蛋白(hodgeetal.2000)。myosinxi主要在細(xì)胞器移動中發(fā)揮作用，reddy等(2001)在小立碗蘚中沉默myosinxi基因的表達(dá)，導(dǎo)致植物產(chǎn)生又小又圓的細(xì)胞，植物極性生長或者頂端生長受到抑制，表明myosinxi在維持植物正常的細(xì)胞極性生產(chǎn)起到至關(guān)重要的調(diào)控作用。另外在模式植物擬南芥中，myosinxi基因的功能研究比較徹底，其在許多細(xì)胞伸長方面有著重要的作用(uedaetal.2010；ojanguetal.2007,2012)。例如atmyo11e和atmyo11b2兩個(gè)基因的缺失就會造成根毛形態(tài)的發(fā)育，并導(dǎo)致上皮細(xì)胞小于野生型,同時(shí)影響多重細(xì)胞器的移動性。myosinxi的突變對細(xì)胞整體功能也有著重要影響。擬南芥野生型細(xì)胞的肌動蛋白主要是縱向排列的，但是myosinximyo11f×myo11b2×myo11e三重突變體和myo11f×myo11b2×myo11e×myo11g四重突變體中則出現(xiàn)肌動蛋白橫向排列現(xiàn)象(prokhnevskyetal.2010)。myo11b2×myo11e雙重突變體的肌動蛋白表現(xiàn)出異常的傾斜排列(uedaetal.2010)。myo11e的單突變體能使肌動蛋白絲的動力減弱，而沒有造成肌動蛋白的構(gòu)成異常(parketal.2013)。

技術(shù)方案

本發(fā)明的目的是提供一個(gè)肌球蛋白編碼基因myosinxi-k(ghxik)。全基因組關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明該基因與棉花纖維伸長率、長度、強(qiáng)度和整齊度這三個(gè)重要品質(zhì)性狀密切關(guān)聯(lián)。

本發(fā)明的另一目的是提供該基因的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

肌球蛋白編碼基因ghxik，在所述的肌球蛋白編碼基因ghxik在四倍體陸地棉tm-1中的cdna序列為：seqidno.1，基因組序列為：seqidno.2；所述的肌球蛋白編碼基因ghxik含有一個(gè)非同義突變的snp位點(diǎn)，在cdna序列3032bp或者基因組序列的8714bp位置上；該snp位點(diǎn)堿基從c變?yōu)閠，對應(yīng)的氨基酸從ala變?yōu)関la；突變后的基因型纖維長度、強(qiáng)度和整齊度顯著優(yōu)于野生型。

本發(fā)明所述的肌球蛋白編碼基因ghxik在鑒定高纖維品質(zhì)陸地棉品種中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述的肌球蛋白編碼基因ghxik在改良棉花纖維品質(zhì)性狀中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述的肌球蛋白編碼基因ghxik在通過基因工程手段培育棉花優(yōu)異纖維品質(zhì)新品種中的應(yīng)用。

一種用于檢測所述的snp位點(diǎn)的引物對，上游引物為：seqidno.3，下游引物為：seqidno.4。

所述的引物對在篩選優(yōu)異纖維品質(zhì)棉花品種中的應(yīng)用。

一種篩選高產(chǎn)棉花品種的方法，檢測所述的snp位點(diǎn)，選擇cdna序列3032bp或者基因組序列的8714bp位置上的堿基為t的棉花即為高品質(zhì)棉花品種。

有益效果

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)表現(xiàn)在：

本發(fā)明通過棉花品種群體重測序和全基因組關(guān)聯(lián)分析挖掘了一個(gè)與棉花纖維品質(zhì)性狀伸長率、長度、強(qiáng)度和整齊度同時(shí)關(guān)聯(lián)的肌球蛋白編碼基因ghxik。本發(fā)明的肌球蛋白編碼基因ghxik在全基因組關(guān)聯(lián)分析中與棉花纖維品質(zhì)性狀密切相關(guān)。

ghxik在棉花不同組織和發(fā)育時(shí)期的表達(dá)水平分析由轉(zhuǎn)錄組測序所得。該基因在棉花開花10和20天后的纖維組織中優(yōu)勢表達(dá)，表明該基因與棉花纖維品質(zhì)性狀構(gòu)成因子相關(guān)。

ghxik在相對高品質(zhì)和低品質(zhì)品種群體中的snp基因型通過pcr技術(shù)進(jìn)行了驗(yàn)證(表1)，較易操作、靈敏度高和準(zhǔn)確性好。

根據(jù)ghxik的不同snp基因型可以將品種群體分為兩大類，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法發(fā)現(xiàn)，這兩類群體之間的纖維伸長率、長度、強(qiáng)度和整齊度性狀存在顯著性差異(表2)，進(jìn)一步證明該基因與棉花纖維品質(zhì)性狀之間的相關(guān)性。

附圖說明

圖1棉花不同纖維品質(zhì)性狀gwas關(guān)聯(lián)分析結(jié)果。

fe、fl、fs和fu分別代表纖維伸長率、長度、強(qiáng)度和整齊度。箭頭表示性狀關(guān)聯(lián)基因ghxik上的snp位點(diǎn)。橫坐標(biāo)表示染色體上的位置(mb)，縱坐標(biāo)表示snp位點(diǎn)關(guān)聯(lián)的顯著性，用-log10(pvalue)表示。

圖2ghxik在棉花不同組織和發(fā)育時(shí)期的表達(dá)水平。

橫坐標(biāo)代表不同組織，包括根(r)、莖(s)、葉(l)、胚珠(ovule)和纖維(fiber)。胚珠組織包括了開花前3和1天、開花當(dāng)天、開花后1到35天。纖維組織包括開花后5到25天。

圖3ghxik的序列信息和不同單倍型的鑒定。

在品種群體中檢測到ghxik序列存在1個(gè)非同義突變的snp位點(diǎn)，在基因組序列的8714bp位置上，。該snp位點(diǎn)堿基從c變?yōu)閠，對應(yīng)的氨基酸從ala變?yōu)関al。根據(jù)該snp位點(diǎn)堿基信息，將品種群體分為不同單倍型，標(biāo)記為callele和tallele，分別表示低纖維品質(zhì)和高纖維品質(zhì)。

圖4ghxik的不同單倍型之間纖維品質(zhì)性狀的比較分析。

箱圖代表品種群體的纖維品質(zhì)性狀的分布情況，fe、fl、fs和fu分別代表纖維伸長率、長度、強(qiáng)度和整齊度。含有callele和tallele兩種單倍型的品種分別是30和120個(gè)。左邊箱框代表單倍型callele的纖維品質(zhì)性狀分布，右邊箱框代表tallele的產(chǎn)量性狀分布。方框內(nèi)的橫線代表性狀分布的中值。*表示在0.05水平有差異。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1棉花產(chǎn)量性狀關(guān)聯(lián)的肌球蛋白編碼基因ghxik的挖掘：

從2007到2009年，針對258份現(xiàn)代品種或者品系，我們分別在河南安陽、江蘇南京和新疆庫車進(jìn)行了纖維品質(zhì)性狀(伸長率、長度、強(qiáng)度和整齊度)的田間調(diào)查。通過對這258份棉花品種進(jìn)行了全基因組重測序，我們獲得了2.54tb總測序數(shù)據(jù)，平均測序深度達(dá)到2.5×。我們將這些序列比對到棉花陸地棉參考基因組序列，利用samtools軟件進(jìn)行全基因組snp的鑒定，共挖掘了1,871,401個(gè)高質(zhì)量的snp(最小基因頻率maf>0.05)用于后續(xù)分析。利用emmax軟件，我們進(jìn)一步進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，再根據(jù)p<1×10^-6篩選snp關(guān)聯(lián)信號位點(diǎn)。在這些關(guān)聯(lián)位點(diǎn)中，我們發(fā)現(xiàn)了a13染色體上的一個(gè)gwas關(guān)聯(lián)位點(diǎn)可以同時(shí)關(guān)聯(lián)纖維伸長率、長度、強(qiáng)度和整齊度這四個(gè)性狀(圖1)。結(jié)合單基因關(guān)聯(lián)分析、表達(dá)水平分析，我們選定了候選基因?yàn)橐粋€(gè)肌球蛋白編碼基因ghxik(gh_a13g1707)。

實(shí)施例2ghxik在棉花不同組織和發(fā)育時(shí)期的表達(dá)水平分析：

本實(shí)驗(yàn)采取了棉花不同組織和不同發(fā)育時(shí)期的rna樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。樣本材料包括了根、莖、葉、胚珠和纖維。胚珠組織包括了開花前3和1天、開花當(dāng)天、開花后1到35天。纖維組織包括開花后5到25天。轉(zhuǎn)錄組測序采用illuminahiseq2500平臺，每個(gè)樣本平均測序深度達(dá)到6gb。基因表達(dá)水平的計(jì)算是利用tophat軟件(verson2.0.8)將測序得到的reads與陸地棉基因組進(jìn)行比對，計(jì)算出的表達(dá)水平以每百萬測序堿基中每千個(gè)轉(zhuǎn)錄子測序堿基中所包含的測序片斷數(shù)(fpkm)表示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中基因ghxik在棉花開花后10和20天的纖維組織中優(yōu)勢表達(dá)(圖2)，表明該基因與纖維品質(zhì)性狀構(gòu)成因子相關(guān)。

實(shí)施例3肌球蛋白編碼基因ghxik在鑒定高纖維品質(zhì)棉花品種和改良品質(zhì)性狀中的應(yīng)用：

基于染色體a013上gwas候選基因中snp位點(diǎn)的位置(a13:75996902)，在其兩端設(shè)計(jì)基因組擴(kuò)增引物(表1)。利用這對引物，在258個(gè)品種的dna中進(jìn)行pcr擴(kuò)增并測序。pcr反應(yīng)程序如下：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30sec，58℃退火1min，72℃延伸45sec，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7min。根據(jù)測序結(jié)果分析該snp位點(diǎn)上每個(gè)品種群體的基因型。我們證實(shí)了ghxik序列中非同義突變的snp位點(diǎn)，在cdna序列3032bp或者基因組序列的8174bp位置上(圖3)。第snp位點(diǎn)堿基從c變?yōu)閠，對應(yīng)的氨基酸從ala變?yōu)関al。根據(jù)該snp位點(diǎn)堿基信息，將低纖維品質(zhì)材料標(biāo)記為callele，將高纖維品質(zhì)品種材料標(biāo)記為tallele(圖3)。

根據(jù)ghxik基因組序列8174bp位置上snp基因型，我們鑒定出單倍型callele材料30個(gè)，單倍型tallele材料120個(gè)(圖3和表2)。利用t-test檢測方法，我們計(jì)算了兩組單倍型之間產(chǎn)量性狀的相關(guān)性(圖4)。結(jié)果顯出，相比callele，單倍型tallele與纖維長度、強(qiáng)度和整齊度性狀具有顯著性的正相關(guān)，與伸長率表現(xiàn)為負(fù)相關(guān)。

通過以上結(jié)果可以看出，基因ghxik在改良棉花纖維品質(zhì)性狀和培育棉花優(yōu)異纖維品質(zhì)新品種中具有重要的研究價(jià)值。一方面可以根據(jù)基因ghxik的單倍型設(shè)計(jì)分子標(biāo)記，可以有效的鑒定棉花纖維品質(zhì)性狀，在高品質(zhì)棉花品種選育研究中有很好的應(yīng)用價(jià)值。另一方面，可以通過基因工程的手段將含有高品質(zhì)單倍型tallele的基因轉(zhuǎn)入棉花品種中提高棉花纖維品質(zhì)，也可以將低品質(zhì)單倍型callele中的snp位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，改造成高品質(zhì)單倍型從而培育高品質(zhì)棉花新品種。

表1pcr擴(kuò)增引物序列

表2高品質(zhì)和低品質(zhì)單倍型在群體品種材料中的鑒定

<110>南京農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>一個(gè)棉花品質(zhì)性狀關(guān)聯(lián)的編碼肌球蛋白的基因

<160>4

<210>1

<211>4608

<212>dna

<213>四倍體陸地棉tm-1(gossypiumhirsutum)

<220>

<223>棉花肌球蛋白編碼基因ghxik的cdna序列

<400>1

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<210>2

<211>11947

<212>dna

<213>四倍體陸地棉tm-1(gossypiumhirsutum)

<220>

<223>棉花肌球蛋白編碼基因ghxik的基因組序列

<400>2

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<213>人工序列

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<223>檢測肌球蛋白編碼基因ghxik基因組序列的8714bp位點(diǎn)的上游引物

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<213>人工序列

<220>

<223>檢測肌球蛋白編碼基因ghxik基因組序列的8714bp位點(diǎn)的下游引物

<400>4

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