本專利涉及乳品乳酸菌活性快速檢測方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域范疇。
背景技術(shù)：
乳酸菌（lactobacillus）是發(fā)酵糖類且主要產(chǎn)物為乳酸的一類無芽孢、革蘭氏染色陽性細菌的總稱。凡是能從葡萄糖或乳糖的發(fā)酵過程中產(chǎn)生乳酸的細菌統(tǒng)稱為乳酸菌。是一種存在于人類體內(nèi)的益生菌。乳酸菌可用于制造酸奶、乳酪、德國酸菜、啤酒、葡萄酒、泡菜、腌漬食品和其他發(fā)酵食品。
人類制作發(fā)酵乳的歷史可追溯到數(shù)千年以前，最早的發(fā)酵可能是游牧民族偶然實現(xiàn)的。早在公元前2000年左右，埃及和古希臘人已經(jīng)掌握了發(fā)酵乳的手工制作方法，其實質(zhì)是利用乳中的固有微生物使其定向繁殖后形成所期望的產(chǎn)物。19世紀80年代，主要在農(nóng)場小批量地生產(chǎn)黃油和干酪，其后隨著商業(yè)化規(guī)模的擴大，生產(chǎn)單位開始合并，導(dǎo)致對發(fā)酵劑的需求量增大，因此出現(xiàn)了一些專門生產(chǎn)發(fā)酵劑的工廠。在19世紀末20世紀初，已經(jīng)用組成不確定發(fā)酵劑來發(fā)酵乳制品，生產(chǎn)高質(zhì)量的干酪和黃油。多年來，發(fā)酵劑經(jīng)過多次的傳代，它們的組成已經(jīng)發(fā)生改變，與最初凝固乳的發(fā)酵劑的組成可能明顯不同。
乳酸菌的發(fā)現(xiàn)分離不僅為研究和利用乳中微生物鋪平了道路，還促進了乳品發(fā)酵劑工業(yè)的崛起。如今乳酸菌及其發(fā)酵劑已成為乳制品發(fā)酵的核心，對其研究方興未艾，前景廣闊。
乳酸菌發(fā)酵劑的發(fā)展大致經(jīng)歷了天然型、傳統(tǒng)人工型和濃縮直投型3個階段。1、菌種生理代謝方面。對菌種基因序列分析、功能基因確定、碳氮源代謝途徑和所需工業(yè)特性基因的改造等進行全面細致地研究，欲從基因角度了解其發(fā)酵機制和過程。2、乳酸菌生理活性研究與利用。雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌等腸道有益菌分泌的代謝產(chǎn)物對消化道健康、免疫和抑癌的積極作用已引起世界范圍的重視，使得研究者跳出單純利用發(fā)酵劑改善產(chǎn)品風(fēng)味和質(zhì)構(gòu)的框架，進一步開發(fā)出具有高附加值的功能型乳制品。3、發(fā)酵劑生產(chǎn)技術(shù)的提高。高密度培養(yǎng)技術(shù)，發(fā)酵與產(chǎn)物分離偶聯(lián)技術(shù)和冷凍干燥生物技術(shù)等工程技術(shù)的不斷改進，不僅使乳酸菌進行自動化和連續(xù)化發(fā)酵生產(chǎn)成為可能，還大大降低了機械設(shè)備和冷凍干燥對菌體的傷害，提高了發(fā)酵劑保藏過程中菌體的存活率。
目前乳品發(fā)酵劑生產(chǎn)多采用冷凍干燥的方法，發(fā)酵劑菌粉制作過程一般要經(jīng)過高密度發(fā)酵培養(yǎng)、離心菌體、加保護劑、預(yù)冷凍、凍干等過程。冷凍干燥濃縮發(fā)酵劑可防止菌種失活及復(fù)配菌種的比例在保存、擴大培養(yǎng)過程中發(fā)生變化，還可防止雜菌污染和省去菌種擴培過程，保證產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定和可精確控制，但是冷凍干燥對活菌存活率和菌體活力也有較大的影響。
目前乳酸菌活菌計數(shù)多采用國標(biāo)法（gb-4789.35-2010），該方法主要用于含活性乳酸菌食品乳酸菌計數(shù)，文獻報道辛若竹等人采用直接顯微鏡計數(shù)法測定乳酸菌總數(shù)（辛若竹，劉洋來，魏昆民.活性酸乳中乳酸菌的直接鏡檢計數(shù)法[j].中國衛(wèi)生檢驗雜志，200717（3）：476-477）。但該方法采用稀釋涂片的方式實現(xiàn)了乳酸菌的技術(shù)，此方法的缺陷在于籠統(tǒng)的計數(shù)不能對乳酸菌死菌進行識別，另外不同的取樣和稀釋倍數(shù)同樣存在誤差，采用顯微鏡直接計數(shù)，在一定程度上無法正確反映乳酸菌活性菌株數(shù)量，這樣會給結(jié)果的準確性帶來一定的影響。
酸乳風(fēng)味的形成與乳酸菌發(fā)酵過程代謝的多種物質(zhì)有關(guān)，而這些物質(zhì)的產(chǎn)生與發(fā)酵速度等活力指標(biāo)有密切關(guān)系。乳酸菌的活力可由多種參數(shù)確定，如細胞生長情況，細胞干重和光密度（od值）等。由于乳液不透明，不能直接測od值，可用naoh和edta處理使其澄清后再測。較簡便的活力測定包括凝乳時間，產(chǎn)酸和活菌數(shù)量等指標(biāo)的檢測。
發(fā)酵乳制品質(zhì)量的好壞主要取決于發(fā)酵劑的品質(zhì)類型及活性。本專利的為乳酸菌發(fā)酵劑活性提供了乳酸菌活性快速檢驗的方法，可有效保證發(fā)酵乳制品產(chǎn)品質(zhì)量均一穩(wěn)定。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的是根據(jù)目前乳品生產(chǎn)所用發(fā)酵劑缺少快速檢驗發(fā)酵劑菌種活性方法的不足，提供一種快速檢測乳品發(fā)酵劑活性檢測方法。
實現(xiàn)以上目的的技術(shù)方案如下：
1、培養(yǎng)基的制備
番茄汁50ml，酵母浸粉5g，牛肉膏10g，乳糖20g葡萄糖2g，k2hpo42g，吐溫801g，乙酸鈉5g，硫酸錳0.2g，硫酸鎂0.5g，水加至.1000ml，用1mol/l的氫氧化鈉調(diào)節(jié)ph至6.8，上述培養(yǎng)基經(jīng)121℃，20min殺菌。
2、脫脂乳培養(yǎng)基
脫脂乳：將牛乳間接或直接加熱煮沸20-30min，冷卻過夜，脂肪即可上浮，用吸管或虹吸法將底層乳吸出，棄上層乳脂，即為脫脂乳。于115°c高壓蒸汽滅菌20-30min，供菌種保藏、活化與制備發(fā)酵劑使用。
脫脂乳培養(yǎng)基：鮮乳煮沸后裝入三角燒杯中，100℃，30min，然后自然冷卻。待出現(xiàn)脂肪層后，取下層乳液分裝于試管中，加量于試管的1/3處，包裝好，利用間歇滅菌法（106℃，30min滅菌，每天一次，連續(xù)3d）滅菌，冷卻，低溫保存，備用。
3、發(fā)酵劑復(fù)水：凍干乳酸菌發(fā)酵劑先于10ml葡萄糖水中4℃下復(fù)水30min。
4、無菌檢驗方法：將菌種接種到液體mrs中，每隔一周傳代一次。每次使用前，將菌種接入無菌脫脂乳中，于42℃培養(yǎng)至凝乳，記下時間和ph。如果這些指標(biāo)有明顯的變化，則不能使用，表明菌種已退化或污染。
5、檢測方法：
①酸度：采用0.1mol/l氫氧化鈉溶液中和滴定法；
②乳酸菌計數(shù)：用乳品發(fā)酵劑菌染液做為稀釋液，稀釋倍數(shù)為25倍，顯微鏡下計數(shù)；
③菌體存活率測定：把干燥菌粉還原為原液濃度后進行測定，菌體存活率（%）=干燥后乳酸菌活菌數(shù)/干燥前乳酸菌活菌數(shù)×100%；
④乳酸菌發(fā)酵劑活性測定：把凍干菌粉以0.01%的比例接入無菌脫脂奶中，37.8℃恒溫培養(yǎng)3.5h，測定酸度，如果酸度達到ph4.5，則認定活性較好，并以酸度的數(shù)值來表示。
6、一種乳品發(fā)酵劑活性快速檢測方法，包括以下實施步驟：
①酸度的測定，按照常規(guī)方法將乳品發(fā)酵劑按照5%的接種量接種滅菌牛奶中，42℃培養(yǎng)5h，測定此時培養(yǎng)基ph。
②乳酸菌計數(shù)，將乳品發(fā)酵劑按照5%接種量接種到脫脂乳培養(yǎng)基中，42℃培養(yǎng)8h，采用mrs培養(yǎng)基平板計數(shù)和顯微鏡計數(shù)方法，對發(fā)酵劑乳酸菌菌數(shù)進行計數(shù)。
③菌體存活率測定，把干燥菌粉還原為原液濃度后進行測定，菌體存活率（%）=干燥后乳酸菌活菌數(shù)/干燥前乳酸菌活菌數(shù)×100%；
7、與現(xiàn)有的酸菌活性快速檢驗的方法相比，本發(fā)明提供了一種快速檢測乳酸菌活性的方法，可以快速準備的判斷所用乳品發(fā)酵劑的活性，具有周期短、操作簡便等優(yōu)點，特別適合工廠化乳品生產(chǎn)發(fā)酵劑活性的檢測。
具體實施方式
以下對乳品乳酸菌活性快速檢測方法進行進一步描述。
、主要儀器設(shè)備：
超凈工作臺（sw-cj-1fd）、顯微鏡（xsp-bm12）、滅菌鍋（yxq-ls）、厭氧培養(yǎng)箱（dhp-9052）
2、材料與試劑
材料：被檢測材料為公司發(fā)酵乳生產(chǎn)發(fā)酵劑
試劑：
酵母浸粉，電子天平稱取5g；
牛肉膏，電子天平稱取10g；
乳糖，電子天平稱取20g；
葡萄糖，電子天平稱取2g；
k2hpo4，電子天平稱取2g；
吐溫80，電子天平稱取1g；
乙酸鈉，電子天平稱取5g；
硫酸錳，電子天平稱取0.2g；
硫酸鎂，電子天平稱取0.5g；
氫氧化鈉，配成濃度為1mol/l氫氧化鈉溶液。
香柏油
番茄汁做法：
（1）將番茄洗凈，瀝干表面水分，去蒂切成塊；
（2）用豆?jié){機將切好的番茄打成漿；
（3）將干凈紗布鋪在一個1000ml燒杯上，把切好的番茄漿倒進去
（4）將紗布四周提起來，用力將汁水?dāng)D到碗里即可。
、培養(yǎng)基的制備
按照培養(yǎng)基準確稱取各成分，定容至1000ml，用1mol/l的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)ph至6.8，121℃滅菌20min。
脫脂乳培養(yǎng)基：
脫脂乳培養(yǎng)基：鮮乳煮沸后裝入三角燒杯中，100℃，30min，然后自然冷卻。待出現(xiàn)脂肪層后，取下層乳液分裝于試管中，加量于試管的1/3處，包裝好，利用間歇滅菌法（106℃，30min滅菌，每天一次，連續(xù)3d）滅菌，冷卻，低溫保存，備用。
、乳酸菌發(fā)酵培養(yǎng)
將生產(chǎn)所用的乳品發(fā)酵劑，按照5%接種量接種到改良的mrs培養(yǎng)基和脫脂乳培養(yǎng)基中，42℃，酸度測定培養(yǎng)5h；乳酸菌計數(shù)培養(yǎng)8h。
、酸度測定
（1）觀察：觀察并記錄的凝乳時間。
（2）酸度采用naoh滴定法，測定發(fā)酵乳液的滴定酸度。
、鏡檢與計數(shù)
（1）編號取五支無菌水試管，分別用記號筆標(biāo)明10-1、10-2、10-3、10-4、10-5。
（2）稀釋將酸奶樣品攪拌均勻，用無菌移液管吸取樣品25ml，移入含有225ml無菌水的三角瓶中，在漩渦混合器上充分振搖，使樣品分散均勻，獲得10-1的樣品稀釋液，然后根據(jù)對樣品含菌量的估計，將樣品稀釋至適當(dāng)稀釋度。
（3）倒平板選用2～3個適宜濃度的稀釋液，分別吸取1ml注入平皿內(nèi)，然后倒入事先溶化并冷卻至45℃左右的mrs固體培養(yǎng)基，迅速轉(zhuǎn)動平皿使之混合均勻，待冷卻凝固后倒置，于40℃培養(yǎng)48h。
（4）分離無菌操作，從培養(yǎng)好的固體平皿中分別挑取5個單菌落接種于液體mrs培養(yǎng)基中，置40℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
（5）鏡檢通過鏡檢，確定所分離的乳酸菌是乳桿菌還是鏈球菌。保加利亞乳桿菌呈桿狀，單桿、雙桿或長絲狀；嗜熱鏈球菌呈球狀，成對、短鏈或長鏈狀。
（6）接種按1%的接種量，將mrs液體培養(yǎng)物接種于已滅菌的復(fù)原脫脂乳中，另分別接種具有較高活力的保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌作為對照。培養(yǎng)溫度為保加利亞乳桿菌40℃，嗜熱鏈球菌45℃。
、觀察與測定
計數(shù)：采用傾注平板法，測定活菌數(shù)量。
（1）測定視野半徑：向鏡臺測微尺刻度中心滴加香柏油，油鏡觀察，先使一端與左側(cè)視野圓弧相切，再向右查格數(shù)乘以鏡臺測微尺每格長度0.01mm，即為油鏡視野圓的直徑，除以2為半徑。
（2）制備樣品稀釋液：1：10
（3）涂片：用微量移液器取上述稀釋菌液10μl（0.01ml）滴加于載玻片1cm2方格內(nèi)，涂均，注意液體不可外流出方格，涂面要薄而均勻。自然干燥后，火焰固定。
（4）染色：革蘭氏染色或1％甲苯胺藍染色1min，水洗后用2％冰醋酸脫色1～2s，牛奶基質(zhì)無色，乳酸菌或其他菌體藍色。
（5）鏡檢與計數(shù)：油鏡觀察，計數(shù)任意10個視野中的菌數(shù)，求平均值，公式計算。
式中：r為顯微鏡油鏡視野圓的半徑（mm），y為稀釋倍數(shù)，并將1cm2的涂抹面積換算為100mm2，0.01ml折算為每毫升的菌數(shù)，故最終還需乘以104。