本發(fā)明涉及一種精氨酸單糖苷（af）的新合成方法及其在醫(yī)療方面的用途。
背景技術(shù)：
：精氨酸單糖苷英文名為arginyl-fructose，簡稱af，又稱為精氨酸果糖苷，分子量為337.3，化學(xué)名稱為1-（精氨酸-nα基）-1-去氧-d果糖。純化后的af單體為白色粉末，af極易溶于水，幾乎不溶于甲醇等有機(jī)溶劑，具有吸濕性，對熱不穩(wěn)定。精氨酸單糖苷（af），存在于自然界的許多植物中，鄭毅男在鮮參加工成紅參、生曬參的過程中，發(fā)現(xiàn)了af的存在。af在自然界中的含量非常低，但研究發(fā)現(xiàn)在人參加工成生曬參、紅參時(shí)af含量較高。af是鮮人參經(jīng)加熱加工處理后，人參內(nèi)的糖和氨基酸發(fā)生美拉德反應(yīng)生成的[1,2]。研究發(fā)現(xiàn)，af有很強(qiáng)的藥理活性，在疾病治療上發(fā)揮著積極作用。目前已有研究表明，af在抗糖尿病[3,4]、抗氧化[5,6]、抗腫瘤[7]、保肝等治療中發(fā)揮作用。目前精氨酸單糖苷合成的方法主要是專利“精氨酸果糖苷(af)制備方法及其醫(yī)用用途，申請?zhí)枺?01410305612.1”所報(bào)道的，但是其方法在合成過程中所選用的溶劑不僅污染環(huán)境，對人體有危害，合成率也較低，后續(xù)的分離純化過程也較為復(fù)雜，本發(fā)明為克服上述合成缺陷上開發(fā)了一種新型的合成工藝，并公開了合成后精氨酸糖苷的部分生物活性。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是公開一種精氨酸單糖苷的合成方法及其醫(yī)用用途。本發(fā)明公開的精氨酸單糖苷的合成方法合成率大于63%，精氨酸和單糖的配比為1：0.5-2。本發(fā)明公開的精氨酸單糖苷的合成方法中所需要的精氨酸可以是l-精氨酸、d-精氨酸其中的一種或者兩種的混合物。本發(fā)明公開的精氨酸單糖苷的合成方法中所需要的單糖可以是d-葡萄糖、d-果糖、d-半乳糖、d-木糖中的一種或者兩種以上的混合物。本發(fā)明公開的精氨酸單糖苷的合成方法中所需要的合成時(shí)間為120-300min。本發(fā)明公開的精氨酸單糖苷的合成方法中所需要的合成溫度為80℃。本發(fā)明公開的精氨酸單糖苷的合成方法中所需要的溶劑為丙二醇、丙三醇、丙醇、異丙醇中的一種或者兩種以上的混合溶劑。本發(fā)明公開的精氨酸單糖苷的合成方法中還可以添加亞硫酸鈉、維生素c、維生素e的中的一種或者兩種以上的混合物。本發(fā)明公開的精氨酸單糖苷的合成方法中還可以添加檸檬酸、蘋果酸等可食用的有機(jī)固體酸的中的一種或者兩種以上的混合物。本發(fā)明公開的合成的精氨酸單糖苷具有清除羥基自由基和超氧陰離子自由基、抗腫瘤、提高免疫力的用途。本發(fā)明的積極效果在于：本發(fā)明中af的合成方法，合成率有大幅提高，可達(dá)63%，同時(shí)降低了af的生產(chǎn)成本，且粗合成物無刺激性氣味，屬于綠色環(huán)境友好型的合成方法。本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)表明，合成的af具有清除自由基、抗腫瘤和提高機(jī)體免疫力的功效。實(shí)驗(yàn)例1.精氨酸單糖苷（af）合成工藝1.1實(shí)驗(yàn)方法1.1.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密稱取af對照品5mg，用水定容于25ml容量瓶中，分別移取2、4、6、8ml對照品溶液于10ml容量瓶中，用水定容至刻度，得質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4mg/ml的對照品溶液。hplc條件：venusil-aa氨基酸分析專用柱(5μm，4.6mm×250mm)；流動(dòng)相：a相-乙酸鈉緩沖溶液（925ml純凈水，7.6g乙酸鈉，2ml磷酸，2-3d冰乙酸，75ml乙腈），b相-有機(jī)相（乙腈∶水=4∶1）。流速1.0ml/min；檢測波長254nm；柱溫40℃；進(jìn)樣量20μl。1.1.2單因素試驗(yàn)1.1.2.1篩選最佳反應(yīng)時(shí)間固定反應(yīng)溫度85℃，料液比1:20，蘋果酸加入量0.75g,考察反應(yīng)時(shí)間為60、90、120、150、180min對af合成率的影響。1.1.2.2篩選最佳反應(yīng)溫度固定反應(yīng)時(shí)間150min,料液比1:20，蘋果酸加入量0.75g,考察反應(yīng)溫度為70、75、80、85、90℃對af合成率的影響。1.1.2.3篩選最佳料液比固定反應(yīng)時(shí)間150min，反應(yīng)溫度85℃,蘋果酸加入量0.75g,考察料液比1:10、1:15、1:20、1:25、1:30g/ml對af合成率的影響。1.2.2.4篩選最佳蘋果酸加入量固定反應(yīng)時(shí)間150min，反應(yīng)溫度85℃,料液比1:20，考察蘋果酸加入量0.5,0.75,1.0,1.25g對af合成率的影響。1.1.3響應(yīng)面法試驗(yàn)在單因素的基礎(chǔ)上，采用統(tǒng)計(jì)分析軟件designexpert8.0.6，根據(jù)box-behnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以反應(yīng)時(shí)間（x1）、反應(yīng)溫度（x2）、料液比（x3）、蘋果酸加入量（x4）為自變量，af合成率（y）為響應(yīng)值，進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)因素與水平編碼如表1所示。表1響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)因素水平1.2試驗(yàn)結(jié)果1.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制測定不同濃度的af對照品溶液在254nm下的峰面積，以質(zhì)量濃度x(mg/ml)對峰面積y繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為：y=298449.88x，r2=0.9991，在質(zhì)量濃度0.1~0.5mg/ml內(nèi)呈良好線性關(guān)系。1.2.2單因素試驗(yàn)1.2.2.1反應(yīng)時(shí)間對af合成率的影響在其它試驗(yàn)條件不變的情況下，隨著時(shí)間的延長，蘋果酸催化的af合成率逐漸升高，當(dāng)時(shí)間達(dá)到150min時(shí)，合成率達(dá)到最高點(diǎn)，隨著反應(yīng)繼續(xù)，反應(yīng)向af減少方向進(jìn)行。因此，box-behnken試驗(yàn)選取的反應(yīng)時(shí)間的范圍為120-180min（附圖1）。1.2.2.2反應(yīng)溫度對af合成率的影響多次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，溫度70-90℃之間時(shí)，af的合成反應(yīng)迅速發(fā)生，符合af在紅參中形成的溫度條件，當(dāng)溫度達(dá)到85℃時(shí)，af合成率達(dá)到最高點(diǎn)，隨著溫度繼續(xù)升高，合成率降低。因此，box-behnken試驗(yàn)選取的反應(yīng)溫度的范圍為80-90℃（附圖2）。1.2.2.3料液比對af合成率的影響在其它試驗(yàn)條件不變的情況下，以料液比為變量時(shí)，丙三醇加量過低時(shí)，反應(yīng)不易混勻，且反應(yīng)不徹底，合成率偏低，隨著溶媒體積的增大，達(dá)到1:20g/ml時(shí)，af合成率最高，隨著丙三醇體積繼續(xù)增加，合成率下降。因此，box-behnken試驗(yàn)選取的料液比的范圍為1:15-1:25g/ml（附圖3）。1.2.2.4蘋果酸加入量對af合成率的影響在其它試驗(yàn)條件不變的情況下，隨著蘋果酸加入量的增加，af的合成率逐漸升高，蘋果酸加入量達(dá)到0.75g時(shí)，合成率達(dá)到最大值，隨后隨著蘋果酸含量的增加而有所降低。因此，box-behnken試驗(yàn)選取的蘋果酸加入量的范圍為0.5-1.0g（附圖4）。1.2.3響應(yīng)面法優(yōu)化合成試驗(yàn)結(jié)果與分析1.2.3.1試驗(yàn)結(jié)果運(yùn)用designexpert8.0分析軟件進(jìn)行box-behnken設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)方案及其試驗(yàn)結(jié)果見表2，試驗(yàn)號1-24位析因?qū)嶒?yàn)，試驗(yàn)號25-29位中心試驗(yàn)。1.2.3.2結(jié)果分析對表2的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得到af合成率（y）對反應(yīng)溫度（x1）、反應(yīng)時(shí)間（x2）、料液比（x3）、加酸量（x4）的二次多項(xiàng)回歸方程為：y=67.79+2.96x1+1.74x2-1.77x3+1.05x4+1.24x1x2+1.53x1x3+1.72x2x3-1.55x2x4-2.01x3x4-5.15x12-6.09x22-5.49x32-6.62x42。表3為回歸模型的方差分析結(jié)果，該模型f值為53.18、r2=0.9815、p<0.0001，說明回歸方程的你和程度較好，試驗(yàn)具有很高的可信性和準(zhǔn)確性。模型的修正相關(guān)系數(shù)r2adj=0.9631，表明該方程較好地反映了合成時(shí)間、合成溫度、料液比和蘋果酸加入量與af合成率的關(guān)系，說明該模型能夠解釋96.31%的響應(yīng)值變化，因此可用此模型對af的合成進(jìn)行分析和預(yù)測。從f值的分析結(jié)果（a=95.2、b=32.83、c=34.03、d=11.89）可以看出，在所選的各因素水平范圍內(nèi)，對af合成率的影響大小的順序?yàn)椋悍磻?yīng)溫度＞料液比＞反應(yīng)時(shí)間＞蘋果酸加入量。表2box-behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果表3回歸模型方差分析結(jié)果r2=0.9815，r2adj=0.9631，r2pred=0.9159，cv=1.811.2.3.3af合成工藝的響應(yīng)面分析與優(yōu)化附圖6、10曲面陡峭，等高線呈橢圓形，說明反應(yīng)溫度與料液比、料液比與蘋果酸加入量有很強(qiáng)的交互作用，呈極顯著性；附圖5、6、8曲面相對平緩，說明反應(yīng)溫度與反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度與料液比、反應(yīng)時(shí)間與料液比有一定的交互作用，但等高線幾乎為圓形，交互作用不是很強(qiáng)；附圖7曲面平緩，等高線為圓形，說明反應(yīng)溫度與蘋果酸加入量交互作用不顯著。附圖9中均存在極值，說明試驗(yàn)所選范圍比較合理。1.2.3.4af合成工藝條件的確定結(jié)合回歸模型分析結(jié)果可知，af合成的最佳工藝條件為反應(yīng)溫度85℃、反應(yīng)時(shí)間150min、液料比1:20（g/ml）、蘋果酸加入量0.75g。在此條件下af的理論合成率為67.79%，實(shí)際合成率為68.92%,理論值與實(shí)際值基本吻合。由此可見，響應(yīng)面分析法所優(yōu)化的最佳合成工藝數(shù)據(jù)真實(shí)可靠。1.3討論采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化af合成工藝，通過合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，從而得出各因素對af合成率影響大小依次為：反應(yīng)溫度>料液比>反應(yīng)時(shí)間>蘋果酸加入量。料液比和蘋果酸加入量對af合成的交互影響最為顯著。其最佳合成條件為反應(yīng)溫度85℃、反應(yīng)時(shí)間150min、料液比1:20（g/ml）、蘋果酸加入量0.75g，af的實(shí)際合成率為68.92%。試驗(yàn)采用的響應(yīng)曲面模型顯著性較好，使得結(jié)果準(zhǔn)確可靠，該研究結(jié)果是對人工合成af方法的進(jìn)一步完善，具有一定的理論參考價(jià)值和實(shí)際應(yīng)用前景。af單體在自然界中含量低，分離純化難，因此采用人工合成的方法，以降低af合成成本，提高利用價(jià)值。趙婷、鄭毅男等以冰醋酸為催化劑af的合成率為20-30%左右。冰醋酸是一種有機(jī)一元酸，且有強(qiáng)烈的刺激性氣味，其蒸汽對眼和鼻有刺激性作用。本文以蘋果酸為催化劑，是合成食藥通用的af較好的選擇之一。蘋果酸的使用，解決了冰醋酸刺激性氣味的缺點(diǎn)，且利用響應(yīng)面法優(yōu)化af合成工藝，它更好地處理離散水平值，實(shí)驗(yàn)周期短、精密度高，能對因素間交互作用進(jìn)行研究，篩選出最佳合成條件，顯著提高了af合成率，為下一步研究奠定基礎(chǔ)，也使得af大量生產(chǎn)使用成為可能。實(shí)驗(yàn)例2精氨酸單糖苷（af）對羥基自由基和超氧陰離子自由基的清除作用2.1af樣品溶液的制備取l-精氨酸10g，葡萄糖10g，蘋果酸15g，溶于200ml丙三醇中，搖勻，于85℃水浴條件下反應(yīng)90min,得af總合成物，上樣于高效陽離子柱，1.5%氨水洗脫，部分接收器接樣，分批處理后，樣品通過hplc測得純度，真空冷凍干燥機(jī)凍干為白色粉末。陽離子柱反復(fù)純化，經(jīng)高效液相測其純度，大于95%。取純化后的af，用水配置成質(zhì)量濃度為1mg/ml的樣品溶液，以此濃度為基礎(chǔ)，逐步稀釋成0.5、0.4、0.1、0.08、0.05mg/ml樣品溶液，待用。2.2抗氧化活性測定2.2.1af對羥基自由基的清除作用2.2.1.1羥基自由基生成體系本試驗(yàn)采用fenton方法，建立·oh自由基反應(yīng)體系模型。其反應(yīng)方程為：h2o2＋fe2+→oh－＋·oh＋fe3+，·oh存活的時(shí)間短，但具有很高的反應(yīng)活性。而水楊酸能夠有效的捕捉·oh，產(chǎn)生一定顏色的絡(luò)合物，該顏色產(chǎn)物，在500nm處有強(qiáng)吸收。如果本試驗(yàn)中，af具有清除·oh功能，則與水楊酸爭奪·oh，從而使有色絡(luò)合物生成量減少，顏色減輕。所以，利用此方法，與空白對照管進(jìn)行對比，就可測定樣品的清除·oh自由基效果。清除率計(jì)算公式為：e（·oh）/%=1－（ai－aj）×100%aoe為羥基自由基的清除率；ao為空白對照管吸光度；ai為反應(yīng)液吸光度；aj為未加水楊酸提取液自身的吸光度。2.2.1.2溶液的配制feso4溶液（6mmol/l）:稱取feso4晶體0.0456g，用水定容于50ml容量瓶中，配置成6mmol/l溶液，待用。h2o2(30%):取30%h2o213.6μl定容于50ml容量瓶中，配置成2.4mmol/l溶液，待用。水楊酸-乙醇溶液（6mmol/l）：稱取水楊酸固體0.0414g，用無水乙醇定容于用錫紙包裹的50ml容量瓶中，配置成6mmol/l溶液，待用。2.2.1.3羥基自由基的測定ao值的測定：在試管中加入2ml水，再加入6mmol/lfeso4溶液2ml，2.4mmol/lh2o2溶液2ml，搖勻，室溫下靜止10min，之后，加入6mmol/l水楊酸-乙醇溶液2ml，37℃水浴30min，離心（3000r/min,10min），棄去上清液，500nm測定其吸光度。ai值的測定：在試管中分別加入0.5、0.4、0.1、0.08、0.05mg/mlaf溶液2ml，再加入6mmol/lfeso4溶液2ml，2.4mmol/lh2o2溶液2ml，搖勻，室溫下靜止10min，之后，加入6mmol/l水楊酸-乙醇溶液2ml，37℃水浴30min，離心（3000r/min,10min），棄去上清液，500nm測定其吸光度。aj值的測定：在試管中分別加入0.5、0.4、0.1、0.08、0.05mg/mlaf溶液2ml，再加入6mmol/lfeso4溶液2ml，2.4mmol/lh2o2溶液2ml，搖勻，室溫下靜止10min，之后，37℃水浴30min，離心（3000r/min,10min），棄去上清液，500nm測定其吸光度。2.2.2af對超氧陰離子自由基的清除作用2.2.2.1超氧陰離子自由基生成體系本試驗(yàn)采用鄰苯三酚自氧化法測定af對o2?－自由基的清除能力。鄰苯三酚在堿性條件下自氧化，生成超氧陰離子自由基o2?－與自氧化中間產(chǎn)物，該產(chǎn)物在420nm處有吸收峰，其自氧化過程為：第一步，鄰苯三酚自氧化成半醌自由基；第二步，氧化成醌，在此過程中伴隨超氧自由基的生成。如果af抗氧化能力較強(qiáng)，則鄰苯三酚自氧化過程將受到阻礙，o2?－自由基的生成就會(huì)受到抑制，吸收峰減弱，以吸光度值來測定樣品清除o2?－自由基的能力。清除率計(jì)算公式如下：e（o2?－）/%=1－（ai－aj）×100%aoe為超氧陰離子自由基的清除率；ao為空白對照管吸光度；ai為反應(yīng)液吸光度；aj為未加鄰苯三酚自身的吸光度。2.2.2.2溶液的配制鄰苯三酚溶液（25mmol/l）：稱取鄰苯三酚晶體0.158g，用水定容于50ml容量瓶中，配置成25mmol/l溶液，待用。鹽酸（80mmol/l）：吸量管吸取2ml鹽酸，定容于25ml容量瓶中，配置成80mmol/l鹽酸溶液，待用。磷酸鹽緩沖液（ph=8，0.05mol/l）：稱取磷酸氫二鈉7.164g，用水定容于100ml容量瓶中，充分溶解；稱取磷酸二氫鈉3.121g，用水定容于100ml容量瓶中，充分溶解；分別吸取磷酸氫二鈉水溶液22.88ml，磷酸二氫鈉水溶液2.125ml于100ml容量瓶中，定容，充分混勻，配置成ph=8，0.05mol/l磷酸鹽緩沖液，待用。2.2.2.3超氧陰離子的測定ao值的測定：在試管中加入ph=8，0.05mol/l磷酸鹽緩沖液4.5ml，于25℃水浴中加熱20min，之后，加入1ml水和25mmol/l鄰苯三酚溶液，混勻后，25℃反應(yīng)10min，加入80mmol/l鹽酸溶液1ml終止反應(yīng)，搖勻，反應(yīng)3min，在420nm處測其吸光度。ai值的測定：在試管中加入ph=8，0.05mol/l磷酸鹽緩沖液4.5ml，于25℃水浴中加熱20min，之后，分別加入0.5、0.4、0.1、0.08、0.05mg/mlaf樣品溶液1ml和25mmol/l鄰苯三酚溶液，混勻后，25℃反應(yīng)10min，加入80mmol/l鹽酸溶液1ml終止反應(yīng)，搖勻，反應(yīng)3min，在420nm處測其吸光度。aj值的測定：在試管中加入ph=8，0.05mol/l磷酸鹽緩沖液4.5ml，于25℃水浴中加熱20min，之后，分別加入0.5、0.4、0.1、0.08、0.05mg/mlaf樣品溶液1ml，混勻后，25℃反應(yīng)10min，加入80mmol/l鹽酸溶液1ml終止反應(yīng)，搖勻，反應(yīng)3min，在420nm處測其吸光度。2.3結(jié)果2.3.1af對羥基自由基清除能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著af樣品質(zhì)量濃度的增加，對羥基自由基的清除能力逐漸增強(qiáng)，當(dāng)af0.5mg/ml時(shí)，清除率達(dá)到78.14%。此次結(jié)果表明，af能夠起到清除羥基自由基作用，且效果比較明顯，具體數(shù)值見表4。表4af對羥基自由基清除能力af質(zhì)量濃度（mg/ml）aiajai－aje（·oh）/%空白0.8370.2560.581—0.50.7820.2360.54678.140.40.8160.2460.57072.180.10.8510.2560.59569.700.080.9110.2740.63762.470.050.9790.2840.68552.492.3.2af對超氧陰離子自由基清除能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著af樣品質(zhì)量濃度的增加，對超氧陰離子自由基的清除能力逐漸增強(qiáng)，當(dāng)af0.5mg/ml時(shí)，清除率達(dá)到78.94%。此次結(jié)果表明，af能夠起到清除超氧陰離子自由基作用，且效果比較明顯，具體數(shù)值見表5。表5af對超氧陰離子自由基清除能力af質(zhì)量濃度（mg/ml）aiajai－aje（·oh）/%空白0.3140.0290.285—0.50.0900.0300.06078.940.40.1190.0330.08669.820.10.1490.0300.11958.240.080.1740.0290.14549.120.050.1890.0310.15844.562.4小結(jié)本試驗(yàn)的結(jié)果表明，af能較好的清除超氧陰離子和羥基自由基，且隨著af濃度的增加，清除能力也在增強(qiáng)，當(dāng)af濃度為0.5mg/ml時(shí)，羥基自由基清除率達(dá)到78.14%，超氧陰離子自由基清除率達(dá)到78.94%，表明af具有較強(qiáng)的抗氧化能力，其具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。實(shí)驗(yàn)例3精氨酸單糖苷（af）對h22荷瘤小鼠腫瘤生長抑制作用3.1試驗(yàn)方法3.1.1造模方法取h22瘤細(xì)胞液（特產(chǎn)研究所提供），接種于小鼠腹腔，7-9d后，將其脫臼處死，75%酒精全面消毒，在無菌條件下抽取小鼠腹水，置于盛有生理鹽水的帶塞試管中，混勻，離心（1000r/min，3min），棄去上清液，并用生理鹽水洗滌，重復(fù)3次，最后用生理鹽水調(diào)整瘤細(xì)胞懸液細(xì)胞數(shù)為1.0×107個(gè)/ml，皮下接種于icr小鼠右前肢，0.2ml/只。3.1.2動(dòng)物分組及給藥小鼠接種24h后，將成功接種小鼠隨機(jī)分成5組，每組10只，即模型組（m,0.9%生理鹽水）、陽性對照組（p，環(huán)磷酰胺，25mg/kg）、af低劑量組（af-l,12.5mg/kg）、af中劑量組（af-m,25mg/kg）af高劑量組（af-h,50mg/kg）,各組每日按10ml/kg小鼠體重給藥，陽性對照組腹腔注射給藥，其余各組灌胃給予相應(yīng)的藥物(空白對照組及模型組給予0.9%生理鹽水)，每天給藥一次，連續(xù)給藥21d。3.1.3抑瘤率測定末次給藥12h后，眼球取血并脫臼處死小鼠后，一手用鑷子夾住小鼠腫瘤部位皮膚，另一只手那手術(shù)剪剪開皮膚，暴露腫瘤，用手術(shù)剪沿腫瘤輪廓，剝離腫瘤，用9%生理鹽水進(jìn)行漂洗，濾紙吸干后稱重，計(jì)算抑瘤率。抑瘤率（%）=（模型組平均瘤重-實(shí)驗(yàn)組平均瘤重）÷模型組平均瘤重×100%。3.1.4臟器指數(shù)末次給藥12h后，眼球取血，離心機(jī)4500r分離血清，處理后的血清保存在-20℃冰箱，待用。將小鼠處死后進(jìn)行系統(tǒng)的解剖，取出脾臟和胸腺，用9%生理鹽水進(jìn)行漂洗，濾紙吸干后稱重，計(jì)算脾指數(shù)及胸腺指數(shù)。臟器指數(shù)=臟器重量(g)×100/體重(g)3.1.5生化指標(biāo)檢測3.1.5.1肝功能和腎功能指標(biāo)測定通過測定血清中谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alt）和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ast）、尿素氮(bun)和肌酐(cre)含量，以反映藥物對肝臟、腎臟功能的影響。3.1.5.2肝組織中sod活力和mda含量的測定用黃嘌呤氧化酶法檢測sod活力，用硫代巴比妥酸（tba）法檢測mda含量，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。3.1.5.3血清中tnf-α、il-2含量測定取分裝好的小鼠血清，常溫解凍，嚴(yán)格按照elisa說明書操作，點(diǎn)入96孔板，酶標(biāo)儀測定后，進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。3.1.6腫瘤組織病理學(xué)檢查取解剖后的腫瘤組織固定于10%甲醛固定液中，進(jìn)行脫水、透明、浸蠟，最后包埋。用切片機(jī)將包埋后的腫瘤組織切成4~5μm,然后進(jìn)行展片、撈片、烘片，將處理好的切片，經(jīng)h&e染色法染色后，在顯微鏡下觀察組織的結(jié)構(gòu)及細(xì)胞的形態(tài)，最后進(jìn)行分析比對。3.1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用spss17.0應(yīng)用軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。多組間比較采用單因素方差分析法,以p<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.2.1af對h22荷瘤小鼠的抑瘤作用如表6所示，af-l、af-m劑量組對腫瘤起到一定得抑制作用，與模型組比較，存在極顯著差異（p<0.01），但抑瘤率低于陽性對照組。af-h組與模型組無顯著性差異。af給藥的三個(gè)劑量足，進(jìn)行比較，af-l組抑瘤效果最好，抑瘤率達(dá)到47.65%。表6af對h22荷瘤小鼠的抑瘤作用(±s,n=10)groupsdosage（mg/kg）tumorweight（g）inhibitoryrate（%）model—1.82—positive250.85**53.37af-l12.50.95**47.65af-m251.24**31.81af-h501.679.08*p<0.05,**p<0.01,vs.modelgroup3.2.2af對h22荷瘤小鼠免疫器官的影響如表7所示，af對小鼠的胸腺指數(shù)與腎臟指數(shù)均可不同程度的提高。與空白對照組比較，模型組與陽性對照組均存在顯著性差異（p<0.01），af-h組胸腺指數(shù)存在顯著性差異（p<0.05）。與模型組比較，af-l、af-m、af-h劑量組均存在極顯著性差異（p<0.01）。表7af對h22荷瘤小鼠免疫器官的影響(±s,n=10)groupdosage（mg/kg）spleenindex（mg/g）thymusindex（mg/g）normal—0.57±0.04**0.23±0.01**model—0.39±0.02##0.16±0.02##positive250.47±0.05**##0.19±0.02*##af-l12.50.530±0.02**0.21±0.03**af-m250.55±0.03**0.22±0.02**af-h500.54±0.05**0.20±0.01***p<0.05,**p<0.01,vs.modelgroup；#p<0.05,##p<0.01,vs.normalcontrolgroup3.2.3af對h22荷瘤小鼠細(xì)胞因子的影響如表8所示，模型組與空白對照組存在極顯著性差異。與模型組比較，陽性對照組、af-l、af-m組血清中il-2含量顯著上升，存在極顯著性差異（p<0.01）；af-h組存在顯著性差異（p<0.05）。與m組比較，p、af-l、af-m、af-h組tnf-α含量顯著提高，均呈現(xiàn)極顯著性（p<0.01）。表8af對小鼠血清中細(xì)胞因子tnf-α、il-2的影響(±s,n=10)groupsdosage（mg/kg）il-2(pg/ml)tnf-α（pg/ml）normal—71.08±10.76148.21±28.03model—39.27±5.95##110.39±16.45##positive2565.56±7.23**174.05±41.35**af-l12.556.53±6.68**161.29±21.55**af-m2580.17±5.64**145.82±25.35**af-h5051.21±7.28*144.61±16.26***p<0.05,**p<0.01,vs.modelgroup；#p<0.05,##p<0.01,vs.normalcontrolgroup3.2.4af對h22荷瘤小鼠肝腎功能的影響與空白對照組比較，模型組cre、bun含量均存在極顯著性差異（p<0.01）。與模型組比較，陽性對照組cre含量存在顯著性差異（p<0.05）；af-l、af-m組cre含量存在極顯著性差異（p<0.01）；af-h組與模型組無明顯差別。血清中bun含量，與模型組相比，陽性對照組、af-l組均呈現(xiàn)極顯著性差異（p<0.01）；af-m、af-h組存在顯著性差異（p<0.05）。af各劑量組均能顯著降低血清中alt、ast含量。模型組與空白對照組存在極顯著性差異（p<0.01）；與模型組比較，陽性對照組、af-l、af-m、af-h組血清中alt含量均存在極顯著性差異；陽性對照組、af-l、af-h組血清中ast含量存在極顯著性差異（p<0.01），af-m組存在顯著性差異（p<0.05），如表9所示。表9af對h22荷瘤小鼠肝腎功能的影響(±s,n=10)*p<0.05,**p<0.01,vs.modelgroup；#p<0.05,##p<0.01,vs.normalcontrolgroup3.2.5af對h22荷瘤小鼠sod和mda含量的影響如表10所示，模型組與空白對照組存在極顯著性差異。與模型組比較，給藥組小鼠肝臟組織中sod含量均顯著提高，陽性對照組、af-l、af-m、af-h組均存在顯著性差異（p<0.01）。與模型組比較，陽性對照組、af-l、af-m肝臟組織中mda含量明顯升高（p<0.01），af-h組與模型組無明顯差異。表10af對h22荷瘤小鼠sod和mda含量的影響(±s,n=10)groupsdosag（mg/kg）sod(u/mgprot)mda(nmol/mgprot)normal—216.95±17.5710.06±2.08model—124.78±15.06##14.88±0.92##positive25210.98±15.64**10.79±2.06**af-l12.5251.26±30.88**8.17±2.24**af-m25166.70±29.47**8.79±2.43**af-h50163.24±34.17**13.70±1.85*p<0.05,**p<0.01,vs.modelgroup；#p<0.05,##p<0.01,vs.normalcontrolgroup3.3小結(jié)與討論h22腫瘤細(xì)胞株，接種率較高，接種成功后腫瘤完整，且不易發(fā)生轉(zhuǎn)移，方便對腫瘤生長的直觀觀察、腫瘤體積及重量的測量等特點(diǎn)。目前，國內(nèi)外腫瘤試驗(yàn)研究中，大多以h22腫瘤細(xì)胞株為模型。本試驗(yàn)以h22荷瘤小鼠為試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，研究af抗腫瘤活性，結(jié)果表明，af-l組作用比較明顯，抑瘤率達(dá)到47.65%，低于環(huán)磷酰胺陽性對照組抑制率（53.37%），但兩者不存在顯著性差異。腫瘤的發(fā)生與免疫系統(tǒng)也存在較大的聯(lián)系，二者相輔相成。腫瘤的發(fā)展、轉(zhuǎn)移、浸潤、惡化等都伴隨著免疫功能的下降[8]。所以在腫瘤治療的過程中，如何提高機(jī)體自身的抗腫瘤免疫活性引起了廣泛的探究[9-10]。機(jī)體的兩個(gè)重要免疫器官，胸腺和脾臟,其臟器指數(shù)經(jīng)常被用于評價(jià)免疫活性的高低[11]。本文結(jié)果顯示，af-l、af-m、af-h組胸腺指數(shù)與脾臟指數(shù)顯著高于模型對照組，并存在顯著性差異（p<0.01），由此說明，af能夠延緩荷瘤小鼠免疫器官衰退。il-2、tnf-α在抗荷瘤小鼠免疫中起著至關(guān)重要的作用。il-2是t細(xì)胞生長所必須的生長因子，同時(shí)能夠上調(diào)b細(xì)胞、nk細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等的免疫功能，還可以刺激tnf、干擾素等其他的細(xì)胞因子的分泌[12]。tnf-α是目前國內(nèi)外發(fā)現(xiàn)的活性最強(qiáng)的抗腫瘤細(xì)胞因子[13]，它是由活化的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的，可直接溶解腫瘤，還可抵抗微生物入侵和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫的功能。本試驗(yàn)研究顯示，af-l、af-m組均可提高小鼠血清中il-2、tnf-α含量，與模型組均存在極顯著性差異，即可說明，af-l、af-m組可增強(qiáng)荷瘤小鼠的機(jī)體免疫功能，從而抑制腫瘤的生長。谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alt）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（ast）主要富集肝臟組織中，所以肝臟組織受到損傷或嚴(yán)重壞死時(shí)，alt和ast大量外泄至血清中，故血清中二者含量顯著升高，所以，經(jīng)常以血清中alt、ast含量高低來監(jiān)測肝臟是否損傷或壞死的重要指標(biāo)。本試驗(yàn)中，給藥組血清中alt、ast含量均低于模型組，并存在顯著性差異，與空白對照組無明顯變化，說明af對小鼠肝臟無損傷。bun、cre是臨床上常用的檢測腎臟功能的主要指標(biāo)之一。當(dāng)腎小球?yàn)V過率下降到正常的50%以下時(shí)，bun濃度迅速升高。當(dāng)患有急、慢性腎小球腎炎等疾病時(shí)，使腎小球?yàn)V過功能減退，cre升高。此次試驗(yàn)，血清中bun、cre含量均顯著低于模型組（p<0.01），與空白對照組無顯著性差異，說明af對荷瘤小鼠腎臟功能無損傷。自由基與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展存在一定的關(guān)系[14-15]。sod是一種抗氧化酶，是抗氧化的第一道防線，可以將超陽陰離子歧化為h2o2，而mda含量的變化可間接地反應(yīng)組織中氧自由基含量的變化。因此可通過測定sod、mda含量來反映機(jī)體抗氧化的能力[16]。試驗(yàn)結(jié)果顯示，af可以顯著提高sod的值（p<0.01），af-l、af-m組可顯著降低mda的值（p<0.01），說明af可提高機(jī)體的抗氧化能力，清除體內(nèi)自由基。綜上所述，af具有一定得抗腫瘤效果，尤其是af低劑量組，表現(xiàn)的最為明顯，它能夠明顯抑制腫瘤的生長，且可提高機(jī)體免疫活性。但腫瘤的徹底治療，是一項(xiàng)長期過程，還有待進(jìn)一步探索研究。實(shí)驗(yàn)例4精氨酸單糖苷（af）對免疫抑制小鼠免疫功能的影響4.1實(shí)驗(yàn)方法4.1.1動(dòng)物分組與劑量100只icr小鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，隨機(jī)分成5組，每組20只，即正常對照組(n)，免疫抑制模型組(m)，免疫抑制af低劑量組（m-l，20mg/kg），免疫抑制af中劑量組（m-m，40mg/kg），免疫抑制af高劑量組（m-h，80mg/kg）。各組每日按10ml/kg體重給小鼠灌胃給藥，每天給藥一次，連續(xù)給藥28d。m、m-l、m-m及m-h組，每周前三天，腹腔注射環(huán)磷酰胺（ctx，80mg/kg），形成免疫抑制。4.1.2小鼠免疫器官臟器指數(shù)測定末次給藥12h后，眼球取血，離心機(jī)4500r分離血清，處理后的血清保存在-20℃冰箱，待用。將小鼠處死后進(jìn)行系統(tǒng)的解剖，取出脾臟和胸腺，用9%生理鹽水進(jìn)行漂洗，濾紙吸干后稱重，計(jì)算脾指數(shù)及胸腺指數(shù)。臟器指數(shù)=臟器重量(g)×100/體重(g)4.1.3體外脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)給藥第21d后，每組隨機(jī)抽取10只小鼠，脫臼處死，置75%酒精中浸泡5min,無菌取脾臟，加入rpmi-1640，300目鋼網(wǎng)研磨，吸取脾細(xì)胞懸液于1.5ml離心管中，離心10min（15000rpm，4℃），棄上清液。于上述離心管中加入acklysisbuffer，再次離心10min（15000rpm，4℃），棄上清液。再加入rpmi-1640，細(xì)胞計(jì)數(shù)，配成2×106/ml脾細(xì)胞懸液。試驗(yàn)分為三組，第一組為對照組即脾淋巴自然轉(zhuǎn)化組；第二組加入cona(5μg/ml,100μl)，刺激t細(xì)胞轉(zhuǎn)化；第三組加入lps（10μg/ml,100μl），刺激b細(xì)胞轉(zhuǎn)化。將各組細(xì)胞依次加到96孔板中，每孔加入100μl脾細(xì)胞懸液，每孔設(shè)立3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞培養(yǎng)條件為：5%co2培養(yǎng)箱，37℃，48h。培養(yǎng)48h后，每孔內(nèi)加入mtt（5mg/ml）20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，離心（2000rpm，10min），吸取上清液，加入150μl的dmso充分溶解紫色結(jié)晶，酶標(biāo)儀490nm條件下，測定各孔o(hù)d值。4.1.4血清tnf-α、il-2含量測定取分裝好的小鼠血清，常溫解凍，嚴(yán)格按照elisa說明書操作，點(diǎn)入96孔板，酶標(biāo)儀測定后，進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。4.1.5特異性igg抗體的檢測取分裝好的小鼠血清，常溫解凍，elisa法測定小鼠特異性igg抗體水平。4.1.6熒光定量rt-pcr測定4.1.6.1組織中rna提取?取出各組小鼠保存在液氮中的脾臟組織，在depc水處理后的研缽中充分研磨至粉末狀。?加1mltrizol于1.5ml離心管中，再加入少許脾臟粉末，振蕩器充分混勻后，靜置5min。?加200μl氯仿于上述離心管中，蓋緊，用手顛倒混勻后，室溫放置10min，12000g離心15min（4℃離心機(jī)內(nèi)）。④吸出上清液于新的1.5ml離心管中，加500μl異丙醇，混勻，室溫靜置10min后，12000g離心10min（4℃離心機(jī)內(nèi)），保留沉淀。⑤加75%冷乙醇1ml于上述沉淀離心管中，充分洗滌沉淀，7500g離心5min（4℃離心機(jī)內(nèi)），棄上清。⑥室溫干燥rna至半透明狀。⑦向離心管中加20μldnase/rnase-freedeionizedwater溶解沉淀，-80℃凍存。rna提取圖，見附圖11。4.1.6.2反轉(zhuǎn)錄合成cdnatnf-α、il-2的基因序列從數(shù)據(jù)庫ncbi獲得，參照查詢的基因序列使用primer5.0軟件設(shè)計(jì)tnf-α、il-2定量引物，反轉(zhuǎn)錄引物使用試劑盒中的隨機(jī)引物，熒光定量引物序列見表11。表11熒光定量引物序列按照東洋紡試劑盒說明書步驟，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)，得到cdna產(chǎn)物，于-80℃保存。反轉(zhuǎn)錄加樣體系見表12。表12反轉(zhuǎn)錄加樣體系試劑加樣量totalrna7μl(1ug)primermix0.5μlrtenzymemix0.5μl5×rtbuffer2μltotal10μl4.1.6.3實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)以gapdh為內(nèi)參引物，采用熒光染料sybr-greeni檢測tnf-α、il-2在小鼠脾臟組織中相對表達(dá)量，每個(gè)樣品三個(gè)重復(fù)。擴(kuò)增反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性5min；95℃反應(yīng)10秒，60℃反應(yīng)30秒，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，記錄溶解曲線和擴(kuò)增曲線，每孔樣本的ct值，使用2-△△ct方法計(jì)算。反應(yīng)體系見表13。表13rt-pcr反應(yīng)體系4.1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用spss17.0應(yīng)用軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。多組間比較采用單因素方差分析法,以p<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.2.1af對小鼠免疫器官臟器指數(shù)的影響與m組比較，n、m-l、m-m組胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)均存在顯著性差異（p<0.01），m-h組無明顯變化，如表14所示。表14af對小鼠免疫器官臟器指數(shù)的影響note:*p＜0.05,**p＜0.01,comparedwithmodel4.2.2af對脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響與m組比較，m-l、m-m組脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率明顯增高，且m-l組呈現(xiàn)極顯著性，如附圖12所示。4.2.3af對小鼠血清中細(xì)胞因子tnf-α、il-2的影響如附圖13所示，與m組比較，n組血清中tnf-α含量顯著上升（p<0.01），呈極顯著性，m-l、m-m組血清中tnf-α含量升高（p<0.05），m-h組tnf-α含量與m組無明顯差異。與m組相比，m、m-l組血清中il-2含量明顯升高（p<0.01），m-m組il-2含量升高（p<0.05），m-h組il-2含量與m組無顯著性差異。4.2.4af對小鼠特異性igg抗體的影響結(jié)果顯示，m、m-l、m-m組小鼠獲得的免疫應(yīng)答良好，與m組小鼠比較，抗體水平極顯著性提高（p<0.01），m-h組無明顯變化，見附圖14。4.2.5af對小鼠脾臟組織中tnf-α、il-2mrna表達(dá)的影響熒光定量pcr結(jié)果顯示，tnf-α、il-2熔解曲線為單一峰,擴(kuò)增曲線均為典型s型,基線平整。m-l組tnf-α、il-2mrna表達(dá)分別為7.73±0.16、10.63±0.34，m-m組tnf-α、il-2mrna表達(dá)分別為2.6±0.03,5.43±0.23，顯著高于m組（1.83±0.72、2.45±0.02）（p＜0.01、p＜0.05），見附圖15。4.3討論本研究顯示，icr小鼠給藥28d后，顯著提高了免疫抑制小鼠脾臟及胸腺指數(shù)；m-l組脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)換率較m組顯著提高；m-l、m-m組小鼠特異性igg抗體明顯高于m組；免疫抑制小鼠血清中，腫瘤壞死因子tnf-α及白細(xì)胞介素-2il-2的含量顯著提高。且通過實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測，tnf-α及il-2mrna水平明顯增高。本試驗(yàn)以體內(nèi)給藥研究方式結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量pcr等體外試驗(yàn)進(jìn)行研究，結(jié)果表明，af可減輕ctx造成的免疫器官萎縮現(xiàn)象。從免疫應(yīng)答來看，本試驗(yàn)中免疫抑制af低劑量組、免疫抑制af中劑量組小鼠特異性igg抗體水平明顯高于免疫抑制模型組小鼠，陳勃[17]，guy等[18]研究表明，特異性igg抗體是血清主要的抗體成分，可清除有害補(bǔ)體片段，抑制炎癥反應(yīng)在機(jī)體免疫中起保護(hù)作用。本研究的igg水平表明，af能提高免疫抑制小鼠免疫應(yīng)答能力。劉佳等[19]，趙定亮等[20]報(bào)道，il-2能促進(jìn)t、b淋巴細(xì)胞的增值與分化，可誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞（lak）的產(chǎn)生?？梢栽鰪?qiáng)機(jī)體免疫監(jiān)視功能。譚兵等[21]，李衛(wèi)等[22]報(bào)道，tnf-α能夠抵抗微生物入侵和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫的功能。此次試驗(yàn)，用elisa試劑法，檢測出af免疫抑制組小鼠血清中il-2、tnf-α含量顯著提高。同時(shí)，采用熒光定量pcr，檢測tnf-α及il-2mrna水平。以上試驗(yàn)結(jié)果表明，af具有較強(qiáng)的免疫增強(qiáng)能力，能拮抗ctx免疫功能低下小鼠的免疫抑制作用。但本次試驗(yàn)，只是免疫研究中的一部分，應(yīng)進(jìn)一步探討研究，以充分證實(shí)試驗(yàn)結(jié)果。附圖說明圖1反應(yīng)時(shí)間對af合成率的影響圖2反應(yīng)溫度對af合成率的影響圖3料液比對af合成率的影響圖4蘋果酸加入量對af合成率的影響圖5.反應(yīng)溫度與反應(yīng)時(shí)間交互作用af合成率的影響圖6.反應(yīng)溫度與料液比交互作用af合成率的影響圖7.反應(yīng)溫度與蘋果酸加入量交互作用af合成率的影響圖8.反應(yīng)時(shí)間與料液比交互作用af合成率的影響圖9反應(yīng)時(shí)間與蘋果酸加入量交互作用af合成率的影響圖10.料液比與蘋果酸加入量交互作用af合成率的影響圖11.rna提取結(jié)果圖圖12.af對脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響圖13.af對小鼠血清中tnf-α、il-α含量的影響圖14.af對小鼠血清中igg含量的影響圖15.af對小鼠脾臟組織中tnf-α、il-2mrna表達(dá)的影響。具體實(shí)施方案實(shí)施例1精確稱取精氨酸：葡萄糖=1g:1g，加入丙三醇10ml和檸檬酸0.1g，搖床160rpm混勻，85℃條件下反應(yīng)120min，柱前衍生高效液相檢測af含量，合成率為55.52%。實(shí)施例2精確稱取精氨酸：果糖=1g:1g，加入丙三醇10ml和檸檬酸0.1g，搖床160rpm混勻，85℃條件下反應(yīng)120min，柱前衍生高效液相檢測af含量，合成率為58.52%。實(shí)施例3精確稱取精氨酸：果糖：木糖=1g:0.5g：0.5g，加入丙三醇10ml和檸檬酸0.1，搖床160rpm混勻，85℃條件下反應(yīng)180min，柱前衍生高效液相檢測af含量，合成率為60.52%。實(shí)施例4精確稱取精氨酸：木糖=1g:1g，加入丙三醇10ml和檸檬酸0.1g，搖床160rpm混勻，85℃條件下反應(yīng)120min，柱前衍生高效液相檢測af含量，合成率為65.52%。實(shí)施例5精確稱取精氨酸：木糖=1g:1g，加入丙二醇10ml和維生素c0.1g，搖床160rpm混勻，85℃條件下反應(yīng)120min，柱前衍生高效液相檢測af含量，合成率為45.52%。實(shí)施例6精確稱取精氨酸：木糖=1g:1g，加入異丙醇10ml和維生素c0.1g，亞硫酸鈉0.05g搖床160rpm混勻，85℃條件下反應(yīng)120min，柱前衍生高效液相檢測af含量，合成率為45.52%。實(shí)施例7精確稱取l-精氨酸：d-精氨酸：木糖=0.5g:0.5g：1g，加入異丙醇10ml和維生素c0.1g，亞硫酸鈉0.05g搖床160rpm混勻，85℃條件下反應(yīng)120min，柱前衍生高效液相檢測af含量，合成率為65.52%。實(shí)施例8抗衰老口服液取實(shí)施例1純化后的af粉末，配制成35mg/ml的水溶液，滅菌后裝入玻璃瓶中，制成每支10ml的口服液。其他要求符合《中華人民共和國藥典》2010版有關(guān)口服液的相關(guān)規(guī)定。實(shí)施例9美容護(hù)膚水取實(shí)施例1中純化的af粉末，加入護(hù)膚水基質(zhì)液中，af最終加入濃度為100mg/100ml。其他要求符合中國化妝品生產(chǎn)要求規(guī)范。參考文獻(xiàn)[1]takaku，t.,han,l.k.,kamedak.,etal.productionofarginyl-frictosylglucoseduringprocessingofredginseng.j.tradit.med.1996,13,118-123.[2]suzuki,y.,choi,k.j.,uchida,k.,etal.arginyl-fructosyl-glucoseandarginyl-fructose,compoundsrelatedtobrowningreactioninthemodelsystemofsteamingandheat-dryingprocessesforthepreparationofredginseng.j.ginsengres.2004,28,143-148.[3]趙婷.人工合成l-精氨酸單糖苷（af）及其抗糖尿病藥理活性研究[d].長春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.[4]kwang-hyounglee,kyoung-sooha,sung-hoonjo,etal.effectoflong-termdietaryarginyl-fru-ctose(af)onhyperglycemiaandhba1cindiabeticdb/dbmice.j.mol.sci.2014,15,8352-8359.[5]cho,e.j.;piao，x.l.;jang,m.h.etal.theeffectofsteamingonthefreeaminoacidcontentsandantioxidantactivityofpanaxginseng.j.foodchem.2008,107:876–882.[6]bylee,jung-sook;kim,gyo-nam;lee,sang-hyun,etal.invitroandcellularantioxidantactivityofarginyl-fructoseandarginyl-fructosyl-glucose.j.foodscienceandbiotechnology2009,18(6),1505-1510.[7]keum,y.s;park,k.k;lee,j.m.,etal.antioxidantandanti-tumorpromotingactivitiesofthemethanolextractofheat-processedginseng.j.cancerlett.2000,150,41-48.[8]程荔春，范青.主動(dòng)靶向脂質(zhì)體在抗腫瘤治療中的研究進(jìn)展[j].實(shí)用藥物與臨床，2011，14(5):426-429.[9]danzhang,yuhongsun,maoli,qinsun,minghualiu.effectsofperiplanetaamericanapolypeptideextractsontumorgrowthandimmunefunctionintumor-bearingmice[j].chinesejournalofnewdrugs,2015,24(6):681-686.[10]xinruiyang,gangwang,libinji,haiyanwang.effectsofarenariakansuensisaqueousextractonimmunefunctionofh22tumor-bearingmice[j].cancerresprevtreat,2015,42(7):662-665.[11]xiongq,jiaoy,zhaox,etal.purification,characterizationandimmunostimul-atoryactivityofpolysaccharidefromcipangopaludinachinensis[j].carbohydratepolymers，2013,98(1):217-223.[12]唐燕，張丹，孟祥林，等.白芍總苷脂質(zhì)體對荷瘤小鼠腫瘤生長及免疫功能的影響[j].中國新藥雜志，2014，23（21）：2547-2551.[13]李墨林，李傳剛，舒曉宏．美法侖治愈荷瘤小鼠的過程與tnf-α的關(guān)系[j].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2007，23(4):320．[14]jakharr,pauls,pardyr,elal.3,5,7,3’,4’-pentamethoxyflavone,aquercetinderivativeprotectsdnafromoxidativechallenges:potentialmechanismofaction[j].photochemphotobiolb,2014,131:96-103.[15]fuhuali,dongliu,jianming.cellularantioxidantandantiproliferativeactivitiesofflavonoidsextractedfromtartarybuckwheat(fagopyrumtartaricum(l.)gaertn)bran[j].foodscience,2014.35(7):58-63.[16]esterbauerh,schaurrj,zolnerh.chemistryandbiochemistryof4-hydroxynonenal,malonaldehydeandrelatedaldehydes[j].freeradicbiolmed,1991,11(1):81-128.[17]陳勃.h-igg對新生大鼠腦缺血缺氧性損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究[d].長春：吉林大學(xué)，2013，16-22.[18]guyb,hesslerc,fourages,etal.systemicimmunizationwithureaseprotectsmiceagainsthelicobacterpyloriinfectionj.vaccine,1998,16(8):850-856.[19]劉佳，單安山，孫進(jìn)華.白細(xì)胞介素-2的研究進(jìn)展與應(yīng)用[j].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2009（21）：57-61.[20]趙定亮，單風(fēng)平.細(xì)胞介素-2最新研究進(jìn)展[j].微生物學(xué)雜志，2013，5（4）：77-79.[21]譚兵，李瑜元，聶玉強(qiáng).腫瘤壞死因子-α的研究進(jìn)展[j].國際內(nèi)科學(xué)雜志，2007,5（3）：129-133.[22]李衛(wèi)，劉佳，白家媛.α腫瘤壞死因子的研究進(jìn)展[j].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010,6（12）：12-14。當(dāng)前第1頁12