本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)，具體涉及一種用于前列腺癌診斷的引物和探針。
背景技術(shù)：
：前列腺癌多發(fā)于老年男性，發(fā)病率在全球男性惡性腫瘤中占第二位，因癌癥死亡的男性中，前列腺癌排名第五。年齡、性活動(dòng)、飲食習(xí)慣和家族遺傳為前列腺癌發(fā)病的主要風(fēng)險(xiǎn)因素。2012年我國(guó)腫瘤登記地區(qū)前列腺癌發(fā)病率為9.92/10萬(wàn)，且發(fā)病率逐年上升，并呈年輕化趨勢(shì)。由于前列腺癌早期沒(méi)有特異性癥狀，我國(guó)約70％前列腺癌患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已是晚期。因前列腺癌骨轉(zhuǎn)移率較高，自然進(jìn)展的前列腺癌在利用有效方法臨床檢測(cè)到時(shí)通常已經(jīng)轉(zhuǎn)移。前列腺癌可以通過(guò)手術(shù)等切除前列腺、睪丸進(jìn)行治療，在切除之后由于沒(méi)有腫瘤組織，檢測(cè)體內(nèi)是否還存在癌細(xì)胞的難度較大。血管舒緩素相關(guān)肽酶3(kallikrein-relatedpeptidase3，klk3)，也被稱作前列腺特異抗原(prostate-specificantigen，psa)，klk3基因是人類組織激肽釋放酶基因(klk)家族成員，位于19號(hào)染色體上，在前列腺癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，其編碼的蛋白是前列腺特異性抗原(psa)。是臨床上廣泛用于篩選、診斷前列腺癌的腫瘤標(biāo)志物。klk3基因位于19q13.2-q13.4，基因全長(zhǎng)6kb，含有5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子，轉(zhuǎn)錄后的mrna全長(zhǎng)1446bp，轉(zhuǎn)錄受雄激素調(diào)節(jié)。目前，psa檢測(cè)、盆腔電子計(jì)算機(jī)斷層掃描(ct)檢查、盆腔核磁共振(mri)檢查、直腸超聲(trus)引導(dǎo)下前列腺穿刺活檢等檢查是前列腺癌篩查的主要檢測(cè)手段。對(duì)于psa檢測(cè)來(lái)說(shuō)，患者血清中存在異常高水平psa可能是由于癌癥、良性前列腺增生或前列腺炎等多種原因?qū)е?，在大多?shù)病例中，psa升高是由于良性前列腺增生或前列腺炎而不是由于癌癥；mri檢查在鑒別前列腺癌及伴鈣化的前列腺炎、較大的良性前列腺增生、前列腺瘢痕、結(jié)核等病變時(shí)常無(wú)法明確診斷；盆腔ct對(duì)于早期前列腺癌的診斷敏感性低于mri，前列腺癌患者進(jìn)行ct檢查的目的主要是協(xié)助臨床醫(yī)師進(jìn)行腫瘤的臨床分期；trus引導(dǎo)下的前列腺穿刺活檢是目前公認(rèn)的安全而準(zhǔn)確的方法，已成為臨床實(shí)踐中診斷前列腺癌最可靠的檢查，但是穿刺活檢除了造成患者的創(chuàng)口疼痛外，其術(shù)后多種并發(fā)癥也會(huì)給患者帶來(lái)很大痛苦。外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞(ctc)的檢測(cè)是腫瘤患者液體活檢的重要手段。當(dāng)患者體內(nèi)發(fā)生腫瘤時(shí)，或者腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移產(chǎn)生時(shí)，瘤塊組織中會(huì)有大量脫落的腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)。利用高度靈敏的檢測(cè)技術(shù)，將循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)出來(lái)，可以對(duì)腫瘤進(jìn)行早期診斷、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移進(jìn)行評(píng)估。因此，建立新的前列腺癌診斷技術(shù)、能夠在靈敏準(zhǔn)確的確定患者體內(nèi)是否存在前列腺癌細(xì)胞，以便對(duì)于診斷患者是否患有前列腺癌和判斷患者手術(shù)效果來(lái)確定最佳治療方案以提高患者存活率、降低醫(yī)療成本是十分必要的。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種用于檢測(cè)人前列腺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞的特異性引物和探針的組合及包括該引物和探針組合的試劑盒，以及他們的應(yīng)用及檢測(cè)方法。本發(fā)明一方面提供一種人前列腺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞特異性基因檢測(cè)的real-timepcr引物和探針組合，用于人前列腺癌或其復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的分子診斷，另一方面提供一種用于檢測(cè)人前列腺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞的試劑盒，同時(shí)提供利用本發(fā)明的real-timepcr檢測(cè)試劑盒診斷前列腺癌的方法。本發(fā)明通過(guò)在人前列腺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞基因組中klk3基因的啟動(dòng)子區(qū)設(shè)計(jì)一對(duì)特異性的real-timepcr引物和相應(yīng)的探針，用該引物和探針對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行rt-qpcr檢測(cè)，根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果判定待檢樣本是否含有人前列腺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞。本發(fā)明提供的用于人前列腺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)的特異性引物和探針的組合，其具有如下序列：引物1：5’atcaggaacaaaagcgtgatct3’(seqidno.1所示)，引物2：5’atatcgtagagcgggtgtgg3’(seqidno.2所示)，探針：5’atttcaggtcagccacagct3’(seqidno.3所示)。本發(fā)明提供的用于檢測(cè)人前列腺癌的real-timepcr檢測(cè)試劑盒，其特征在于包括以上所述的特異性引物和探針的組合。優(yōu)選的，在本發(fā)明中所述的試劑盒中還包括10×pcr緩沖液，50mmmgcl2，10μmdntp以及5u/μltaq酶。本發(fā)明還提供了以上所述的特異性引物和探針的組合在制備檢測(cè)前列腺癌試劑中的應(yīng)用，以及所述的試劑盒在制備檢測(cè)前列腺癌患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞試劑中的應(yīng)用。本發(fā)明另外還提供了利用real-timepcr檢測(cè)試劑盒診斷人前列腺癌的方法，其特征在于，包括如下步驟：(1)血液提取rna：從待測(cè)血液(2.5ml)提取rna，用dnasei消化除去基因組dna。用超微量分光光度計(jì)評(píng)價(jià)rna的純度，-80度待用。(2)引物和探針溶液的配制：取18μl引物1(100μm)，18μl引物2(100μm)，5μl探針(100μm)，59μl去離子水?；靹虻?00μl20×的引物探針混合液(ppmix)。(3)反轉(zhuǎn)錄：取1μl上述rna，加入5×的反應(yīng)緩沖液2μl，dntps[指datp，dctp，dgtp，dttp鈉鹽的三蒸水溶液，濃度各10mm，ph7.5，純度＞99％(hplc)]0.4μl，2×ppmix1μl，反轉(zhuǎn)錄酶1μl，雙蒸水4.6μl，混勻后反應(yīng)體系為10μl。(4)預(yù)擴(kuò)增：50℃，30min；95℃，15min；94℃，30s；60℃，2min。最后兩步循環(huán)14次。(5)熒光定量pcr反應(yīng)：將上述所得cdna用去離子水1∶1稀釋。取1μlcdna，加入2×反應(yīng)緩沖液5μl，20×ppminx0.5μl，roxdye0.4μl，雙蒸水3.1μl。95℃變性2min，95℃，15s；60℃，2min，后兩步循環(huán)40次。熒光定量檢測(cè)探針結(jié)果，如果在閾值以上出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，結(jié)果為陽(yáng)性；反之，結(jié)果為陰性。本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：1)特異性：用本發(fā)明的引物、探針和方法檢測(cè)人外周血液樣本，只有前列腺癌患者或者復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的前列腺癌患者的血液樣本出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，顯示結(jié)果為陽(yáng)性，而正常人或非前列腺癌患者的外周血樣本均未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，顯示結(jié)果為陰性。這說(shuō)明本發(fā)明有很好的特異性。2)靈敏度：本發(fā)明的方法可檢測(cè)到從人2.5ml外周血中所提取的1pg的rna，說(shuō)明具有很高的靈敏度。3)高通量：本方法應(yīng)用熒光定量pcr儀(abiht7900)，一次可以同時(shí)檢測(cè)384例樣本，從而大量節(jié)省了時(shí)間，提高了效率。本發(fā)明建立了一種前列腺癌的分子檢測(cè)技術(shù)，彌補(bǔ)了現(xiàn)有技術(shù)的不足，與常規(guī)的前列腺癌診斷方法相比，本發(fā)明的方法具有快速、高通量、靈敏和特異性好等特點(diǎn)，能更好地進(jìn)行前列腺癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的監(jiān)測(cè)。最重要的是，本方法適用于臨床液體活檢的前列腺癌患者樣本，能更好地進(jìn)行人前列腺癌的早期診斷。附圖說(shuō)明圖1為人前列腺癌患者外周血樣本(15例)的特異性rt-qpcr檢測(cè)結(jié)果(閾值0.1)；圖2為健康人外周血樣本(15例)的特異性rt-qpcr檢測(cè)結(jié)果(閾值0.1)。具體實(shí)施方式以下通過(guò)實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，應(yīng)該理解的是，這些實(shí)施例僅用于例證的目的，絕不限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，參見(jiàn)《分子克隆》(科學(xué)出版社，第二版，2002年)。實(shí)施例1用于人前列腺癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移檢測(cè)的特異性引物和探針的建立本發(fā)明的人前列腺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞特異性標(biāo)志物klk3的rt-pcr引物和探針，是根據(jù)ncbi(美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心)公開(kāi)的人類圈基因組序列，使用primerpremier5.0設(shè)計(jì)，由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。引物1：5’atcaggaacaaaagcgtgatct3’；引物2：5’atatcgtagagcgggtgtgg3’；探針：5’atttcaggtcagccacagct3’。實(shí)施例2用于檢測(cè)人前列腺癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的real-timepcr檢測(cè)試劑盒包括以下引物序列和探針序列：引物1：5’atcaggaacaaaagcgtgatct3’；引物2：5’atatcgtagagcgggtgtgg3’；探針：5’atttcaggtcagccacagct3’。所述的試劑盒還包括10×pcr緩沖液，50mmmgcl2，10μmdntps，5u/μltaq酶。實(shí)施例3本發(fā)明的試劑盒在檢測(cè)人前列腺癌中的應(yīng)用本發(fā)明采用的taq酶購(gòu)于英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司；rna提取試劑盒為paxgenebloodrnakit(giagen，germany)；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?。本發(fā)明所采用的生物材料均來(lái)自江蘇省腫瘤醫(yī)院普外科，所有樣本均有患者本人簽署的知情同意書(shū)及倫理證明。一、血液提取rna流程使用的血液rna提取試劑盒，來(lái)自paxgenebloodrnakit(giagene，germany)。1.取2.5ml全血(包括15例前列腺癌患者血液樣本和15例健康人血液樣本)，用paxgenebloodrna采血管采集。2.離心，將沉淀和蛋白酶k一起溶解在緩沖液中孵育，進(jìn)行蛋白質(zhì)酵解。應(yīng)用paxgeneshredder離心柱再次離心，均漿細(xì)胞裂解液，并去除剩余的細(xì)胞殘骸。3.將流過(guò)部分的上清液轉(zhuǎn)移到干凈的微型離心管中，加入乙醇調(diào)節(jié)結(jié)合條件，將裂解液裝入一個(gè)paxgenerna離心柱中。4.使用dnasei酶消化除去微量的基因組dna。洗滌之后，使用洗脫緩沖液洗脫rna并進(jìn)行熱變形。5.提取的rna，分別取1μlrna和9μl去離子水，用超微量分光光度計(jì)測(cè)rna純度。最后即得rna模板，-80度保存待用。二、制備100μl的20×引物和探針的混合反應(yīng)液1.取18μl引物1(100μm)，2.取18μl引物2(100μm)，3.取5μl探針(100μm)，4.將前述的引物1和引物2及探針加入59μl的去離子水中，將上述引物和探針混勻后，即得100μl的20×引物和探針的混合反應(yīng)液(ppmix)。三、rt-pcr流程實(shí)驗(yàn)所使用的熒光定量pcr檢測(cè)儀為abi公司的ht7900。1.反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄所用的試劑盒為qiagenone-steprt-pcrkit(giagen，germany)。取1μl上述實(shí)施例1所述的rna，加入5×反應(yīng)緩沖液2μl，dntps0.4μl，20×ppmix1μl，反轉(zhuǎn)錄酶1μl，去離子水4.6μl，混勻后反應(yīng)體系為10μl。rt-pcr體系如表1所示：表1rt-pcr體系組分體積5×反應(yīng)緩沖液2μldntps0.4μl20×ppmix1μlrna模板1μl反轉(zhuǎn)錄酶1μlh2o4.6μl合計(jì)10μl2.預(yù)擴(kuò)增。rt-pcr反應(yīng)條件如表2所示：表2反應(yīng)條件其中，50℃、30min，循環(huán)1次；95℃、15min，循環(huán)1次；94℃、30s；60℃、2min，循環(huán)14次。即得cdna。四、熒光定量pcr反應(yīng)熒光定量pcr反應(yīng)所用試劑盒為pcr(abi，usa)。將上述所得cdna用去離子水1∶1稀釋；取1μlcdna，加入2×反應(yīng)緩沖液5μl，20×ppmix0.5μl，roxdye0.4μl，去離子水3.1μl；95℃變性2min；95℃、15s；60℃、2min，后兩步循環(huán)40次。real-timepcr反應(yīng)體系以及反應(yīng)條件如表3和表4所示：表3real-timepcr體系組分體積2×反應(yīng)緩沖液5μl20×ppmix0.5μlcdna1μlroxdye0.4μlh2o3.1μl合計(jì)10μl表4反應(yīng)條件五、熒光定量檢測(cè)探針結(jié)果所得結(jié)果見(jiàn)圖1-2。結(jié)果顯示15例前列腺癌患者樣本中在設(shè)定的閾值0.1以上所有樣本出現(xiàn)明顯的擴(kuò)增曲線，提示結(jié)果陽(yáng)性(圖1)；而15例健康人樣本在設(shè)定的閾值0.1以上均未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，提示結(jié)果陰性(圖2)。說(shuō)明本發(fā)明的試劑盒可用于人前列腺癌的診斷。以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明而言僅是說(shuō)明性的，而非限制性的；本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解，在本發(fā)明權(quán)利要求所限定的精神和范圍內(nèi)科對(duì)其進(jìn)行許多改變，修改，甚至等效變更，但都將落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)12