本發(fā)明涉及一系列硫化氫熒光探針以及該類熒光探針化合物的制備方法及其在硫化氫檢測(cè)中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

生物巰基化合物在細(xì)胞中是至關(guān)重要的分子，在損傷和氧化應(yīng)激中作為抗氧化劑扮演著重要的角色，與金屬相互作用作為螯合劑和信號(hào)制劑。硫化氫(h2s)是最簡(jiǎn)單的生物硫醇，在人體內(nèi)通過(guò)酶催化和非酶催化產(chǎn)生。硫化氫氣體以臭雞蛋氣味的存在或者溶解在水中形成hs-陰離子。硫化氫和其他活性硫物種(rss)會(huì)引起一系列生理反應(yīng)來(lái)維持細(xì)胞健康。活性硫物種在多種組織中可以作為抗氧化劑和信號(hào)制劑，包括肝臟，胃腸系統(tǒng)、胰腺、大腦和循環(huán)系統(tǒng)。

作為最小的硫醇，硫化氫可以作為一個(gè)簡(jiǎn)單的還原劑同時(shí)也是很好的親核試劑用于各種有機(jī)反應(yīng)中，同時(shí)硫化氫作為很好的還原劑用于有機(jī)合成中，此外分析化學(xué)家已經(jīng)采用了幾個(gè)世紀(jì)用硫化氫分析例如銅等金屬的重量分布。在分析化學(xué)和有機(jī)化學(xué)方面的這些特性是設(shè)計(jì)對(duì)這種rss具有很好選擇性和靈敏性的熒光探針的基本出發(fā)點(diǎn)?，F(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的反應(yīng)型熒光探針檢測(cè)硫化氫主要有以下三個(gè)方法：疊氮還原為胺，親核反應(yīng)和硫化銅沉淀。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一類硫化氫熒光探針化合物。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述熒光探針化合物的制備方法。

本發(fā)明的又一目的在于提供上述熒光探針化合物在硫化氫檢測(cè)中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一類熒光探針化合物，其結(jié)構(gòu)為如下通式(i)所示：

其中r1為烷基、氨基、烷氧基、-(oc1-3亞烷基)n-oc1-6烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、芳基、芳氧基、芳烷基、雜芳基、雜環(huán)基，上述取代基可進(jìn)一步被取代基取代，取代基為烷基、氨基、烷氧基、烯基、炔基、環(huán)烷基、芳基、芳氧基、芳烷基、雜芳基、雜環(huán)基、鹵素等；r2為熒光基團(tuán)。

所述的烷基代表碳原子數(shù)為1-8的直鏈或支鏈烷基，優(yōu)選碳原子數(shù)為1-6，例如，甲基、乙基、丙基、丁基、異丁基、叔丁基等。

所述烯基代表碳原子數(shù)為2-6的直鏈或支鏈烯基，例如，乙烯、丙烯、丁烯等。

所述炔基代表碳原子數(shù)為2-6的直鏈或支鏈炔基，例如，乙炔、丙炔、丁炔等。

所述環(huán)烷基代表具有碳原子數(shù)為3-6個(gè)的碳環(huán)，例如環(huán)己烷基等。

所述的芳基指具有6-20個(gè)碳原子的單環(huán)、多環(huán)芳族基團(tuán)，代表性的芳基包括：苯基、萘基等。

所述雜芳基代表具有1-20個(gè)碳原子、1-4個(gè)選自n、s、o雜原子的單環(huán)或多環(huán)雜芳基，例如吡咯基、吡啶基、嘧啶基等。

所述雜環(huán)基代表具有1-20個(gè)碳原子、1-4個(gè)選自n、s、o雜原子的飽和或不飽和的單環(huán)或多環(huán)雜環(huán)基。例如四氫吡咯基、哌嗪基等。

所述氨基代表基團(tuán)-nx2，其中x代表氫、烷基、烷氧基等。

所述的熒光染料代表在吸收某一波長(zhǎng)的光波后能發(fā)射出另一波長(zhǎng)大于吸收光的光波的物質(zhì)，例如，熒光素、羅丹明、bodipy、香豆素、花青素、三芳基硼等。

根據(jù)本發(fā)明，所述r1優(yōu)選為烷基、氨基、烷氧基、-(oc1-3亞烷基)n-oc1-6烷基、芳基、芳氧基、芳烷基，更優(yōu)選為c1-6烷基、-(och2ch2)n-oc1-6烷基。

根據(jù)本發(fā)明，所述熒光染料優(yōu)選為熒光素、羅丹明、bodipy、香豆素、花青素、三芳基硼等。

根據(jù)本發(fā)明，所述式i化合物可為如下具體化合物ia和ib

本發(fā)明還提供了一種上述通式i化合物的制備方法，合成途徑如下：

其中r1、r2如前述所定義；

本發(fā)明通式(i)化合物的具體合成方法如下：

(a)鹽酸胍與水合肼反應(yīng)得到化合物1；

(b)將步驟(a)中得到的化合物1與2,4-戊二酮過(guò)氧化物反應(yīng)得到化合物2；

(c)將步驟(b)中得到的化合物2經(jīng)過(guò)還原得到化合物3；

(d)將步驟(c)中得到的化合物3在溶劑中與水合肼反應(yīng)生成化合物4；

(e)將步驟(d)中得到的化合物4與三氯乙氰尿酸反應(yīng)生成化合物5；

(f)將步驟(e)中得到的化合物5與r1h反應(yīng)生成化合物6；

(g)將步驟(f)中得到的化合物6與熒光基團(tuán)發(fā)生取代反應(yīng)得到化合物i。

根據(jù)本發(fā)明，所述步驟(a)中鹽酸胍與水合肼按1:1.3摩爾比投料，1,4-二氧六環(huán)作溶劑，反應(yīng)溫度為回流溫度，反應(yīng)時(shí)間為2-3h。

根據(jù)本發(fā)明，所述步驟(b)中化合物1與2,4戊二酮過(guò)氧化物按1:2摩爾比投料，水作溶劑，反應(yīng)溫度為25℃-70℃，反應(yīng)時(shí)間為4.5-5h。

根據(jù)本發(fā)明，所述步驟(c)中化合物2與亞硝酸鈉和醋酸按1:2.8:2.8摩爾比投料，水和二氯甲烷作溶劑，反應(yīng)溫度為0℃，反應(yīng)時(shí)間為0.5-2h。

根據(jù)本發(fā)明，所述步驟(d)中化合物3與水合肼按1:2摩爾比投料，乙腈作為溶劑，反應(yīng)溫度為室溫，反應(yīng)時(shí)間為0.5h。

根據(jù)本發(fā)明，所述步驟(e)中化合物4與三氯乙氰尿酸取代基按1:2摩爾比投料，乙腈作為溶劑，反應(yīng)溫度為0℃-室溫，反應(yīng)時(shí)間為0.5-1h。

根據(jù)本發(fā)明，所述步驟(f)中化合物5與r1h按1:1摩爾比投料，二氯甲烷作為溶劑，反應(yīng)溫度為室溫，反應(yīng)時(shí)間為3-5h。

根據(jù)本發(fā)明，所述步驟(g)中化合物6與熒光基團(tuán)按3:1摩爾比投料，二氯甲烷作為溶劑，反應(yīng)溫度為室溫，反應(yīng)時(shí)間為3-5h。

本發(fā)明所述的硫化氫熒光探針化合物，可以檢測(cè)硫化氫，在一定硫化氫濃度下，其發(fā)光能力隨著時(shí)間的變化而逐漸增強(qiáng)。其原因是所述化合物中含有四氮嗪結(jié)構(gòu)，其拉電子效應(yīng)淬滅了熒光基團(tuán)，加入硫化氫后硫化氫還原四氮嗪，形成具有給電子效應(yīng)的基團(tuán)，從而使其熒光基團(tuán)熒光恢復(fù)。

進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供一種所述熒光探針化合物的用途，其用于檢測(cè)硫化氫。

本發(fā)明所述的硫化氫熒光探針化合物，對(duì)硫化氫的選擇具有專一性，其他生物硫醇或者金屬離子等對(duì)所述化合物的發(fā)光能力幾乎無(wú)影響。

本發(fā)明所述的硫化氫熒光探針化合物，對(duì)于硫化氫的檢測(cè)可以在水溶液中，也可以在緩沖溶液中進(jìn)行，如hepes緩沖溶液。所述化合物對(duì)于硫化氫檢測(cè)所適用的ph范圍為7.0-9.0。

本發(fā)明所述的熒光探針化合物，可自主進(jìn)入到小鼠成纖維細(xì)胞中，并用于細(xì) 胞內(nèi)熒光成像檢測(cè)硫化氫。所述熒光探針化合物進(jìn)入細(xì)胞后，在熒光顯微鏡下通過(guò)熒光探針可以觀察到所述化合物被硫化氫還原的過(guò)程。

本發(fā)明所述的硫化氫熒光探針優(yōu)點(diǎn)在于：首次使用四氮嗪結(jié)構(gòu)基團(tuán)檢測(cè)硫化氫；對(duì)硫化氫具有高效的選擇性；所述化合物具有親水親油兩性基團(tuán)，可自主滲透細(xì)胞膜進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)可檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)外源性硫化氫。

附圖說(shuō)明

圖1a、1b為實(shí)施例7制備的ia和ib在hepes緩沖溶液中，加入硫化氫后隨時(shí)間變化的熒光光譜圖。

圖2a、2b為實(shí)施例7制備的ia和ib在hepes緩沖溶液中，加入其它生物硫醇以及金屬離子等其他物質(zhì)后，熒光探針在一定時(shí)間內(nèi)的熒光強(qiáng)度比值。

具體實(shí)施方式

為了進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的指導(dǎo)思想，給出下列系列具體實(shí)施例，但本發(fā)明并不受這些具體實(shí)施例的限制，任何了解該領(lǐng)域的技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明的些許改動(dòng)將可以達(dá)到類似的結(jié)果，這些改動(dòng)也包含在本發(fā)明之中。

實(shí)施例1

制備化合物1

將鹽酸胍(19.1g，0.20mol)溶于100ml1,4-二氧六環(huán)中，然后加入3.4當(dāng)量的水合肼，攪拌回流2小時(shí)，反應(yīng)完成后降至室溫，過(guò)濾，1,4-二氧六環(huán)洗，干燥得到化合物1(27.7g，98％)，直接用于下一步反應(yīng)。

實(shí)施例2

制備化合物2

將7.03g化合物2(0.05mol)溶于50ml水中，在室溫條件下滴加2,4-二戊酮(10.26ml，0.1mol)，滴加完畢后室溫下攪拌0.5小時(shí)，然后加熱至70℃攪拌4小時(shí)。反應(yīng)完全后降至室溫，過(guò)濾，水洗，得白色黃色固體(5.7g，85％)，直接用于下一步反應(yīng)。

實(shí)施例3

制備化合物3

將26.2g亞硝酸鈉溶于588ml水中，加入60ml二氯甲烷，降溫至0℃，然后加入(37g，0.136mol)化合物2，滴加加入(18.67ml，0.326mol)醋酸。當(dāng)停止放出氣體時(shí)，二氯甲烷萃取，有機(jī)相用碳酸鉀溶液水洗，硫酸鎂干燥，旋出有機(jī)溶劑，乙醚重結(jié)晶得到化合物3(33.45g，91％)。¹h-nmr(400mhz,cdcl3),δ:2.398(s,6h),2.719(s,6h)，6.203(s,6h).

實(shí)施例4

制備化合物4

將化合物3(23.8g，0.09mol)溶于150ml乙腈溶液中，在室溫?cái)嚢柘轮鸬渭尤胨想?9.4ml，0.19mol)。滴加完畢后攪拌回流20分鐘，然后冷卻至室溫過(guò)濾，乙腈多次沖洗，得到化合物4，直接用于下一步。

實(shí)施例5

制備化合物5

將化合物4(12.5g，0.09mol)在0℃下溶于350ml乙腈溶液中，逐滴加入三氯乙氰尿酸(40.8g，0.18mol)的乙腈溶液。滴加完畢后升至室溫?cái)嚢?0分鐘，然后過(guò)濾，旋出揮發(fā)物，快速過(guò)硅膠柱得到橘黃色固體化合物5。esi-ms:[m]⁺150.

實(shí)施例6

制備化合物6a和6b

化合物5(1.5g,1mmol)溶于20ml甲醇溶液中，在室溫下攪拌1小時(shí)，旋出有機(jī)溶劑，過(guò)硅膠柱得到化合物6a(1.24g,85％).¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ4.33(s,3h).lr-ms分析值c3h3n4ocl(m+na)169.1；標(biāo)準(zhǔn)值146.0.

化合物5(1.5g,1mol)和四乙二醇單甲醚(3.16ml,1.5mol)溶于50ml二氯甲烷中，然后加入三乙胺(2.96ml,1.5mol)。室溫下攪拌3小時(shí)，加水淬滅反應(yīng)，二氯甲烷萃取，干燥，過(guò)硅膠柱，得到化合物6b(2.8g,87％).¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ4.833-4.810(t,2h),4.003-3.980(t,2h),3.680-3.657(t,2h),3.646-3.632(m,8h),3.559-3.546(t,2h),3.389(s,3h).lr-ms分析值c11h19n4o5cl(m+na)345.1；標(biāo)準(zhǔn)值322.1.

實(shí)施例7

制備化合物ia和ib

熒光基團(tuán)bodipy化合物(2.02g,3.8mol)和化合物6a(1.12g,7.6mol)溶于60ml乙腈溶劑中，然后加入三乙胺(1.52ml,11.4mol)。攪拌回流10小時(shí)，反應(yīng)后冷卻至室溫，水淬滅反應(yīng)，乙酸乙酯萃取，干燥，過(guò)硅膠柱得到化合物ia(2.1g,74％)。¹hnmr(400mhz,(cd3)2so)δ7.76-7.69(m,6h),7.63-7.56(m,4h),7.47-7.44(m,7h),7.02(s,2h),4.20(s,6h),1.44(s,6h).¹³cnmr(100mhz,(cd3)2so)δ166.82,166.79,153.92,152.35,142.43,139.77,136.28,134.41,134.20,133.17,129.71,129.61,128.57,121.55,118.93,118.70,57.06,14.57.hr-maldi-tof分析值c39h31bf2n10o4(m+na)775.248980；標(biāo)準(zhǔn)值775.248239.元素分析(％)分析值:c61.97,h4.34,n18.17；標(biāo)準(zhǔn)值:c62.25,h4.15,n18.61.

熒光基團(tuán)bodipy化合物(0.798g,1.5mol)和化合物6(1g,3mol)溶于60ml乙腈溶劑中，然后加入三乙胺(0.6ml,4.5mol)。攪拌回流10小時(shí)，反應(yīng)后冷卻至室溫，水淬滅反應(yīng)，乙酸乙酯萃取，干燥，過(guò)硅膠柱得到化合物ib(1.4g,85％)。¹hnmr(400mhz,(cd3)2so)δ7.76-7.73(m,4h),7.69-7.57(m,6h),7.51-7.44(m,7h),7.01(s,2h),4.67-4.64(t,2h),3.89-3.86(t,2h),3.64-3.61(m,4h),3.57-3.54(m,4h),3.51-3.48(m,12h),3.44-3.40(m,4h)3.32(s,6h),1.43(s,6h).¹³cnmr(100mhz,(cd3)2so)δ165.89,165.60,15.02,151.46,141.52,138.86,135.40,133.52,133.30,132.27,128.82,128.72,128.31,127.67,120.69,118.04,117.77,70.73,69.36, 69.28,69.23,69.04,68.33,67.61,57.50,13.69.hr-maldi-tof分析值c55h63bf2n10o12(m+na)1127.458944；標(biāo)準(zhǔn)值1127.458898.元素分析(％)分析值:c58.75,h5.78,n12.66；標(biāo)準(zhǔn)值:c59.78,h5.75,n12.68.

實(shí)施例8

將實(shí)施例7中的ia和ib用于硫化氫檢測(cè)：將ia和ib溶于10mmolhepes緩沖溶液與甲醇溶液(v/v＝4/6)中，得到ia和ib的濃度為10^-5m。向該溶液中加入濃度為10^-3m的硫化氫水溶液，最終硫化氫的濃度為10^-5m。最后測(cè)得熒光探針ia和ib在0-30分鐘內(nèi)隨時(shí)間變化的熒光光譜(見(jiàn)附圖1)，隨著時(shí)間增加，溶液熒光增強(qiáng)。相同條件加入生物硫醇、金屬離子等其他物質(zhì)，檢測(cè)熒光探針在30分鐘內(nèi)熒光強(qiáng)度比值，結(jié)果如附圖2所示。在圖2中，1為空白試驗(yàn)、2為半胱氨酸、3為谷胱甘肽、4為硫酸鉀、5為碳酸氫鈉、6為氯化鈉、7為碘化鉀、8為硫代硫酸鈉、9為亞硝酸鈉、10為硫酸氫鈉、11為溴化鉀、12為醋酸鈉、13為高氯酸鈉、14為次氯酸鈉、15為過(guò)硫酸鈉、16為雙氧水、17為硫化氫，從圖中可以看出，熒光探針溶液熒光強(qiáng)度受其他物質(zhì)的影響很小。

實(shí)施例9

將實(shí)施例7中的ia和ib用于細(xì)胞內(nèi)熒光成像：取兩組小鼠成纖維細(xì)胞，加入熒光探針ia和ib(最終濃度為10^-5m)培養(yǎng)60min。向其中實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)液中加入硫化氫水溶液(最終濃度為10^-4m)，另一組對(duì)照組培養(yǎng)液中不加入硫化氫水溶液。在熒光顯微鏡下成像，對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)熒光很弱，而實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)熒光很強(qiáng)，這是由于熒光探針在細(xì)胞內(nèi)被硫化氫還原使得熒光基團(tuán)熒光恢復(fù)。