本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及茄子高溫脅迫內(nèi)參基因的篩選及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：
茄子(SolanummelongenaL.)屬于茄科茄屬蔬菜作物，在世界各地廣泛栽培。茄子生產(chǎn)容易受到高溫脅迫影響(李植良等，2009)。因此，耐熱性資源和基因挖掘是茄子育種的重要目標(biāo)之一。基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序比較耐熱品種和熱敏品種基因表達(dá)差異的研究過程中，較多的涉及到應(yīng)用q-PCR驗(yàn)證和分析基因表達(dá)模式和水平，因此篩選高溫脅迫條件下穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因?qū)-PCR結(jié)果起著關(guān)鍵作用。目前，在茄科作物上常用的內(nèi)參基因有3–磷酸甘油醛脫氫酶基因(GAPDH)、18S核糖體RNA(18sRNA)、肌動(dòng)蛋白基因(ACTIN)、多聚泛素酶基因(UBQ)、轉(zhuǎn)錄延伸因子基因(EF1)、親環(huán)蛋白基因(CYP)和α微管蛋白基因(TUA)等。我們采用RNA-Seq技術(shù)研究了熱敏茄子自交系05-1和耐熱茄子自交系05-4高溫脅迫處理前后的基因表達(dá)譜，采用q-PCR驗(yàn)證基因表達(dá)水平，以SmActin作為內(nèi)參基因，發(fā)現(xiàn)SmActin表達(dá)會(huì)受到高溫脅迫影響較大。因此，目前進(jìn)行茄子耐熱性相關(guān)基因的表達(dá)研究工作中最亟待解決的難題是：篩選穩(wěn)定性好的內(nèi)參基因。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供幾個(gè)茄子高溫脅迫條件下基因表達(dá)譜中穩(wěn)定表達(dá)的基因，以其作為茄子高溫脅迫內(nèi)參基因。本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：茄子高溫脅迫內(nèi)參基因，其為茄子轉(zhuǎn)錄延伸因子EF1A基因、轉(zhuǎn)錄延伸因子EF2基因、核糖體蛋白R(shí)PL24基因、核糖體蛋白R(shí)PS29基因、硫氧還蛋白TRX基因、酪蛋白激酶基因、DAHP合酶基因或Unigene0048390基因。所述轉(zhuǎn)錄延伸因子EF1A基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述轉(zhuǎn)錄延伸因子EF2基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，核糖體蛋白R(shí)PL24基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，核糖體蛋白R(shí)PS29基因的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，硫氧還蛋白TRX基因的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，酪蛋白激酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示，DAHP合酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示，Unigene0048390基因的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示。以上所述的茄子高溫脅迫內(nèi)參基因在茄子耐熱性基因篩選或研究中的應(yīng)用。用于擴(kuò)增茄子高溫脅迫內(nèi)參基因的PCR引物。所述的PCR引物在茄子耐熱性基因篩選或研究中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明篩選了8個(gè)高溫脅迫條件下在茄子基因表達(dá)譜中穩(wěn)定表達(dá)的基因，以其作為茄子高溫脅迫內(nèi)參基因，有利于提高茄子高溫脅迫條件下基因表達(dá)分析研究的穩(wěn)定性和可靠性。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此。實(shí)施例1高溫脅迫下茄子內(nèi)參基因的篩選通過基于RNA-Seq篩選得到熱敏(05-1)和耐熱(05-4)茄子品系自交系幼苗在正常生長(zhǎng)溫度和6h高溫脅迫后共4個(gè)樣本(05-1CK、05-16h、05-4CK、05-46h、)的22215個(gè)Unigene的RPKM值，得到了8個(gè)表達(dá)穩(wěn)定的Unigene作為候選內(nèi)參基因(見表1)。表1RNA-Seq中代表各Unigene表達(dá)水平的RPKM值針對(duì)以上篩選得到的8個(gè)候選內(nèi)參基因，分別設(shè)計(jì)qPCR引物，其序列如表2所示：表29個(gè)茄子內(nèi)參基因的引物序列實(shí)施例2候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性分析1、不同高溫脅迫時(shí)間下，候選內(nèi)參基因在熱敏和耐熱茄子葉片中的表達(dá)穩(wěn)定性分析(1)以苗期高溫脅迫鑒定及田間均表現(xiàn)為耐熱的親本自交系05-4和熱敏感的親本自交系05-1為植物材料(孫保娟等，2007；孫保娟等，李植良等，2009)。(2)27℃培養(yǎng)30d左右，當(dāng)幼苗具有4片真葉時(shí)進(jìn)行42℃高溫高溫脅迫處理不同時(shí)間(0h，0.5h，1h，2h，4h，6h，12h，24h)。每個(gè)處理10株，設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。以未進(jìn)行任何高溫處理的材料作為對(duì)照。(3)采用Trizol試劑(Invitrogen)進(jìn)行RNA提取，反轉(zhuǎn)錄使用M-MML逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)，利用OligoT15引物進(jìn)行cDNA的合成，操作步驟均參照公司提供的實(shí)驗(yàn)手冊(cè)。將產(chǎn)物稀釋5倍后作為PCR擴(kuò)增的模板。表達(dá)分析采用表2的引物組合，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，試劑為PremixExTaqTM試劑盒(Bio-RAD)。反應(yīng)程序：94℃，3min，[94℃20s；56℃，20s，72℃，20s]×40個(gè)循環(huán)；溶解曲線程序：65℃加熱至90℃，5s。每次反應(yīng)要重復(fù)三次。PCR完成后，經(jīng)自動(dòng)分析，查看每個(gè)基因的擴(kuò)增情況，導(dǎo)出相應(yīng)的域值循環(huán)數(shù)(cycleatthreshold)，即Ct值，詳見表3。表3高溫脅迫不同時(shí)間候選內(nèi)參基因在熱敏和耐熱茄子葉片中平均Ct值(4)對(duì)熒光定量PCR反應(yīng)后得到的Ct值，使用GeNorm、Bestkeeper和Normfinder軟件進(jìn)行各候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性進(jìn)行分析。GeNorm軟件計(jì)算每個(gè)候選基因表達(dá)穩(wěn)定度M值，M值越高，表達(dá)越不穩(wěn)定。NormFinder軟件結(jié)合組內(nèi)方差與組間方差計(jì)算出各候選內(nèi)參基因穩(wěn)定值，該值越小，表明內(nèi)參基因越穩(wěn)定。Bestkeeper可以直接輸入Ct值，通過計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差和變異系數(shù)值的大小比較各內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)越小，穩(wěn)定性越好。從表4可見，基于RNA-Seq得到的8個(gè)候選內(nèi)參基因在茄子高溫脅迫不同時(shí)間、不同品種中的表達(dá)穩(wěn)定性均優(yōu)于對(duì)照SmActin。表4高溫脅迫不同時(shí)間候選內(nèi)參基因在茄子不同品種中的表達(dá)穩(wěn)定性(M值)的分析結(jié)果2、高溫脅迫下，候選內(nèi)參基因在茄子不同組織中表達(dá)穩(wěn)定性分析(1)分別以茄子耐熱自交系05-4和熱敏感自交系05-1高溫脅迫處理6h及對(duì)照的根、莖和葉作為實(shí)驗(yàn)材料。(2)提取RNA、反轉(zhuǎn)錄，采用表2的引物組進(jìn)行qPCR分析。得到的Ct值如表5：表5高溫脅迫下候選內(nèi)參基因熱敏和耐熱茄子不同組織中的平均Ct值(3)對(duì)熒光定量PCR反應(yīng)后得到的Ct值，使用GeNorm、Bestkeeper和Normfinder軟件進(jìn)行各候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性進(jìn)行分析，結(jié)果如表6。從表6可見，8個(gè)候選內(nèi)參基因在高溫脅迫不同組織中表達(dá)穩(wěn)定性均比對(duì)照內(nèi)參基因SmActin好，但從GeNorm分析得到的M值來看，SmRPL24、SmRPS29基因的M值大于1.5，因此，同SmActin一樣，不適宜作為高溫脅迫下茄子不同組織基因表達(dá)水平分析的內(nèi)參基因。表6候選內(nèi)參基因在茄子不同組織中(M值)表達(dá)穩(wěn)定性分析3、候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性的綜合分析對(duì)GeNorm、NormFinder、Bestkeeper法分析得到的穩(wěn)定性排名采用ReFinder軟件求幾何平均值，得到綜合指數(shù)排名，該指數(shù)越小，說明內(nèi)參基因表達(dá)越穩(wěn)定。8個(gè)候選內(nèi)參基因在熱敏和耐熱茄子自交系高溫脅迫不同時(shí)間、不同組織表達(dá)穩(wěn)定性綜合排名如表7。從表7可見，基于RNA-Seq數(shù)據(jù)開發(fā)得到的8個(gè)候選內(nèi)參基因，不同高溫脅迫時(shí)間、不同組織及總體表現(xiàn)均優(yōu)于對(duì)照內(nèi)參基因SmActin；就不同高溫脅迫時(shí)間而言，排名前3的內(nèi)參基因?yàn)镾mEF1A、SmUCP和SmRPL24，對(duì)高溫脅迫下不同組織而言，排名前3的內(nèi)參基因是SmEF1A、SmTRX和SmDAHP；適用于高溫脅迫下不同時(shí)間處理、不同組織樣品基因表達(dá)分析最佳的內(nèi)參基因是SmEF1A，其次是SmTRX和SmUCP。表7內(nèi)參基因綜合排名表現(xiàn)由此，我們得到了在茄子正常生長(zhǎng)溫度和高溫脅迫下不同時(shí)間和不同組織中最穩(wěn)定表達(dá)的3個(gè)內(nèi)參基因：SmEF1A、SmTRX、SmUCP。它們可以應(yīng)用于茄子耐熱性基因的篩選或研究中。<110>廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所<120>茄子高溫脅迫內(nèi)參基因及其應(yīng)用<130><160>26<170>PatentInversion3.5<210>1<211>876<212>DNA<213>SolanummelongenaL.<400>1agttaaatctgttgagatgcaccatgaggctcttcaggaggctcttcctggtgacaatgt60tgggttcaacgtcaagaatgttgcagttaaggatcttaagagaggttatgttgcttctaa120ctccaaagatgacccagcaaagggagctgccagcttcactgcccaagtcatcatcatgaa180ccatcctggacagattggaaatggatatgcgccagtgctcgactgccacacttctcatat240tgctgtcaagtttgctgagatcttgaccaagattgacagacgttctggtaaggaacttga300gaaggagcccaagtttttgaagaatggtgatgctggtatggttaagatgattcccaccaa360gcccatggttgttgagaccttctctgagtacccaccattgggacgttttgctgtgaggga420catgcgtcaaactgttgctgttggtgtcgtcaagaacgttgaaaagaaagaccctactgg480tgccaaagttaccaaggctgctcaaaagaagaagtgatgtgtttttgatgagattctgca540ttgttgaactagttttgtttaattgcattagctattttcagttttgttttggacatttta600ctggtcatagatatggctccagaagcttttgtcatgtttctctagcctctttcgaggata660gtggagttgttgagcaatttggattgatccaagttgcttgatgggcactgacaatagcac720ctctggatgcctttctcatgtctggttatttatagcaaatttcaagatgagctgccgaga780cggtttaaatatgttacgcttttgggacgtcttttctcttgcattctcttccatatttaa840tttattattatgttattgattagttctccttcccta876<210>2<211>3457<212>DNA<213>SolanummelongenaL.<400>2aagagaagacctcgccgcctccttctctctgcactgaacaaaaaataattcttagttaca60tcaacaagcattcaagatggtgaagttcacagctgaagagcttagaaggattatggactt120caagcataacattcgtaatatgtctgttattgctcatgtggaccatggaaaatctaccct180tactgattctctcgtgg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