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      一種基于多基因檢測的肝癌篩查方法與流程

      文檔序號:12835075閱讀:936來源:國知局

      本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域,是一種可用于肝癌篩查的多基因檢測方法,為肝癌的早期篩查提供了一種新的方法。



      背景技術(shù):

      肝癌(livercancer)即肝臟惡性腫瘤,是死亡率僅次于胃癌、食道癌的第三大常見惡性腫瘤。肝癌起病常隱匿,多在肝病隨訪中或體檢普查中應(yīng)用afp及b型超檢查偶然發(fā)現(xiàn)肝癌,此時病人既無癥狀,體格檢查亦缺乏腫瘤本身的體征,此期稱之為亞臨床期。肝癌從第一個癌細(xì)胞形成發(fā)展到有自覺癥狀,大約需要2年時間,在此期間,病人可無任何癥狀或體征,少數(shù)病人會出現(xiàn)一些早期癥狀。包括:食欲減退,上腹悶脹、乏力等,有些病人可能輕度肝腫大。肝癌一旦出現(xiàn)癥狀而來就診者其病程大多已進(jìn)入中晚期,肝癌的典型癥狀和體征一般出現(xiàn)于中晚期。中晚期癥狀主要有肝痛、乏力、消瘦、黃疸、腹水等。臨床上一般采取西醫(yī)的手術(shù)、放化療與中藥結(jié)合療法,但晚期患者因癌細(xì)胞擴(kuò)散而治愈率較低,因此做到肝癌的早期篩查、早期發(fā)現(xiàn)、早期治療具有非常重要的意義。

      實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-timert-pcr)是一種在dna擴(kuò)增反應(yīng)中,以熒光化學(xué)物質(zhì)測每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)循環(huán)后產(chǎn)物總量,通過內(nèi)參或者外參法對待測樣品中的特定dna序列進(jìn)行定量分析的方法。在pcr擴(kuò)增過程中,通過熒光信號,對pcr進(jìn)程進(jìn)行實時檢測。由于在pcr擴(kuò)增的指數(shù)時期,模板的ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系,所以成為定量的依據(jù)。

      本發(fā)明利用實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù),建立了一種基于多基因檢測的肝癌篩查方法,為肝癌的早期篩查提供了一種新的方法。



      技術(shù)實現(xiàn)要素:

      本發(fā)明利用實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-timert-pcr)技術(shù),通過檢測p53和beta-catenin基因的突變情況,篩選被測人員患肝癌的可能性。我們研究發(fā)現(xiàn)約有60%的肝癌患者中p53基因的249號密碼子發(fā)生突變,從agg突變到agt,即由精氨酸突變到絲氨酸。通過對p53-249ser的檢測可以進(jìn)行肝癌的篩選。我們設(shè)計的針對p53-249ser檢測的特異性的引物如下:

      p53mu-def:5’aggagaatggcgtgaacctg3’

      p53mu-der:5’gccacaggttaagaggtccc3’

      tm=60℃,pcr產(chǎn)物長度:488bp,擴(kuò)增模板類型:dna

      同時,我們研究發(fā)現(xiàn)beta-catenin基因,在肝癌患者中也常發(fā)生突變,該基因在33、37、41和45號密碼子分別由絲氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、絲氨酸均突變成纈氨酸。我們也針對性的設(shè)計了特異性的引物如下:

      beta-cateninmu-def:5’gatggagttggacatggcca3’

      beta-cateninmu-der:5’cagggaacatagcagctcgt3’

      tm=60℃,pcr產(chǎn)物長度:4881bp,擴(kuò)增模板類型:dna

      本發(fā)明通過檢測被測者血清中p53和beta-catenin基因的部分密碼子的突變情況,進(jìn)行肝癌的篩查。

      具體實施步驟如下:

      步驟一:對待測者進(jìn)行抽血,獲得200ul以上的血清樣本。

      步驟二:對血清樣本進(jìn)行p53基因第249號密碼子,beta-catenin基因第33、37、41和45號密碼子的rt-pcr檢測。

      步驟三:對每個密碼子的突變情況進(jìn)行檢測和分析。

      步驟四:p53基因的第249號密碼子突變?yōu)榻z氨酸的,被測者患肝癌的風(fēng)險較高,需要進(jìn)行進(jìn)一步檢查確認(rèn)是否患肝癌。

      步驟五:beta-catenin基因第33、37、41和45號密碼子,其中三個以上突變?yōu)槔i氨酸的,被測者患肝癌的風(fēng)險較高,需要進(jìn)行進(jìn)一步檢查確認(rèn)是否患肝癌。

      以上是對本發(fā)明的描述而非限定,基于本發(fā)明思想的其它實施方式,均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之中。



      技術(shù)特征:

      技術(shù)總結(jié)
      本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域,是一種可用于肝癌篩查的多基因檢測方法,為肝癌的早期篩查提供了一種新的方法。本發(fā)明運用實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(real-time?RT-PCR)。檢測待測者血清樣本中P53基因249號密碼子和beta-catanin基因33、37、41和45號密碼子的突變情況。根據(jù)P53基因249號密碼子是否突變?yōu)榻z氨酸和beta-catanin基因33、37、41和45號密碼子是否突變?yōu)槔i氨酸,就可以初步用于肝癌的早期篩查。

      技術(shù)研發(fā)人員:郭峻杰
      受保護(hù)的技術(shù)使用者:上海星昕生物科技有限公司
      技術(shù)研發(fā)日:2016.04.20
      技術(shù)公布日:2017.10.31
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