本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說，本發(fā)明涉及一種檢測kras基因4號外顯子117號和146號密碼子突變的引物對、試劑盒及方法。
背景技術(shù)：
：kras基因是一種原癌基因，長約35kb，位于12號染色體，是ras基因家族成員之一，編碼kras蛋白。它是egfr信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路一個重要的下游調(diào)控基因，kras基因發(fā)生突變時無需egfr接受信號，能夠自動活化該通路并啟動下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)紊亂，細胞增殖失控。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展，分子靶向藥物的個體化治療得到廣泛應(yīng)用。2008年，美國國家癌癥綜合治療聯(lián)盟(nccn)在《結(jié)直腸癌臨床實踐指南》中首次提出egfr靶向藥物療效與kras基因狀態(tài)密切相關(guān)。2011年，nccn在《結(jié)直腸癌臨床實踐指南》(v3.2011)明確指出：(1)所有轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者都應(yīng)檢測kras基因狀態(tài)；(2)只有kras基因野生型患者才建議接受egfr抑制劑(如西妥昔單抗和帕尼單抗)的治療。2015年，nccn對《結(jié)直腸癌臨床實踐指南》(v2.2015)做了更新：檢測kras基因狀態(tài)，包括kras外顯子2和外顯子3，4以及nras基因的外顯子2，3和4，此外，還需檢測braf基因狀態(tài)，無論是否有kras突變。kras基因的4號外顯子117號和146號作為熱點突變位點，越來越多臨床實驗室開始開展該項目檢測。目前較常用的方法包括：測序法、基于探針的熒光定量pcr法等。測序法因為可以讀出dna每個堿基的變化，目前被認為是 檢測基因突變的金標準方法，但因為靈敏度低，測序步驟繁瑣、耗時長，對設(shè)備和操作人員的要求較高，不易于形成標準化操作的分子診斷產(chǎn)品?；谔结樀臒晒舛縫cr法檢測基因突變是通過已知的特異性探針實現(xiàn)的，該方法靈敏度高、特異性好，目前已有基于該方法的檢測kras基因突變的商品化試劑盒，但該方法針對于kras基因4號外顯子117號和146號密碼子上發(fā)生的稀有突變類型，則檢測不出來，且檢測試劑成本高。因此，有必要提供一種改進的方法以實現(xiàn)kras基因的4號外顯子117號和146號密碼子突變狀態(tài)的快速、準確且廉價的檢測方法。技術(shù)實現(xiàn)要素：基于此，為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供了一種針對檢測kras基因的4號外顯子117號和146號密碼子突變的引物對、試劑盒及hrm檢測方法。為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案：一種檢測kras基因4號外顯子密碼子突變的引物對，所述引物對為：針對117號密碼子突變檢測的seqidno:1和seqidno:2，和/或針對146號密碼子突變檢測的seqidno:3和seqidno:4。本發(fā)明還提供了一種檢測kras基因4號外顯子密碼子突變的試劑盒，所述試劑盒包括針對117號密碼子突變檢測的如seqidno:1和seqidno:2所示的引物對、和/或針對146號密碼子突變檢測如seqidno:3和seqidno:4所示的引物對。在其中一些實施例中，所述檢測試劑盒還包括飽和熒光染料。在其中一些實施例中，所述飽和熒光染料為evagreen。在其中一些實施例中，所述檢測試劑盒還包括buffer、dntp和taq酶。本發(fā)明還提供了一種檢測kras基因4號外顯子密碼子突變的反應(yīng)體系，所述反應(yīng)體系包括針對117號密碼子突變檢測的如seqidno:1和seqidno:2所示的引物對、和/或針對146號密碼子突變檢測的如seqidno:3和seqidno:4所示的引物對。在其中一些實施例中，所述反應(yīng)體系還包括evagreen、dntp和taq酶。在其中一些實施例中，針對117號密碼子突變檢測的反應(yīng)體系為：dna模板1-5μl、10×buffer2-2.5μl、dntp2-2.5μl、evagreen1-1.25μl、mg2+0.8-1.5μl、seqidno:1引物0.6-1μl、seqidno:2引物0.6-1μl、taq酶0.25-0.4μl、無酶水加至20-25μl；針對146號密碼子突變檢測的反應(yīng)體系為：dna模板1-5μl、10×buffer2-2.5μl、dntp2-2.5μl、evagreen1-1.25μl、mg2+0.8-1.5μl、seqidno:3引物0.6-1μl、seqidno:4引物0.6-1μl、taq酶0.25-0.4μl、無酶水加至20-25μl。本發(fā)明還提供了一種檢測kras基因4號外顯子密碼子突變的方法，包括以下步驟：(1)、以待檢測樣品的dna作為模板，采用針對117號密碼子突變檢測的如seqidno:1和seqidno:2所示的引物對、和/或針對146號密碼子突變檢測的如seqidno:3和seqidno:4所示的引物對分別進行熒光定量pcr反應(yīng)及hrm分析，收集熒光信號；(2)、判讀待檢測樣品的熔解曲線，若待檢測樣品的針對117號密碼子突變的熔解曲線中顯示出兩個及以上的熔解峰，則表示該患者的117號密碼子存在突變，如只顯示一個熔解峰，則表示該患者的117號密碼子為野生型。同理，若待檢測樣品的針對146號密碼子突變的熔解曲線中顯示出兩個及以上的熔解 峰，則表示該患者的146號密碼子存在突變，如只顯示一個熔解峰，則表示該患者的146號密碼子為野生型。在其中一些實施例中，步驟(1)針對117號密碼子突變檢測的熒光定量pcr的反應(yīng)體系為：dna模板1-5μl、10×buffer2-2.5μl、dntp2-2.5μl、evagreen1-1.25μl、mg2+0.8-1.5μl、seqidno:1引物0.6-1μl、seqidno:2引物0.6-1μl、taq酶0.25-0.4μl、無酶水加至20-25μl；針對146號密碼子突變檢測的熒光定量pcr的反應(yīng)體系為：dna模板1-5μl、10×buffer2-2.5μl、dntp2-2.5μl、evagreen1-1.25μl、mg2+0.8-1.5μl、seqidno:3引物0.6-1μl、seqidno:4引物0.6-1μl、taq酶0.25-0.4μl、無酶水加至20-25μl。在其中一些實施例中，步驟(1)所述熒光定量pcr的反應(yīng)程序為：95℃5min→95℃10s、62℃15s、72℃25s，40cycles→95℃1min→40℃1min→熔解溫度72-83℃，溫度每升高1℃，獲取15次熒光信號→40℃10s。在其中一些實施例中，步驟(1)所述模板的濃度為50-100ng/μl。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：1、本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過多次探索發(fā)現(xiàn)，采用本發(fā)明的試劑盒進行kras基因4號外顯子117和146號密碼子hrm法檢測，可檢測出低至5％的突變分子，可以檢測kras基因4號外顯子117和146號密碼子上的所有突變類型，不受突變堿基位點與類型局限；與sanger測序法(金標準方法)結(jié)果相比，結(jié)果一致率為99.84％(657/658)；唯一1例不符的樣品經(jīng)廈門艾德kras基因19種突變檢測試劑盒檢測，其結(jié)果與本發(fā)明方法的結(jié)果相符。說明該例標本實際上是屬于低豐度突變，金標準sanger測序法由于檢測靈敏度低不能檢出，而本發(fā)明的靈敏度高，針對低豐度突變的樣品也可檢出。另有1例樣品的dna質(zhì)量差，測序法無法獲得檢測結(jié)果，但利用本發(fā)明方法，可以獲得檢測結(jié)果，并與廈門 艾德kras基因19種突變檢測試劑盒檢測結(jié)果一致。說明本發(fā)明方法對樣本dna的質(zhì)量要求低，適用性廣。同時，本發(fā)明方法對設(shè)備的要求也大大降低，無需使用測序儀，只需一臺帶有hrm功能的熒光定量pcr儀即可，適用范圍更廣，儀器成本更低；2、本發(fā)明的檢測方法操作程序大大簡化，全程閉管操作，避免交叉污染，易形成標準化操作的體外診斷試劑產(chǎn)品，且檢測時間和試劑成本大大降低，60-90分鐘內(nèi)即可完成檢測。附圖說明圖1為樣本中含有kras基因4號外顯子117號密碼子aaa>aat突變的hrm分析圖；圖2為樣本中不含kras基因4號外顯子117號密碼子aaa>aat突變的hrm分析圖；圖3為樣本中含有kras基因4號外顯子146號密碼子gca>cca突變的hrm分析圖；圖4為樣本中不含kras基因4號外顯子146號密碼子gca>cca突變的hrm分析圖；圖5為不同突變比例的kras基因4號外顯子117號k117n(aaa>aac)突變標準品1的hrm分析圖；其中，a為25％突變標準品1，b為10％突變標準品1，c為5％突變標準品1，d為0％突變標準品1；圖6為不同突變比例的kras基因4號外顯子146號a146v(gca>gta)突變標準品2的hrm分析圖；其中，a為25％突變標準品2，b為10％突變標準品2，c為5％突變標準品2，d為0％突變標準品2；圖7為采用不同引物，使用本發(fā)明所述hrm檢測方法檢測kras基因4號外顯子117號密碼子突變的擴增曲線，其中，使用引物對1擴增效果良好，可以正確分辨出突變型樣品；使用引物對3、4無法檢測突變型標本；使用引物對5、6效果差；圖8為采用不同引物，使用本發(fā)明所述hrm檢測方法檢測kras基因4號外顯子146號密碼子突變的擴增曲線，其中，使用引物對2擴增效果良好，可以正確分辨出突變型樣品；使用引物對7、8無法檢測突變型標本；使用引物對9、10效果差。具體實施方式以下通過具體的實施例進一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案，具體實施例不代表對本發(fā)明保護范圍的限制。其他人根據(jù)本發(fā)明理念所做出的一些非本質(zhì)的修改和調(diào)整仍屬于本發(fā)明的保護范圍。以下實施例中的步驟除了特殊說明外，均為本領(lǐng)域常規(guī)操作步驟，以下實施例中所使用的原料，均來源于市售。實施例1腸癌腫瘤組織樣品kras的4號外顯子117號和146號密碼子的突變檢測1、引物本發(fā)明的一種檢測腸癌腫瘤組織樣品kras的4號外顯子117號密碼子aaa>aat的突變的引物，具有seqidno.1和seqidno.2的堿基序列。上游引物seqidno.1:aggactctgaagatgtacctat下游引物seqidno.2:aggactctgaagatgtacctat一種檢測腸癌腫瘤組織樣品kras的4號外顯子146號密碼子gca>cca 的突變的引物，具有seqidno.3和seqidno.4的堿基序列。上游引物seqidno.3:cacaaaacaggctcagga下游引物seqidno.4:cagtgttacttacctgtcttgtc2、反應(yīng)體系使用blendtaqplus酶(toyobo，catno.btq-201)分別配制如下反應(yīng)體系：名稱用量(μl)10×buffer2dntp2evagreen1mg2+0.8seqidno:1引物0.6seqidno:2引物0.6taq酶0.25無酶水11.75dna模板13、檢測方法(1)、樣品來源及基因組dna提取：所有腸癌患者腫瘤樣品均來自中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院病理科，收集組織，使用美基石蠟樣品提取試劑盒對基因組dna進行提取。dna模板濃度分別調(diào)整至50-100ng/ul。在上述兩個反應(yīng)體系中分別加入1ul的dna模板。渦旋混勻后，分別使用羅氏lightcycler480實時熒光定量pcr儀進行檢測，程序如下：95℃5min→(95℃10s→62℃15s→72℃25s)40cycles(設(shè)置在72℃收集熒光信號)→95℃1min→40℃1min→熔解溫度(72-83℃)，溫度每升高1℃，獲取15次熒光信號→40℃10s。(2)、判讀待測標本的熔解曲線，以確定kras基因4號外顯子的117號和146號密碼子是否存在突變。若樣品kras基因4號外顯子的117號密碼子存在aaa>aat突變，則待測樣品熔解曲線顯示出兩個及以上的熔解峰，共檢測100例樣品，與sanger測序法進行結(jié)果比較，兩種方法結(jié)果100％相符。若樣品kras基因4號外顯子的146號密碼子存在gca>cca突變，則待測樣品熔解曲線顯示出兩個及以上的熔解峰，共檢測100例樣品，與sanger測序法進行結(jié)果比較，兩種方法結(jié)果100％相符。圖1為樣本中含有kras基因4號外顯子117號密碼子aaa>aat突變的hrm分析圖；圖2為樣本中不含kras基因4號外顯子117號密碼子aaa>aat突變的hrm分析圖。圖3為樣本中含有kras基因4號外顯子146號密碼子gca>cca突變的hrm分析圖；圖4為樣本中不含kras基因4號外顯子146號密碼子gca>cca突變的hrm分析圖。實施例2檢測kras的4號外顯子117號和146號密碼子的突變的試劑盒本實施例的檢測試劑盒包括以下試劑1和試劑2，分別包括如下組分：名稱用量(μl)10×buffer2dntp2evagreen1mg2+0.8seqidno:1引物0.6seqidno:2引物0.6taq酶0.25無酶水11.75dna模板1名稱用量(μl)10×buffer2dntp2evagreen1mg2+0.8seqidno:3引物0.6seqidno:4引物0.6taq酶0.25無酶水11.75dna模板1試驗例1本發(fā)明方法的靈敏度驗證靈敏度驗證采取了以下方法：1、使用kras基因4號外顯子117號k117n(aaa>aac)突變標準品1和146號a146v(gca>gta)突變標準品2，分別與野生型標準品配制成以下幾種不同突變比例的標準品1和2：25％突變、10％突變、5％突變、0％突變，具體配制方法參考本
技術(shù)領(lǐng)域：
的常規(guī)方法。2、配制檢測試劑1和2，即實施例1中的兩個反應(yīng)體系；3、取步驟1所配制的不同突變比例的標準品1、2各1ul，分別加入步驟2中檢測試劑1和檢測試劑2，將檢測試劑放入羅氏lightcycler480實時熒光定量pcr儀中進行檢測；4、pcr和hrm程序：95℃5min→(95℃10s→62℃15s→72℃25s)40cycles(設(shè)置在72℃收集熒光信號)→95℃1min→40℃1min→熔解溫度(72-83℃)，溫度每升高1℃，獲取15次熒光信號→40℃10s。5、hrm結(jié)果分析：若樣品kras基因4號外顯子的117號密碼子存在突變，則檢測試劑1的待測樣品熔解曲線顯示出兩個及以上的熔解峰；若樣品kras基因4號外顯子的146號密碼子存在突變，則檢測試劑2的待測樣品熔解曲線顯示出兩個及以上的熔解峰。結(jié)果如圖5和圖6所示。圖5為不同突變比例的kras基因4號外顯子117號k117n(aaa>aac)突變標準品1的hrm分析圖，由圖5可看出，使用本發(fā)明的檢測試劑1及檢測方法確保能檢出5％的突變。圖6為不同突變比例的kras基因4號外顯子146號a146v(gca>gta)突變標準品2的hrm分析圖，由圖6可看出，使用本發(fā)明的檢測試劑2及檢測方法確保能檢出5％的突變。試驗例2本發(fā)明方法與sanger測序法和廈門艾德kras基因19種突變檢測試劑盒的檢測結(jié)果比較659例臨床樣品均來自中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院病理科，其中結(jié)腸癌320例，直腸癌277，胃癌55例，肛管癌7例。分別采取本發(fā)明實施例1或2方法、sanger測序法和廈門艾德kras基因19種突變檢測試劑盒對這659例樣品進行了檢測，結(jié)果如表1所示。表1三種方法的檢測結(jié)果比較由表1結(jié)果可知，共有658例樣本同時具有本發(fā)明所述方法與金標準sanger測序法的結(jié)果，本發(fā)明方法的特異性為99.84％，敏感性為100％，陽性預(yù)測值為94.44％。唯一1例結(jié)果不相符的樣品，經(jīng)廈門艾德kras基因19種突變檢測試劑盒進行檢測后，其結(jié)果均與本發(fā)明所述方法一致，說明該例標本實際上是屬于低豐度突變，金標準sanger測序法由于檢測靈敏度低不能檢出，而本發(fā)明的靈敏度高，針對低豐度突變的樣品也可檢出。另有1例樣品由于dna質(zhì)量差，用sanger測序法無法檢測，而本發(fā)明方法可以對其進行檢測，檢測結(jié)果為野生型。經(jīng)廈門艾德kras基因19種突變檢測試劑盒進行檢測后，其結(jié)果均與本發(fā)明所述方法一致，說明本發(fā)明方法對樣本dna的質(zhì)量要求低，適用性廣。試驗例3采用不同引物對kras基因4號外顯子的突變檢測的結(jié)果對比發(fā)明人摸索了多組引物對，研究hrm法(實施例1和2的方法)對檢測上述kras基因4號外顯子基因突變的實驗結(jié)果的影響。以下表2為kras的4號外顯子117號密碼子采用多組示例性引物使用檢測試劑1以實施例1方法進行實驗所得結(jié)果。實驗證明，引物的最終選擇關(guān)乎方法的可行性。表2采用5對引物對和峰型、判讀結(jié)果比較注：上表采用hrm檢測法，其pcr程序總共設(shè)置40個循環(huán)。樣品擴增ct值<25為佳，若樣品擴增ct值不在該范圍內(nèi)，則判讀為該次pcr反應(yīng)擴增效果不好或無法擴增，最后有可能會影響擴增產(chǎn)物的量和后續(xù)的hrm分析。結(jié)果顯示，樣品1使用sanger測序法判讀為突變型，而表2內(nèi)的5對引物采用本發(fā)明所述方法和檢測試劑1檢測。發(fā)現(xiàn)只有seqidno:1、seqidno:2所示引物(即上列表2中引物對1)可以準確檢測出樣品1為突變型，其余4對引物(即上列表中引物對3-6)均無法準確判讀。以下表3為kras的4號外顯子146號密碼子采用多組示例性引物使用檢測試劑2以實施例1方法進行實驗所得結(jié)果。實驗證明，引物的最終選擇關(guān)乎方法的可行性。表3采用5對引物對和峰型、判讀結(jié)果比較注：上表采用hrm檢測法，其pcr程序總共設(shè)置40個循環(huán)。樣品擴增ct值<25為佳，若樣品擴增ct值不在該范圍內(nèi)，則判讀為該次pcr反應(yīng)擴增效果不好或無法擴增，最后有可能會影響擴增產(chǎn)物的量和后續(xù)的hrm分析。結(jié)果顯示，樣品2使用sanger測序法判讀為突變型，而表3內(nèi)的5對引物采用本發(fā)明所述hrm法和檢測試劑1檢測。發(fā)現(xiàn)只有seqidno:1、seqidno:2所示引物(即上列表4中引物對2)可以準確檢測出樣品2為突變型，其余4對引物(即上列表中引物對7-10)均無法準確判讀。試驗例4本發(fā)明檢測方法與sanger測序法時間及成本對比計算方法：針對試驗例2中使用兩種方法均有檢測結(jié)果的657對待測標本進行核算，結(jié)果如表4所示。表4.本發(fā)明方法與sanger測序法試劑盒的檢測時間和成本的比較本發(fā)明hrm法sanger測序法實驗花費時間估算1.5小時/標本10.5小時/標本實驗成本估算7元/標本35元/標本由結(jié)果可知，使用本發(fā)明hrm檢測方法對kras的4號外顯子117和146位點進行檢測，每個標本的檢測時間比sanger測序法縮短了85.71％，同時每個標本的檢測成本降低了80％。使用本發(fā)明所述hrm方法針對kras的4號外顯子117和146位點的檢測，可以大大節(jié)約檢測時間和成本，更好的服務(wù)臨床病人。以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準。當前第1頁12