專利名稱：：使用IL-1α自身抗體診斷、治療和預(yù)防血管疾病的制作方法專利說(shuō)明使用IL-1α自身抗體診斷、治療和預(yù)防血管疾病發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及血管疾病的診斷、治療、和預(yù)防。更特別地，本發(fā)明涉及使用IL-1α自身抗體診斷、治療、和預(yù)防血管疾病。
背景技術(shù)：
：數(shù)十年來(lái)，動(dòng)脈硬化(atherosclerosis)在至少三種疾病——心臟病(heartdisease(HD))、末梢動(dòng)脈疾病((peripheralarterialdisease(PAD))和腦血管疾病(cerebrovasculardisease(CD))——中的作用被研究。這些疾病類別中的病理進(jìn)程是類似的，并且動(dòng)脈硬化現(xiàn)在被認(rèn)為是一種系統(tǒng)性疾病，而與哪一個(gè)血管床(vascularbed)被影響無(wú)關(guān)。因此，動(dòng)脈硬化的社會(huì)負(fù)擔(dān)是巨大的在2002年，估計(jì)全美國(guó)有71,100,000人受心臟病的影響，導(dǎo)致947,428人死亡并耗費(fèi)3935億美元。在2005年，有5,400,000美國(guó)人忍受中風(fēng)的影響，在醫(yī)療保健方面的花費(fèi)預(yù)計(jì)達(dá)$56.8。預(yù)計(jì)動(dòng)脈硬化的全球負(fù)擔(dān)會(huì)上升。動(dòng)脈硬化是一種系統(tǒng)疾病。在許多患者中，它是潛伏的、并影響一個(gè)以上的血管床。動(dòng)脈硬化的早期檢測(cè)或?qū)θ菀装l(fā)生動(dòng)脈硬化的患者的辨認(rèn)，對(duì)預(yù)防患病和死亡是很關(guān)鍵。因此，在本領(lǐng)域內(nèi)需要確定能辨別存在患動(dòng)脈硬化危險(xiǎn)的患者的方法以及治療已經(jīng)受動(dòng)脈硬化相關(guān)疾病影響的患者的方法。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及人體中高滴定量IL-1α自身抗體降低缺血性心臟病或其發(fā)展為冠心病風(fēng)險(xiǎn)的觀察發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明提供了通過(guò)確定個(gè)體的IL-1α自身抗體的滴定量，來(lái)檢測(cè)該個(gè)體發(fā)生動(dòng)脈硬化或動(dòng)脈硬化相關(guān)疾病之風(fēng)險(xiǎn)的強(qiáng)有力的手段。本發(fā)明也提供了使用IL-1α自身抗體來(lái)降低血管疾病(如，冠心病、末梢動(dòng)脈疾病、和腦血管疾病)的風(fēng)險(xiǎn)、發(fā)展、或癥狀的方法。在被分析的患者中，高達(dá)50％的患者，主要是在老年男性中，IL-1α被以足夠誘發(fā)高親和度、高滴定度、中和性的抗體反應(yīng)的量釋放。Hansen等，《歐洲臨床研究雜志》(Eur.J.Clin.Invest.)24，212-18，1994。而且，個(gè)體產(chǎn)生IL-1α自身抗體的能力，提供了保護(hù)效應(yīng)，對(duì)抗了IL-1α在動(dòng)脈壁病理炎癥性過(guò)程(動(dòng)脈硬化)的發(fā)展中的一些未知作用。血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)與IL-1α自身抗體滴定度之間的相關(guān)性是令人吃驚的，因?yàn)閾?jù)信IL-1α主要在細(xì)胞間水平上發(fā)揮其生物學(xué)作用，在產(chǎn)生IL-1α作為膜關(guān)聯(lián)分子的細(xì)胞之臨近區(qū)域中作為一種自分泌物質(zhì)，或作為一種嚴(yán)格的副分泌物質(zhì)。此外，目前沒(méi)有機(jī)理可以解釋IL-1α在動(dòng)脈硬化發(fā)展中的作用。因此，靶向IL-1α的抗體在治療或防止血管疾病上有治療價(jià)值是在意料之外的。IL-1α自身抗體(IL-1αautoantibodies)根據(jù)本發(fā)明，“IL-1α自身抗體”包括從B細(xì)胞(包括活化的和/或永生B細(xì)胞)、血液、血清、或血漿中分離出的全長(zhǎng)抗體；包含全長(zhǎng)IL-1α自身抗體中的IL-1α結(jié)合位點(diǎn)的功能抗體片段(如，F(xiàn)(ab)′2片段，F(xiàn)(ab)′片段，F(xiàn)ab片段，雙鏈Fv片段，和單鏈抗體)；通過(guò)表達(dá)來(lái)源于B細(xì)胞的cDNA所產(chǎn)生的重組免疫球蛋白分子或表達(dá)編碼免疫球蛋白分子的合成核苷酸序列產(chǎn)生的重組免疫球蛋白分子；單克隆自身抗體(按照以下描述產(chǎn)生)；和合成的IL-1α自身抗體(按照以下描述產(chǎn)生)。IL-1α自身抗體通常是一種IgG分子，特別地，是IgG4分子(Garrone等，《分子免疫學(xué)》(Mol.Immunol.)33，649-58，1996)，但也可以是IgM，IgE，IgA或IgD分子。IL-1α自身抗體也包括與另一分子(例如受體、配體、酶、毒素、載體、等等)偶聯(lián)的上述任何分子，以及由一種同型(isotype)自身抗體的可變部分與另一種同型的恒定部分結(jié)合構(gòu)成的自身抗體。IL-1α自身抗體優(yōu)選地與IL-1α以高親和力結(jié)合。高親和力IL-1α自身抗體一般對(duì)IL-1α結(jié)合的平衡親和常數(shù)(Ka；或KD的倒數(shù))在1014M-1到5×10-7M-1之間(如，5×107，10-13，5×108，10-12，5×108，109，5×109，1010，5×1010，1011，5×1011，1012，5×1012，1013，或5×1013M-1)。IL-1α自身抗體與IL-1α的特異結(jié)合可以用任何合適的方法進(jìn)行測(cè)定，這些方法包括，例如，諸如實(shí)時(shí)雙分子互動(dòng)分析(real-timeBimolecularInteractionAnalysis)(BIA)(Sjolander&Urbaniczky，Anal.Chem.63，2338-45，1991和Szabo等，Curr.Opin.Struct.Biol.5，699-705，1995)的技術(shù)。如本領(lǐng)域已知的，Ka可通過(guò)特定結(jié)合數(shù)據(jù)的Scatchard圖線計(jì)算得到。也參見(jiàn)美國(guó)專利5,959,085。本發(fā)明的IL-1α自身抗體，優(yōu)選地，在體外和體內(nèi)，中和IL-1α的生物活性(如，IL-1α誘導(dǎo)的IL-2分泌)。更優(yōu)選地，IL-1α自身抗體降低或消除IL-1α與其受體的結(jié)合。中和活性和受體結(jié)合活性，可用Satoh等在《免疫藥物學(xué)》(Immunopharmacology)27，107-18，1994中所描述的方法進(jìn)行測(cè)定。[10]下面所述的方法及組合物包括人IL-1α自身抗體和其它哺乳動(dòng)物IL-1α自身抗體，這些哺乳動(dòng)物包括但不限于，其它靈長(zhǎng)類動(dòng)物(如大猩猩、黑猩猩、狒狒、松鼠猴)，同伴動(dòng)物(companionanimals)(如貓、兔子、狗、馬)，家畜(如牛、綿羊、豬、山羊、馬)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(如貓、狗、豚鼠、兔子、綿羊、山羊、豬、黑猩猩和狒狒)。獲得IL-1α自身抗體的方法[11]IL-1α自身抗體可通過(guò)多種方法獲得。在一些實(shí)施方式中，多克隆IL-1α自身抗體的制劑可從B細(xì)胞、血液、血漿或血清中獲得，或者來(lái)自單一個(gè)體或從2個(gè)或更多個(gè)體的合并樣本獲得。B細(xì)胞來(lái)源包括外周血、扁桃體、腺樣增殖體、和脾臟。參見(jiàn)美國(guó)專利5,959,085。該個(gè)體或者這些個(gè)體可以是健康的或有自身免疫疾病，特別是IL-1α自身抗體過(guò)度產(chǎn)生的自身免疫疾病。這些疾病包括，如Schnitzler綜合癥(Schnitzler’ssyndrome)(Saurat等，J.AllergyClin.Immunol.88，244-56，1991)，自免疫起泡疾病(autoimmuneblisteringdisorder)(如，天皰瘡/類天皰瘡(pemphigus/phemphigoid))(Garrone等，1996)，和慢性炎癥性關(guān)節(jié)炎(Garrone等，1996)。循環(huán)IL-1α自身抗體存在呈陽(yáng)性的獻(xiàn)血者可通過(guò)已知的方法，如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、放射性免疫沉淀反應(yīng)(radioimmunoprecipitation)、蛋白質(zhì)印跡法(Westernblot)等，進(jìn)行辨別。參見(jiàn)如Satoh等，1994；Saurat等，1991；Svenson等，J.Clin.Invest.92，2533-39，1993；Bendtzen等，Mol.Biotechnol.14，251-61，2000；Svenson等，Scand.J.Immunol.29，489-92，1989；Svenson等，Scand.J.Immunol.32，695-701，1990；Svenson等，J.Clin.Invest.92，2533-39，1993；和Svenson等，Cytokine4，125-33，1992。在一些實(shí)施方式中，血漿用血漿取出法(plasmapheresis)或清血法(apheresis)獲得。[12]在一些實(shí)施方式中，捐獻(xiàn)者的血清用IL-1α酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linkedimmunoadsorbantassay(ELISA))進(jìn)行篩選。因?yàn)檠逯蟹浅Ｉ倭康淖杂蒊L-1α與針對(duì)IL-1α的中和性自身抗體的存在相關(guān)，該測(cè)試可以非?？焖俚睾Y選并初步選出那些有提供合適的中和性抗體的高可能性的捐獻(xiàn)者血清。該方法可以簡(jiǎn)化初始篩選過(guò)程并縮短發(fā)展時(shí)間。IL-1α測(cè)試試劑盒可從例如AbazymeLLC；AlpcoDiagnostics；AntigenixAmericaInc.；AutogenBioclearUKLtd；BenderMedSystems；BiosourceInternational；BioVision；CaymanChemical；CellSciences；CHEMICON；CytoLabLtd.，Endogen；GEHealthcare(以前為AmershamBiosciences)；LeincoTechnologies，Inc.；PeproTech；和R&DSystems公司得到。[13]IL-1α自身抗體可從個(gè)體或合并的血液、血漿、或血清中，用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行純化，所述方法如超濾、滲析、固定于非特異蛋白支持物后清洗或在特異蛋白支持物上進(jìn)行親和色譜。參見(jiàn)US2005/0147603。人IL-1α自身抗體可由人IgG的商業(yè)制劑(如，SANDOGLOBULIN(Sandoz，哥本哈根，丹麥))，GAMMAGARD(Baxter，Allerd，丹麥)，或NORDIMMUN(NovoNordisk，Bagsvaerd，丹麥)純化獲得。參見(jiàn)Ross等，J.InterferonRes.14，159-60，1994；Svenson等，J.Clin.Invest.92，2533-39，1993。IL-1α自身抗體的親和純化在如，Satoh等，1994中描述的。[14]在一些實(shí)施方式中，例如，從100個(gè)捐獻(xiàn)者收集到的血漿或血清的合并物，可用蛋白G親和色譜法，測(cè)試放射性標(biāo)記的IL-1α與IgG的結(jié)合作用。合適的放射性標(biāo)記是125I。放射性示蹤物被觀察到與合并物中的IgG結(jié)合，且加入到合并物中的天然IL-1α的回收可用IL-1αELISA進(jìn)行測(cè)定。產(chǎn)生陽(yáng)性合并物的捐獻(xiàn)者的血漿或血清，可被單獨(dú)重測(cè)定；并且，在10％血漿中，IL-1α對(duì)IgG的可飽和結(jié)合(通過(guò)放射性標(biāo)記的IL-1α與IgG的飽和結(jié)合判斷)可以被測(cè)定。例如，IL-1α自身抗體呈高度陽(yáng)性的捐獻(xiàn)者血漿的稀釋物，可與125I標(biāo)記的IL-1α(3,500cpm)，以終體積200μl進(jìn)行溫育。IgG結(jié)合的示蹤物可用G蛋白親和色譜法分析。IgG結(jié)合的和無(wú)125I標(biāo)記的IL-1α可通過(guò)二抗沉淀進(jìn)行分離。平均解離或親和常數(shù)，以及最大的IL-1α和IgG結(jié)合能力，可用Scatchard圖計(jì)算。[15]高陽(yáng)性血清的捐獻(xiàn)者，即那些血漿抗體濃度在0.1nM到35nM間含有皮摩爾(picomolar)親和力的IL-1α自身抗體，可被用于從外周血中收集產(chǎn)生IL-1α自身抗體的B淋巴細(xì)胞。然而，有用的IL-1α自身抗體可顯示出某一范圍的親和力，從飛摩爾(femptomolar)到納摩爾(nanomolar)的親和力，該范圍內(nèi)的親和力——取決于靶點(diǎn)及抗體治療所期望的藥物動(dòng)力學(xué)，均可被認(rèn)為是治療上有用的。血漿中IL-1α自身抗體的濃度可能會(huì)隨著克隆或富集的敏感程度和效率發(fā)生顯著變化，可能在0.1皮摩爾到0.1納摩爾的范圍內(nèi)，或相反地，正如在血漿B細(xì)胞惡性腫瘤的例子中，可能在高濃度的35nM到3500nm的范圍內(nèi)。產(chǎn)生IL-1α自身抗體的外周血淋巴細(xì)胞可在培養(yǎng)基中接受刺激而生長(zhǎng)，也因此可以用本領(lǐng)域已知方法成為永生細(xì)胞，例如使用病毒(即，愛(ài)-巴病毒(EpsteinBarrvirus)，EBV)、化學(xué)試劑、或核酸(如致癌基因)。這些永生細(xì)胞接著可以用已知方法克隆，來(lái)提供大量人IL-1α自身抗體的可靠來(lái)源。[16]在一些實(shí)施方式中，來(lái)自合適捐獻(xiàn)者的血液樣品中的B淋巴細(xì)胞，用EBV、在受輻射單核細(xì)胞與toll樣受體激動(dòng)劑(toll-likereceptoragonist)(如CpG寡核苷酸)的存在下，在大量培養(yǎng)液中被永生化(immortalized)，其中toll樣受體激動(dòng)劑起到記憶B細(xì)胞的多克隆活化劑的作用并提高它們對(duì)EBV感染的易感性。之后，永生B淋巴細(xì)胞通過(guò)磁力與熒光激活(fluorescence-activated)細(xì)胞分選的組合方法，選出IgG陽(yáng)性的記憶B淋巴細(xì)胞。在12-14天后，對(duì)來(lái)自含有10個(gè)IgG陽(yáng)性記憶B細(xì)胞的培養(yǎng)基上清液進(jìn)行分析，以便分析特異性IL-1α自身抗體的存在。陽(yáng)性培養(yǎng)物被重涂平板，并用限制稀釋(limitingdilution)來(lái)分離單個(gè)的、有適當(dāng)IL-1α自身抗體生產(chǎn)力的永生B淋巴細(xì)胞克隆。參見(jiàn)，例如WO91/09115和美國(guó)專利5,959,085。[17]在另一個(gè)實(shí)施方式中，如本領(lǐng)域所熟知，分離的淋巴細(xì)胞被用于產(chǎn)生雜交瘤(參見(jiàn)，如《酶學(xué)方法》(MethodsinEnzymology)，121卷，第I和II部分，1986；Garrone等，1996)。如本領(lǐng)域所熟知，產(chǎn)生IL-1α自身抗體的雜交瘤可在體外繁殖，以提供該自身抗體的穩(wěn)定來(lái)源?？蛇x地，雜交瘤細(xì)胞可被注射進(jìn)小鼠腹膜內(nèi)，之后它們產(chǎn)生腫瘤。這些腫瘤伴隨著腹水積液的產(chǎn)生，這些腹水積液中含有所希望的單克隆自身抗體。單克隆自身抗體可用傳統(tǒng)的方法，如超濾、超速離心、滲析、和免疫親和色譜法，從腹水積液中回收出來(lái)。[18]RNA可以從永生B細(xì)胞克隆或雜交瘤克隆中獲得，并被用作擴(kuò)增反應(yīng)(如，PCR)的模板，從而獲得編碼IL-1α自身抗體的cDNA。參見(jiàn)美國(guó)專利5,959,085。采用本領(lǐng)域熟知的重組DNA方法，編碼全長(zhǎng)IL-1α自身抗體或其功能化片段的cDNA可以被包含在表達(dá)載體中，并被用于在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)IL-1α自身抗體。參見(jiàn)，例如Garrone等，1996。宿主細(xì)胞接下來(lái)可被用于增殖IL-1α自身抗體?？蛇x地，任意特定IL-1α自身抗體可被分離，并且其氨基酸序列可用已知方法確定。編碼該氨基酸序列的核酸分子可被合成，并被用在表達(dá)載體中來(lái)產(chǎn)生克隆的IL-1α自身抗體。如果需要，IL-1α自身抗體的原始重鏈恒定區(qū)域可用不同型(如，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA，IgD，IgM或IgE)的恒定區(qū)域取代。參見(jiàn)美國(guó)專利5,959,085。[19]IL-1α自身抗體可用本領(lǐng)域已知技術(shù)化學(xué)合成。參見(jiàn)，如Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85，2149-2154，1963；Roberge等，《科學(xué)》(Science)269，202-04，1995。蛋白合成可用手工技術(shù)(manualtechnique)或借助自動(dòng)操作進(jìn)行。自動(dòng)化合成可使用例如AppliedBiosystems431A肽合成儀(peptidesynthesizer)(PerkinElmer)完成。任選地，IL-1α自身抗體的片段可分別合成，并用化學(xué)方法結(jié)合起來(lái)以產(chǎn)生全長(zhǎng)分子。[20]IL-1α自身抗體可通過(guò)可通過(guò)篩選抗體文庫(kù)獲得，如HuCAL(Knappik等，《分子生物學(xué)雜志》(J.Mol.Biol.)296，57-86，2000)，scFv噬菌體展示文庫(kù)(如，Pharmacia重組噬菌體抗體系統(tǒng)，目錄號(hào)27-9400-01；和StratageneSURZAPTM噬菌體展示試劑盒，目錄號(hào)240612)，等等。參見(jiàn)WO92/18619；WO92/20791；WO93/01288；WO92/01047；WO92/09690；Fuchs等，Bio/Technology9，1370-72，1991；Hay等，(1992)HumAntibodHybridomas3；81-85；Huse等，(1989)《科學(xué)》(Science)2461275-1281；McCafferty等，《自然》(Nature)(1990)348552-554；Griffiths等，(1993)EMBOJ.12725-734；Hawkins等，(1992)JMolBiol226889-896；Clackson等，(1991)《自然》(Nature)352624-628；Gram等，(1992)PNAS89357&3580；Garrad等，(1991)Bio/Technology91373-1377；Hoogenboom等，(1991)NucAcidRes194133-4137；和Barbas等，(1991)PNAS887978-7982。[21]如果需要，可對(duì)IL-1α自身抗體進(jìn)行修飾，以便增強(qiáng)其對(duì)IL-1α的親和結(jié)合力。參見(jiàn)，如美國(guó)專利6,914,128。篩選方法[22]根據(jù)本發(fā)明，低滴定度的IL-1α自身抗體，或低親和力的人抗IL-1α自身抗體的存在，表示該個(gè)體發(fā)生動(dòng)脈硬化相關(guān)疾病或該個(gè)體動(dòng)脈硬化相關(guān)疾病嚴(yán)重程度加劇的可能性。如果在免疫檢驗(yàn)(如，放射性免疫檢驗(yàn)，ELISA，或蛋白質(zhì)印記法)中，在個(gè)體血清稀釋度不超過(guò)約1∶100(如，1∶1，1∶10，1∶50，或1∶100的稀釋度)時(shí)，檢測(cè)到陽(yáng)性反應(yīng)，那么該個(gè)體有“低滴定度”的IL-1α自身抗體。如果在稀釋程度大于1∶100(如，1∶1000，1∶10,000，1∶100,000等)的免疫檢測(cè)中仍能檢測(cè)到陽(yáng)性反應(yīng)，那么該個(gè)體有“高滴定度”的IL-1α自身抗體。低親和度的IL-1α自身抗體通常對(duì)IL-1α結(jié)合的Ka在10M-1到107M-1之間(如，10，5×102，103，5×103，104，5×104，105，5×105，106，5×106，和107M-1)。[23]從某個(gè)體取得的測(cè)試生物學(xué)樣本(包括，如血液、血漿、血清)可被檢測(cè)，以確定其IL-1α自身抗體的測(cè)試滴定度。該個(gè)體可以是健康的，或表面上健康的，或可以是已知患有動(dòng)脈硬化相關(guān)疾病的。動(dòng)脈硬化相關(guān)疾病可以是，例如腦血管疾病、外周血管疾病、缺血性心臟疾病或冠狀動(dòng)脈疾病。[24]本領(lǐng)域中已知的任何方法都可用于檢測(cè)個(gè)體測(cè)試生物樣本中的IL-1α自身抗體。這些方法包括，但不限于與放射性標(biāo)記的IL-1α的結(jié)合作用，ELISA，IL-1α與其受體的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合作用，用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)的FITC標(biāo)記的IL-1α，蛋白質(zhì)印跡法等。參見(jiàn)，如Bendtzen等，Mol.Biotechnol.14，251-61，2000；Ross等，Blood90，2376-80，1997；Hansen等，Immunol.Lett.30，133，1991；Svenson等，Scand.J.Immunol.29，489-92，1989；Svenson等，Scand.J.Immunol.32，695-701，1990；Svenson等，Cytokine4，125-33，1992；Saurat等，J.AllergyClin.Immunol.88，244-56，1991。優(yōu)選的是，如在Bendtzen等，Mol.Biotechnol.14，251-61，2000中描述的那些放射性免疫檢測(cè)。測(cè)試生物學(xué)樣本中IL-1α自身抗體的滴定度，可用本領(lǐng)域已知標(biāo)準(zhǔn)方法計(jì)算。檢測(cè)可以是定性測(cè)定或定量測(cè)定?？蛇x地，使用FITC標(biāo)記的IL-1α分辨表達(dá)IL-1α自身抗體的B淋巴細(xì)胞，IL-1α特異B淋巴細(xì)胞頻率可與血清中IL-1α水平相關(guān)，且因此成為發(fā)生動(dòng)脈硬化或相關(guān)疾病風(fēng)險(xiǎn)的指示。藥物組合物與治療方法[25]本發(fā)明的藥物組合物包括上面定義的高親和力的IL-1α自身抗體。IL-1α自身抗體可由單一來(lái)源(例如，單一個(gè)體，永生B細(xì)胞克隆的克隆，或單一雜交瘤)或由兩個(gè)或多個(gè)這樣的來(lái)源衍生，兩個(gè)或多個(gè)這樣的來(lái)源包括兩個(gè)或多個(gè)單克隆IL-1α自身抗體制劑，或單克隆與多克隆IL-1α自身抗體的混合物。藥物組合物是無(wú)熱原的。藥物上可接受載體[26]“藥物上可接受載體(pharmaceuticallyacceptablevehicles)”包括任何和所有的生理上兼容的溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細(xì)菌與抗真菌試劑、等滲劑和吸收延緩劑、以及類似物。藥物上可接受載體的例子，包括水、鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等等，以及它們的組合物之一種或多種。在一種或多種等滲劑被引入的情形中，等滲劑例如是糖；多元醇，如甘露醇；山梨糖醇；或氯化鈉。藥物上可接受載體可進(jìn)一步包括少量輔助物質(zhì)(輔料(auxiliarysubstances))，如潤(rùn)濕劑或乳化劑，防腐劑，或緩沖液，它們?cè)鰪?qiáng)IL-1α自身抗體的保存時(shí)間或效力。[27]本發(fā)明的藥物組合物可以是多種形式。它們包括，例如液體、半固體和固體藥劑形式，如液體溶液(如，適于注射和輸注(injectableandinfusible)的溶液)，分散體或懸液，片劑，丸劑，粉劑，脂質(zhì)體和栓劑。優(yōu)選的形式取決于預(yù)期的給藥方式及治療應(yīng)用。[28]例如，IL-1α自身抗體可被凍干成高純度晶體形式。終產(chǎn)物可以適合重配(reconstitution)和注射的無(wú)菌凍干粉末提供。凍干粉末可被裝于無(wú)菌小瓶中，每個(gè)瓶中含有如1-1000mg之間的IL-1α自身抗體。每個(gè)瓶中可含有額外的非藥物成分，如以下的一種或多種；蔗糖、聚山梨醇酯80、磷酸二氫鈉、一水化物、聚乙二醇，和磷酸氫二鈉及二水化物。[29]在一些實(shí)施方式中，瓶中的IL-1α自身抗體可在使用前立即重新配制，用例如1-30mL注射用無(wú)菌水，美國(guó)藥典(USP)，最終pH值約7.2?？砂栏瘎?。如果產(chǎn)品不含防腐劑，該產(chǎn)品通常在重配后立即使用，并且不重新登記入庫(kù)或儲(chǔ)存。重配產(chǎn)品的總劑量可用0.9％氯化鈉注射液，美國(guó)藥典，進(jìn)一步稀釋到50-500mL。輸注濃度可在0.04mg/mL到40mg/mL的范圍內(nèi)。輸注可開(kāi)始于，例如重配后大約1-4小時(shí)內(nèi)。優(yōu)選地，輸注溶液在約2小時(shí)的時(shí)間段內(nèi)用輸注裝置給藥，該輸注裝置帶有一個(gè)內(nèi)嵌的、無(wú)菌的、不熱原的、蛋白結(jié)合作用低的過(guò)濾器(孔尺寸為1.2μm或更小)。[30]在另一些實(shí)施方式中，IL-1α自身抗體被配制成適合注射給藥的藥物組合物，例如可注射溶液。IL-1α自身抗體可以是液體或凍干劑形式，例如在玻璃(flint)或琥珀色小瓶、安瓿、或預(yù)充盈的注射器中。合適的緩沖液包括L-組氨酸、琥珀酸鈉、檸檬酸鈉、磷酸鈉、和磷酸鉀。氯化鈉在0-300mM濃度下(如，150mM用于液體劑型)可用于減輕溶液的毒性。凍干劑形式可包含防凍劑(結(jié)晶保護(hù)劑(cryoprotectants))(如，0-10％蔗糖、海藻糖或乳糖)。填充劑(bulkingagent)，如甘露醇，也可包含于凍干劑形式中。穩(wěn)定劑，如L-蛋氨酸可用在液體或凍干劑形中。也可包括表面活性劑，如聚山梨醇酯20和BRIJ表面活性劑。[31]本發(fā)明的藥物組合物可用于治療動(dòng)脈硬化相關(guān)疾病，包括缺血性心臟疾病、冠狀動(dòng)脈疾病、周圍動(dòng)脈疾病和腦血管疾病。優(yōu)選地，用含有同物種抗體的藥物制劑治療該個(gè)體(即，用人IL-1α自身抗體治療人類)。根據(jù)本發(fā)明的治療上有效劑量的藥物組合物，可給予有一種或多種這類疾病之癥狀的個(gè)體；或者預(yù)防性地給予有發(fā)生一種或多種這類疾病之風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體?！爸委熒系挠行┝?therapeuticallyeffectiveamount)”是指可降低個(gè)體血清中的游離IL-1α的劑量或提高個(gè)體中IL-1α自身抗體的滴定度至少兩倍的劑量。優(yōu)選地，個(gè)體的動(dòng)脈硬化相關(guān)疾病癥狀有所減輕(例如，臀部、大腿或小腿處的痙攣；絞痛)。[32]盡管對(duì)多種治療應(yīng)用來(lái)說(shuō)，優(yōu)選的給藥途徑/方式是皮下注射、靜脈注射或輸液，然而本發(fā)明的藥物組合物可用多種本領(lǐng)域內(nèi)已知方法給藥。如熟練的技術(shù)人員所意識(shí)到的，給藥的途徑和/或方式依據(jù)希望的結(jié)果而不同。在一些實(shí)施方式中，IL-1α自身抗體可與防止自身抗體快速釋放的載體共同制備，如控釋劑型，包括植入物(implant)、透皮貼劑(transdermalpatch)、和微膠囊輸送系統(tǒng)?？墒褂每缮锝到獾摹⑸锛嫒莸亩嗑垠w，如乙烯醋酸乙烯酯(ethylenevinylacetate)、聚酸酐(polyanhydride)、聚乙醇酸(polyglycolicacid)、膠原蛋白、聚正酯(polyorthoester)以及聚乳酸(polylacticacid)。制備這種制劑的多種方法已被專利保護(hù)或通常被本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員所熟知。參見(jiàn)，如《持續(xù)且可控釋放的藥物輸送系統(tǒng)》(SustainedandControlledReleaseDrugDeliverySystems)，J.R.Robinson編輯，紐約MarcelDekker公司1978年出版。[33]本發(fā)明藥物制劑的劑量與給藥時(shí)間表，依照個(gè)體發(fā)生動(dòng)脈硬化相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)；個(gè)體疾病的癥狀與嚴(yán)重程度；和個(gè)體的物種而不同。IL-1α自身抗體的典型劑量在0.001μg到400mg/kg(如，0.001μg，0.01μg，0.1μg，0.5μg，1.0μg，10μg，100μg，1mg，2mg，5mg，10mg，15mg，20mg，25mg，50mg，75mg，100mg，150mg，200mg，250mg，300mg，350mg或400mg)的范圍內(nèi)。該劑量可用如每天一次持續(xù)4天，每周一次，每月兩次，每月一次，每12周一次，每24周一次，或每90天一次的形式給藥。[34]在本說(shuō)明書(shū)中引用的所有專利，專利申請(qǐng)，以及參考文獻(xiàn)，明確引入本文作為參考。以上說(shuō)明書(shū)一般性地描述了本發(fā)明。通過(guò)參考以下特定實(shí)施例，可以獲得更完整的理解；提供這些實(shí)施例僅僅是出于例證的目的，而不是意欲限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1缺血性心臟疾病與IL-1α自身抗體滴定度的相關(guān)性[35]檢測(cè)參與哥本哈根男性研究(CopenhagenMaleStudy)中的男性血清樣本(CMS；GyntelbergDanMedBull1973；201-4)的IL-1α自身抗體滴定度。這些男性的年齡在53歲到75歲之間(平均值＝63)。結(jié)果顯示于表1[36]表1[37]如表1所示，在這些病人的10年跟蹤調(diào)查中，那些有高IL-1α自身抗體滴定度的個(gè)體的缺血性心臟疾病發(fā)生率有所降低。實(shí)施例2缺血性心臟疾病病人的IL-1α自身抗體[38]冠狀動(dòng)脈旁路手術(shù)3天內(nèi)的20個(gè)病人的血清被研究，并與20個(gè)無(wú)缺血性心臟疾病征兆的年齡匹配的男性比較。結(jié)果顯示于表2。[39]表2P＜0.0001(費(fèi)舍爾精確檢驗(yàn)(Fisher’sexacttest)，雙側(cè)檢驗(yàn))實(shí)施例3單核細(xì)胞的分離與刺激[40]本實(shí)施例描述了一種分離和刺激單核細(xì)胞的方法。用IL-1α自身抗體陰性的捐獻(xiàn)者，從健康的血液捐獻(xiàn)者獲得單核細(xì)胞(mononuclearcells(MNC))。在LYMPHOPREPTM(Nycomed)上，通過(guò)離心，將MNC從血沉棕黃層(buffycoat)中純化出來(lái)。用含有2mML-谷氨酸(Sigma，圣路易斯，美國(guó))，25μg/ml慶大霉素(gentamycin)(GIBCOBRL，LifeTechnologies，Paisley，蘇格蘭)和5％正常人AB血清的RPMI1640，清洗細(xì)胞。通過(guò)在37℃下，于5％CO2加濕空氣中，且有100μg/mlE.coliLPS(DifcoLaboratories，底特律，美國(guó))存在的條件下，刺激MNC以產(chǎn)生原初IL-1α(nativeIL-1α(nIL-1α))。12小時(shí)后，收集上清液并儲(chǔ)存在-20℃直到使用。G蛋白親和色譜[41]100μl血漿樣本的親和色譜，是在4℃下，用含有2000μlG蛋白瓊脂糖4高速流動(dòng)柱(ProteinGSepharose4FastFlow(AmershamBiosciences))進(jìn)行。用0.1％(v/v)TritonX-100和0.1％(w/v)凝膠(Sigma)補(bǔ)充的磷酸鹽緩沖液pH7.4(PBS)作為跑膠緩沖液。結(jié)合材料用0.1M甘氨酸/HCl，pH2.4洗脫。特異性分析[42]抗體特異性分析，用天然和重組IL-1α與放射性標(biāo)記的IL-1α的不同制劑進(jìn)行。抗IL-1α陽(yáng)性的血漿樣本被稀釋以結(jié)合總量15ng/200μlIL-1α的約60％，包括未標(biāo)記的IL-1α和示蹤IL-1α(15pg/200μl125I標(biāo)記的IL-1α)。血漿、示蹤物和競(jìng)爭(zhēng)物的混合物，在37℃下，預(yù)培養(yǎng)1小時(shí)；而后，在G蛋白上進(jìn)行親和色譜。對(duì)應(yīng)于IgG結(jié)合的與游離示蹤物的部分，在伽馬計(jì)數(shù)器(1470WIZARDTM伽馬計(jì)數(shù)器，Wallac，芬蘭)中計(jì)數(shù)。此外，游離IL-1α用ELISA測(cè)定。用RIA和ELISA篩選血漿樣本[43]根據(jù)合適的程序及血液組分的質(zhì)量控制，從血液捐獻(xiàn)個(gè)體中收集血漿樣本。樣本最初被小量合并，篩選抗IL-1α。90份血漿樣本的小量合并物被調(diào)整為25％(v/v)，處于補(bǔ)充有0.1％(v/v)TritonX-100(Sigma)，0.1％(w/v)明膠(Sigma)與2mMEDTA(Bie&Berntsen，Rdovre，丹麥)的PBS中(PBS+)，并加入3,500cpm125I標(biāo)記的IL-1α；終體積為200μl。在4℃溫育20小時(shí)，代表IgG結(jié)合的示蹤物與游離示蹤物的部分用G蛋白分離并計(jì)數(shù)。此外，相對(duì)于天然IL-1α，表示抗IL-1α的結(jié)合活性。這可在IL-1αELISA中，通過(guò)測(cè)定存在于25％血漿合并物中的1ng/ml天然IL-1α的回收率而完成。IL-1αELISA[44]夾心(sandwich)ELISA是基于特定的多克隆兔抗人IL-1α抗體。通過(guò)天然人IL-1α抗體的干擾，這已經(jīng)被完全驗(yàn)證。參見(jiàn)Hansen等，Scand.J.Immunol.1991.33777-781；Hansen等，Cytokine1993.572-80。[45]將IMMUNOMAXISORP平板(Nunc，Roskilde，丹麥)，用蛋白A親和純化兔抗人IL-1αIgG包被。非附著點(diǎn)用含有4％(w/v)脫脂奶粉，1％(v/v)人血清白蛋白(HSA)(SSI，哥本哈根，丹麥)和0.005％(v/v)TWEEN20(Merck)的PBS封閉。在以下每一步以后，用PBS/0.005％(v/v)TWEEN20清洗每個(gè)孔1)100μl分析物在4℃溫育18小時(shí)；2)在PBS/0.005％(v/v)TWEEN20/0.5％(w/v)HAS中的100μl生物素化的兔抗人IL-1αIgG(2μg/ml)，在20℃溫育2小時(shí)；3)在PBS/0.005％(v/v)TWEEN20/0.5％(w/v)HAS中的100μl鏈霉抗生素蛋白-過(guò)氧化物酶(streptavidin-peroxidase)(0.1μg/ml；Kirkegaard&PerryLaboratories，Gaithersburg，美國(guó))，在20℃溫育45分鐘。用1，2-苯二胺二氫氯化物(1，2-phenylenediaminedihydrocloride)(DakoCytomation)對(duì)酶活性進(jìn)行定量。ELISA的工作范圍是150pg/ml到5,000pg/ml。變差的檢測(cè)間與檢測(cè)內(nèi)(interandintra-assay)系數(shù)被保持在15％以下。HSIL-1αELISA[46]用IL-1αQuantikine高敏感性ELISA(R&DSystems，Minneapolis，MN)，量化血漿中IL-1α水平。根據(jù)制造商的確認(rèn)及說(shuō)明書(shū)，該ELISA可檢測(cè)到結(jié)合于sIL-1αR和IL-1α自身抗體上的IL-1α。二抗沉淀和Scatchard圖[47]IL-1α自身抗體在所選定的抗體陽(yáng)性血漿樣本中的結(jié)合特性，被如上文所述(Hansen等，Eur.J.Immunol.1995.25348-354)進(jìn)行測(cè)定。將適當(dāng)稀釋的血漿樣本，與50,000cpm到700cpm的范圍內(nèi)的125I標(biāo)記的IL-1α，在PBS+中混合，終體積為100μl。在4℃下溫育20小時(shí)后，200μl兔抗人IgG(A424；DakoCytomation)被加入，以沉淀95％以上的IgG。在4℃下溫育1小時(shí)后，加入3倍體積的PBS。該樣品立即被離心20分鐘(3000xg，4℃)；離心后，沉積物(IgG結(jié)合)與上清中(游離)的IL-1α量被計(jì)數(shù)。IL-1α自身抗體與IL-1α結(jié)合的親和度，用Scatchard圖計(jì)算。權(quán)利要求1.篩選個(gè)體以確定所述個(gè)體發(fā)生動(dòng)脈硬化相關(guān)疾病的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)的方法，包括在所述個(gè)體的生物學(xué)樣本中，確定IL-1α自身抗體的滴定度；和如果所述測(cè)試滴定度小于1∶100，則所述個(gè)體被辨識(shí)為有增高的發(fā)生所述動(dòng)脈硬化相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)；或如果所述測(cè)試滴定度大于1∶100，則所述個(gè)體被辨識(shí)為有降低的發(fā)生所述動(dòng)脈硬化相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)。2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述個(gè)體是人。3.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述個(gè)體是男人。4.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述生物學(xué)樣本包括血液或血清。5.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述動(dòng)脈硬化相關(guān)疾病是缺血性心臟病。6.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述動(dòng)脈硬化相關(guān)疾病是冠狀動(dòng)脈疾病。7.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述動(dòng)脈硬化相關(guān)疾病是腦血管疾病。8.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述動(dòng)脈硬化相關(guān)疾病是外周動(dòng)脈疾病。9.治療動(dòng)脈硬化相關(guān)疾病的方法，包括給予需要它的個(gè)體治療上有效劑量的藥物組合物，所述組合物包括對(duì)IL-1α的Ka在107到1014M-1之間的IL-1α自身抗體；和一種藥物上可接受的載體。10.權(quán)利要求9所述的方法，其中所述個(gè)體是人，并且所述IL-1α自身抗體是人自身抗體。11.權(quán)利要求10所述的方法，其中所述人是男性。12.權(quán)利要求9所述的方法，其中所述IL-1α自身抗體是單克隆抗體，F(xiàn)(ab)′2片段，F(xiàn)(ab)′片段，F(xiàn)ab片段，雙鏈Fv片段或單鏈抗體。13.權(quán)利要求9所述的方法，其中所述動(dòng)脈硬化相關(guān)疾病是缺血性心臟病。14.權(quán)利要求9所述的方法，其中所述動(dòng)脈硬化相關(guān)疾病是冠狀動(dòng)脈疾病。15.權(quán)利要求9所述的方法，其中所述動(dòng)脈硬化相關(guān)疾病是腦血管疾病。16.權(quán)利要求9所述的方法，其中所述動(dòng)脈硬化相關(guān)疾病是外周動(dòng)脈疾病。17.具有對(duì)IL-1α的Ka在107到1014M-1之間的IL-1α自身抗體在制造治療血管疾病的藥劑中的應(yīng)用。18.權(quán)利要求17所述的應(yīng)用，其中所述個(gè)體是人，并且所述IL-1α自身抗體是人自身抗體。19.權(quán)利要求18所述的應(yīng)用，其中所述人是男性。20.權(quán)利要求17所述的應(yīng)用，其中所述IL-1α自身抗體是單克隆抗體，F(xiàn)(ab)′2片段，F(xiàn)(ab)′片段，F(xiàn)ab片段，雙鏈Fv片段或單鏈抗體。21.權(quán)利要求17所述的應(yīng)用，其中所述動(dòng)脈硬化相關(guān)疾病是缺血性心臟病。22.權(quán)利要求17所述的應(yīng)用，其中所述動(dòng)脈硬化相關(guān)疾病是冠狀動(dòng)脈疾病。23.權(quán)利要求17所述的應(yīng)用，其中所述動(dòng)脈硬化相關(guān)疾病是腦血管疾病。24.權(quán)利要求17所述的應(yīng)用，其中所述動(dòng)脈硬化相關(guān)疾病是外周動(dòng)脈疾病。全文摘要檢測(cè)個(gè)體患動(dòng)脈硬化及相關(guān)血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的方法，包括檢測(cè)IL-1α自身抗體，以及通過(guò)給予包含IL-1α自身抗體的藥物組合物來(lái)防止或治療動(dòng)脈硬化及相關(guān)血管疾病的治療方法。文檔編號(hào)G01N33/50GK101253409SQ200680031958公開(kāi)日2008年8月27日申請(qǐng)日期2006年7月26日優(yōu)先權(quán)日2005年8月2日發(fā)明者J·西馬德,K·本德坦申請(qǐng)人:埃克斯生物科技公司