本發(fā)明涉及的是遺傳學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及的是一種水稻葉綠體核糖體蛋白及其編碼基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：水稻是世界上最重要的糧食作物之一，其產(chǎn)量受到多種因素的調(diào)控，光合作用是影響水稻產(chǎn)量的關(guān)鍵因素之一。葉綠體是光合作用以及多種代謝產(chǎn)物合成和積累的主要場(chǎng)所，為植株的發(fā)育提供能量源泉，葉綠體發(fā)育受阻將影響植物體的生長(zhǎng)。葉綠體核糖體主要負(fù)責(zé)葉綠體中質(zhì)體編碼蛋白的轉(zhuǎn)錄和翻譯，已有的研究表明葉綠體核糖體蛋白在核糖體形成、質(zhì)體蛋白合成、葉綠體分化和早期葉綠體發(fā)育的過程中行使重要的功能。某些葉綠體編碼的質(zhì)體蛋白為葉綠體核糖體、光系統(tǒng)i和ii等的重要組分；已有研究顯示編碼葉綠體核糖體蛋白的基因突變導(dǎo)致胚胎發(fā)育受阻、幼苗致死以及降低植株的光合作用等，這些研究有助于我們更好的認(rèn)知光合作用機(jī)理。葉綠素缺失突變體是研究光合作用、光形態(tài)建成等生理過程的理想材料，關(guān)于葉綠素缺失突變體的應(yīng)用越來越受關(guān)注，可利用這些突變體資源，為進(jìn)一步通過基因工程手段培育高光效的水稻品種提供依據(jù)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種水稻葉綠體核糖體蛋白及其編碼基因和應(yīng)用，以提供一種新的與水稻葉綠體發(fā)育相關(guān)的蛋白及其基因，為進(jìn)一步認(rèn)知光合作用機(jī)理、培育高光效作物品種提供基礎(chǔ)。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：本發(fā)明提供了一種水稻葉綠體核糖體蛋白，所述蛋白具有如seqidno.1所示的氨基酸序列，或具有如seqidno.1所示的氨基酸序列的一個(gè)或若干氨基酸殘基經(jīng)取代和/或缺失和/或插入衍生得到的氨基酸序列，該蛋白命名為asl4蛋白。本發(fā)明還提供了一種上述水稻葉綠體核糖體蛋白的編碼基因，該編碼基因的dna序列如seqidno.2所示，全長(zhǎng)3963bp，包含7段外顯子和6段內(nèi)含子，該編碼基因的cds序列如seqidno.3所示，全長(zhǎng)1209bp，命名為als4基因。本發(fā)明還提供了上述編碼基因在培育高光效作物品種中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種植物表達(dá)載體，所述植物表達(dá)載體為多克隆位點(diǎn)區(qū)域依次連接有啟動(dòng)子、上述als4基因的cds序列、以及終止子的pcambia1305載體。本發(fā)明還提供了一種水稻幼苗致死的基因序列，該序列包含上述als4基因dna序列的第4內(nèi)含子的第37位堿基到終止密碼子(tga)下游的第2312位堿基，全長(zhǎng)2855bp，該基因序列為單隱性核基因，其缺失可導(dǎo)致植株葉綠素和類胡蘿卜素合成受阻，葉綠體不能分化，植株苗期白化致死。本發(fā)明還提供了一種鑒定上述水稻幼苗致死的基因序列的特異性indel標(biāo)記，所述標(biāo)記的上游核苷酸序列如seqidno.4所示，下游核苷酸序列如seqidno.5所示。本發(fā)明還提供了一種利用上述特異性indel標(biāo)記鑒定所述水稻幼苗致死的基因序列的方法，步驟包括：利用所述特異性indel標(biāo)記引物對(duì)水稻基因組dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增，若僅得到如seqidno.6所示的3348bp的核苷酸序列，則該水稻為不含所述幼苗致死的基因序列的普通水稻；若僅得到如seqidno.7所示的493bp的核苷酸序列，則該水稻為含有所述幼苗致死的基因序列的純合子，表型為苗期白化；若得到如seqidno.6所示的3348bp的核苷酸序列和如seqidno.7所示的493bp的核苷酸序列，則該水稻為含有所述幼苗致死的基因序列的雜合子，表型與普通水稻一致。本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明提供了一種水稻葉綠體核糖體蛋白及其編碼基因和應(yīng)用，該蛋白為葉綠體核糖體小亞基蛋白s1，將該蛋白的編碼基因?qū)肴~綠體發(fā)育異常的突變體植株中，可以培育成含正常色素且發(fā)育正常的植株；本發(fā)明還提供了一種水稻幼苗致死的基因序列及其檢測(cè)方法，可快速監(jiān)測(cè)含有該基因序列的水稻植株；該蛋白及其編碼基因、其幼苗致死的基因序列的發(fā)現(xiàn)對(duì)研究植物生長(zhǎng)、發(fā)育、遺傳及光合作用具有重要意義，為進(jìn)一步利用基因工程手段培育高光效的作物品種提供潛在的應(yīng)用價(jià)值。附圖說明圖1為二葉期和三葉期野生型和突變體asl4的地上部分色素含量分析結(jié)果，fw為鮮重；圖2為三葉期野生型和突變體asl4葉片葉綠體超微結(jié)構(gòu)電鏡圖；其中，a為野生型三葉期葉片葉綠體超微結(jié)構(gòu)觀察，b，c，d為突變體asl4三葉期葉片葉綠體超微結(jié)構(gòu)觀察，sg為淀粉顆粒，nc為正常發(fā)育的葉綠體，uc為未分化的葉綠體，cw為細(xì)胞壁，og為嗜鋨顆粒；圖3為asl4基因的圖位克隆結(jié)果；其中，a為asl4基因的初定位；b為asl4基因的精細(xì)定位；c為定位區(qū)間的候選基因預(yù)測(cè)；d為候選基因orf3，即asl4的結(jié)構(gòu)和突變位置；圖4為水稻幼苗致死基因asl4的特異性indel引物對(duì)該基因的pcr擴(kuò)增結(jié)果，1為普通水稻pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，2為純合的含有幼苗致死基因水稻pcr擴(kuò)增產(chǎn)物；圖5為pcambia1305載體圖譜；圖6為asl4的轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)結(jié)果；a為野生型、突變體asl4和轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測(cè)和表型；b為野生型、突變體asl4和轉(zhuǎn)基因植株的葉綠素含量分析。com1和com2代表轉(zhuǎn)基因陽性植株，com-v為空載體轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓?。具體實(shí)施方式實(shí)施例11、材料本實(shí)施例所用方法如無特別說明均為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知曉的常規(guī)方法，所用的試劑等材料，如無特別說明，均為市售購(gòu)買產(chǎn)品，所用作物品種，若無特別說明，均為市售購(gòu)買的常規(guī)品種或國(guó)家種質(zhì)庫保存的品種。2、方法2.1水稻幼苗致死突變體asl4的獲得及表型分析利用mnu(單甲基亞硝基脲)化學(xué)誘變水稻品種農(nóng)院238，獲得農(nóng)院238的mnu化學(xué)誘變突變體庫(該突變體庫由安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所保存和提供)，從突變體庫中得到幼苗致死突變體als4，該突變體苗期二葉期和三葉期均表現(xiàn)出明顯的白化表型，四葉期開始，突變體逐漸萎縮死亡。通過對(duì)二葉期和三葉期野生型和突變體地上部分進(jìn)行色素分析表明突變體asl4幾乎不能合成葉綠素和類胡蘿卜素(圖1)。利用透射電鏡觀察三葉期野生型和突變體葉片中葉綠體超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)野生型葉片能夠發(fā)育含有正常片層結(jié)構(gòu)的葉綠體(圖2a)，而突變體葉片中葉綠體數(shù)目減少，且葉綠體結(jié)構(gòu)異常，不能正常分化(圖2b-d)。上述的葉綠素和類胡蘿卜素的測(cè)定方法如下：①分別從二葉期和三葉期野生型和突變體地上部分葉片中剪取相同重量的葉片在5ml95％乙醇中黑暗處理48h，中途每12h顛倒搖晃一次；②12000rpm離心2min，上清用分光光度計(jì)測(cè)定665nm、649nm和470nm下的吸光值，3次重復(fù)；③根據(jù)公式葉綠素a濃度ca＝13.95*d665-6.88*d649；葉綠素b濃度cb＝24.96*d649-7.32*d665；類胡蘿卜素x濃度cx＝(1000*d470-2.05ca-114*cb)/245計(jì)算各色素的濃度(其中d665、d649和d470分別代表665nm、649nm和470nm下的吸光值)；④最后計(jì)算組織中各色素的含量：葉綠體色素含量＝(色素濃度(c)*提取液體積*稀釋倍數(shù))/樣品鮮重(mg/g)。上述透射電鏡的具體操作步驟如下：①三葉期剪取野生型和突變體asl4的新鮮葉片，橫切成2mm左右的薄片，利用2.5％的戊二醛溶液(配方：0.2mna2hpo4-nah2po4(ph7.2)50ml，25％(體積比)戊二醛10ml，ddh2o定容至100ml，4℃避光保存)室溫固定24h；②繼續(xù)用1％(體積比)oso4固定，利用醋酸氧鈾染色，進(jìn)一步丙酮系列脫水(50％-70％-80％-90％(體積比)，各濃度處理15min，再用100％丙酮脫水3次，每次30min)；③將處理后的樣品包埋在樹脂中，干燥器保存；④利用leica超薄切片機(jī)制成50-90nm切片，再次染色，并在hitachih-7650透射電鏡下觀察。2.2突變基因asl4的遺傳分析和基因定位突變體asl4經(jīng)過多代自交選擇，性狀穩(wěn)定遺傳，由于asl4幼苗致死不能繁殖，故保留其雜合體親本，雜合體親本當(dāng)代表型出正常野生型表型，但其自交后代出現(xiàn)正常與白化植株的分離，且比例符合3∶1，說明該突變性狀受單隱性核基因控制。利用覆蓋水稻12條染色體的205對(duì)indel標(biāo)記，篩選親本asl4和水稻南京11品種的多態(tài)性，挑選asl4/南京11f2群體中10個(gè)白化幼苗進(jìn)行連鎖分析，將目標(biāo)基因定位在水稻第三染色體斷臂上；進(jìn)一步用92個(gè)具有白化表型的極端個(gè)體將目的基因定位于標(biāo)記c3-16和k5之間1.03m的區(qū)域內(nèi)(圖3a)，擴(kuò)大定位群體，設(shè)計(jì)新的indel標(biāo)記，最終將目的基因定位于標(biāo)記k40與k29之間50kb區(qū)間內(nèi)(圖3b)；通過rgap數(shù)據(jù)庫對(duì)定位區(qū)間進(jìn)行基因預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)該定位區(qū)間包含三個(gè)候選基因(圖3c)，分別為逆轉(zhuǎn)座子蛋白編碼基因(loc_os03g20080)、myb家族轉(zhuǎn)錄因子編碼基因(loc_os03g20090)和葉綠體30s核糖體蛋白s1編碼基因(loc_os03g20100，即asl4)，所述葉綠體30s核糖體蛋白s1編碼基因的dna序列如seqidno.2所示，該蛋白編碼基因的cds序列如seqidno.3所示，所述葉綠體30s核糖體蛋白s1的氨基酸序列如seqidno.1所示；進(jìn)一步通過基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)該葉綠體30s核糖體蛋白s1對(duì)應(yīng)的dna序列從其第4內(nèi)含子的37bp到終止密碼子tga下游2312bp處存在2855bp的序列缺失(圖3d)，該缺失部分即為導(dǎo)致水稻幼苗白化致死的關(guān)鍵基因序列。上述基因定位的方法如下：(1)植株總dna的提取方法如下：①苗期三葉期從asl4/南京11的f2群體中挑選具有白化表型的極端個(gè)體，分單株取樣，放入2.0mlep管中，加入鋼珠，液氮冷凍后利用磨樣器磨成粉末；②向樣品中加入400μl的2×ctab提取液(提取液配方為：ctab20g，nacl81.9g，0.5medta40ml(ph8.0)，1mtris-hcl100ml(ph8.0)，加ddh2o定容至1l，滅菌后使用)，65℃溫浴30min，每10min搖晃一次；③加入400μl的24∶1(氯仿∶異戊醇，v/v)，震蕩混勻，12000rpm離心5min；④吸取200μl上清至一1.5mlep管中，加入400μl預(yù)冷的無水乙醇，輕搖混勻，-20℃放置30min，12000rpm離心5min，去上清，沉淀室溫晾干，加入200μl滅菌ddh2o溶解2h以上，4℃保存?zhèn)溆谩?2)indel標(biāo)記開發(fā)方法如下：根據(jù)網(wǎng)上公布的水稻品種日本晴和9311基因組序列，找到定位區(qū)間序列，選擇差異片段3bp以上20bp以下的區(qū)間，利用primerpremier5.0軟件設(shè)計(jì)indel標(biāo)記引物，標(biāo)記擴(kuò)增片段大小為120-220bp；表1：用于基因定位的部分indel標(biāo)記引物名稱正向序列(5’-3’)反向序列(5’-3’)c3-16cgaggacagcaggaataaggagtttacgagttgccaagcak5cggactcctctgatacgataggcattttgcaccatacak20ggtttcagatttgccacgttcattccgcatttggtck22acatctgaatctcacaaccgaaaaagatccaaggagtatgacgak27ttgagggatacgatttagattcattcgacctgcccgttagtk29ccaaccgtttctacgttgacttgtagcccgtatgctcttctck31tttactcgccgctttggaccagcagggaggattgggatk40cggacgacgaggcgaaccaggagcagcgtgcggctg(3)pcr擴(kuò)增方法如下：pcr反應(yīng)體系為10μl，其中包括dna模板2μl(約20-200ng)，前后引物各0.5μl，10×pcr緩沖液1μl，25mm的mgcl20.6μl，1mm的dntp混合液0.3μl，rtaq0.1μl，ddh2o補(bǔ)至10μl；pcr反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，33個(gè)循環(huán)；72℃5min，4℃10min。(4)pcr產(chǎn)物檢測(cè)利用聚丙烯酰胺凝膠電泳，具體操作步驟如下：①100ml的8％(質(zhì)量)聚丙烯酰胺凝膠電泳工作液配置：40％(質(zhì)量)丙烯酰胺20ml，10×tbe10ml，ddh2o70ml，10％(質(zhì)量)ap1.2ml，temed100μl。其中40％(質(zhì)量)丙烯酰胺配方為：丙烯酰胺380g，n，n-亞甲雙丙烯酰胺20g，ddh2o定容至1l，過濾后4℃保存?zhèn)溆茫?0×tbe配方為tris堿108g，硼酸55g，0.5medta40ml(ph8.0)，ddh2o定容至1l，4℃保存?zhèn)溆茫?0％(質(zhì)量)ap配方為過硫酸銨10g，ddh2o定容至100ml，4℃保存?zhèn)溆谩＂陔娪緳z測(cè)：凝膠工作液制備好后，倒入膠槽，插入梳子，放置30min以上；pcr產(chǎn)物中加入2μl6×loading緩沖液，混勻后，上樣2μl，230v電泳70min。③銀染顯色：利用ddh2o配置千分之一質(zhì)量濃度的agno3染色液(現(xiàn)配現(xiàn)用)，染色液的體積為每?jī)蓧K膠50-100ml；將膠塊卸入配好的染色液中，30rpm輕搖染色12min；倒去染色液，ddh2o漂洗2-3次，去除殘液，加入與染色液等體積的顯色液(100ml顯色液配方為：naoh1.5g，甲醛溶液1ml，ddh2o補(bǔ)至100ml)，30rpm輕搖顯色，直到出現(xiàn)條帶為止；去除顯色液，自來水清洗膠塊2-3次，利用保鮮膜保存膠塊，晾干后讀取數(shù)據(jù)。2.3葉綠體核糖體蛋白asl4編碼基因的克隆根據(jù)網(wǎng)上公布的水稻日本晴序列和步驟2.2的asl4蛋白的編碼基因設(shè)計(jì)克隆引物：seqidno.8：asl4-f：5’-atggcgtccctggcgcagcacgt-3’seqidno.9：asl4-r：5’-ctattcatctgtggtttgccc-3’分別以野生型基因組dna和cdna為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物回收后連接到平端載體peasy中進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果與預(yù)測(cè)結(jié)果一致，獲得如seqidno.3所示的asl4的基因組序列和如seqidno.2所示的asl4的cds序列。2.4水稻幼苗致死基因序列的克隆根據(jù)網(wǎng)上公布的日本晴序列和步驟2.2獲得的水稻幼苗致死的基因序列設(shè)計(jì)多對(duì)引物，對(duì)野生型農(nóng)院238和突變體asl4進(jìn)行pcr擴(kuò)增，選擇能夠擴(kuò)增獲得差異片段的引物為indel標(biāo)記：seqidno.4：asl4-f：tgtggaggtcgatgaggaaseqidno.5：asl4-r：gagggagtataagattggtgagaa2.5水稻幼苗致死基因序列的檢測(cè)利用核苷酸序列seqidno.4和seqidno.5為前后引物進(jìn)行基因檢測(cè)，pcr擴(kuò)增普通水稻和含有水稻幼苗致死基因的基因組dna并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到如seqidno.6所示的3348bp大小的核苷酸序列和如seqidno.7所示的493bp大小的核苷酸序列(圖4)?；驒z測(cè)的方法如下：①pcr反應(yīng)體系為50μl：dna模板為3μl(50-200ng)，前后引物(10pm)各為2.5μl，kod緩沖液25μl，2mmdntp混合液10μl，kod酶1μl，加ddh2o補(bǔ)至50μl；反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃3min；98℃10s，60℃30s，68℃1-4min(1kb/min)，33個(gè)循環(huán)；68℃7min，4℃10min。②電泳檢測(cè)：稱取1g瓊脂糖，加入100ml1×tbe緩沖液，混勻后微波爐加熱至固體完全溶解，加入5ulgenecolour核酸燃料，輕搖混勻，倒入膠槽；凝膠制備好后，放置30min，pcr產(chǎn)物中加入2-4ul6×loadingbuffer，混勻后，上樣5ul，160v電泳40min；觀察記錄數(shù)據(jù)：利用bio-rad凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄數(shù)據(jù)。根據(jù)pcr產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果進(jìn)行基因型鑒定，若僅含有3348bp條帶，為野生型普通水稻，若僅含有493bp條帶，為純合als4基因型水稻，若含有3348bp和493bp條帶，為含有水稻幼苗致死基因的雜合體水稻。2.6asl4基因的功能驗(yàn)證將野生型asl4的基因組序列6124bp(包括1523bp啟動(dòng)子區(qū)、完整的編碼區(qū)和638bp的終止區(qū))同源重組到載體pcambia1305(載體圖譜如圖3所示)中，獲得含有asl4基因的植株表達(dá)載體pcambia1305-gasl4。利用雜合體親本種子制備愈傷，利用步驟2.5的方法檢測(cè)愈傷的基因型，挑選含有純合asl4基因型的愈傷，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將pcambia1305-gasl4轉(zhuǎn)化到愈傷組織中；同時(shí)將空載體pcambia1305以同樣的方式轉(zhuǎn)化到含有純合asl4基因型的愈傷中作為對(duì)照，獲得轉(zhuǎn)基因植株。進(jìn)一步利用分子標(biāo)記kf對(duì)轉(zhuǎn)基因單株進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓曛形礄z測(cè)到野生型目的條帶，表型和葉綠素含量與突變體無明顯差異；然而，在pcambia1305-gasl4轉(zhuǎn)基因植株中檢測(cè)到野生型目的條帶，這些單株即為陽性植株，分析顯示這些陽性植株的表型恢復(fù)到正常水平(圖6a)，葉綠素含量恢復(fù)到正常水平(圖6b)。上述分子標(biāo)記kf序列為：seqidno.10：kf-f：5’-tgcaaccaggagatacgctca-3’seqidno.11：kf-r：5’-ctaagatgccctctgaactga-3’3、結(jié)論本發(fā)明利用農(nóng)院238的mnu化學(xué)誘變突變體庫獲得了水稻幼苗致死突變體材料，經(jīng)多代自交選擇，性狀穩(wěn)定遺傳。對(duì)該突變體進(jìn)行遺傳定位和基因預(yù)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了本發(fā)明的新的功能基因，該基因?yàn)榫幋a葉綠體30s核糖體蛋白s1的基因。對(duì)突變體進(jìn)行進(jìn)一步基因組測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該基因的dna序列的第4內(nèi)含子的第37bp到tga下游2312bp處的2855bp的序列缺失。最后，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，構(gòu)建asl4基因組互補(bǔ)載體(pcambia1305-gasl4)并轉(zhuǎn)化到純合asl4缺失突變體中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因陽性植株的表型和葉綠素含量均恢復(fù)到正常水平，進(jìn)一步證實(shí)asl4基因?yàn)橐环N新的與葉綠素合成和葉綠體發(fā)育相關(guān)的基因(葉綠體30s核糖體蛋白s1編碼基因)，為研究植物生長(zhǎng)、發(fā)育、遺傳及光合作用原理，進(jìn)一步利用基因工程手段培育高光效的作物品種提供了依據(jù)。以上為本發(fā)明一種詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，是以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于上述的實(shí)施例。sequencelisting<110>安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所<120>一種水稻葉綠體核糖體蛋白及其編碼基因和應(yīng)用<130>/<160>11<170>patentinversion3.3<210>1<211>402<212>prt<213>oryzasativa<400>1metalaserleualaglnhisvalalaglyleualaserproproleu151015serglyalaproargargargproalaalaprothrargproserala202530leuvalcysglythrtyralaleuthrlysglugluarggluargglu354045argmetcysglnleupheaspglualasergluargcysargthrala505560prometgluglyvalserpheserprogluaspleuaspseralaval65707580gluserthraspileaspthraspileglyserleuilelysglythr859095valphemetthrthrserasnglyalatyrvalaspileglnserlys100105110serthralapheleuproleuaspglualacysleuleuaspvalasn115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