本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種干擾基因及其應(yīng)用。尤其是涉及一種干擾基因，含有干擾基因的表達(dá)載體、宿主細(xì)胞，以及生產(chǎn)生物柴油的方法。

背景技術(shù)：

生物柴油備受關(guān)注，它可以作為一個化石替代品，具有可持續(xù)生產(chǎn)和環(huán)保等特性。生物能源應(yīng)用歷史已經(jīng)超過了50年，生物柴油主要來源于植物，例如菜籽，大豆，向日葵等，其原理是由三酰甘油通過酯交換反應(yīng)制成，1mol三酰甘油和3mol乙醇反應(yīng)，可以產(chǎn)生1mol的甘油和甲酯。但是，這種生產(chǎn)效率普遍不高，而且占地面積大。

與傳統(tǒng)的生物柴油相比，微藻具有以下優(yōu)點：第一，微藻的生長速度快，其生物量可以在24小時增加一倍；第二，含油量高，某些微藻的含油量可以達(dá)到干重的50％-60％；第三，微藻的產(chǎn)油效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)快于動物和植物；第四，微藻能夠進(jìn)行光合作用，參與到生態(tài)系統(tǒng)的循環(huán)；最后，微藻種類多，適應(yīng)性非常強(qiáng)，某些微藻可以在極其惡劣的環(huán)境下面進(jìn)行生存，培養(yǎng)條件簡單。

作為產(chǎn)油微藻的代表藻種之一，微擬球藻屬于產(chǎn)油藻，相對其他微藻來說，其產(chǎn)油量相對較高，生長速度快。然而，微擬球藻的產(chǎn)油性能仍不能滿足工業(yè)需求。而且，植物的細(xì)胞壁很厚，提取微藻內(nèi)的油脂前需要去除其細(xì)胞壁，這個環(huán)節(jié)會大大提高生產(chǎn)成本，同時也會造成細(xì)胞的死亡，因此對于工業(yè)應(yīng)用來說，是很不利的。雖然某些非細(xì)胞破壞的油脂獲取方法已經(jīng)成功，但是，這還是不能滿足微藻的工業(yè)產(chǎn)油需求。因此，研發(fā)出一種既能高產(chǎn)油又能胞外分泌油脂的工業(yè)型微藻，用于解決現(xiàn)有技術(shù)中微藻產(chǎn)油效率低、成本高、工序繁多，不能滿足工業(yè)需求的技術(shù)缺陷，成為了本領(lǐng)域技術(shù)人員亟待解決的問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明提供了一種干擾基因及其應(yīng)用，用于解決現(xiàn)有技術(shù)中微藻產(chǎn)油效率低、成本高、工序繁多，不能滿足工業(yè)需求的技術(shù)缺陷。

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)對微擬球藻的udp-glucosedehydrogenase基因(以下簡稱ugdh)進(jìn)行rna干擾，能使其細(xì)胞壁中聚多糖顯著減少，導(dǎo)致細(xì)胞壁變薄，同時使得更多的碳流向三酰甘油合成途徑。

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)ugdh基因表達(dá)的蛋白含有471個氨基酸，使用smart網(wǎng)站和ncbi網(wǎng)站對假定的ugdh基因的蛋白序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其ugdh蛋白含有3個結(jié)構(gòu)域：udpg_mgdp_dh_n結(jié)構(gòu)域，udpg_mgdp_dh結(jié)構(gòu)域和udpg_mgdp_dh_c結(jié)構(gòu)域(http://smart.embl-heidelberg.de/)，在udpg_mgdp_dh_n結(jié)構(gòu)域和udpg_mgdp_dh結(jié)構(gòu)域之間存在一個蘋果酸酶和nad的綁定位點(圖1a)。

利用mega6軟件對微擬球藻ugdh蛋白進(jìn)行系統(tǒng)樹構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)n.oceanica和n.gaditana具有非常高的同源性。

本發(fā)明提供了一種ugdh基因的干擾基因，依次包括外顯子1、內(nèi)含子及外顯子2；

所述外顯子1具有

(i)如seqidno.1所示的核苷酸序列；或

(ii)seqidno.1所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個或多個核苷酸序列獲得的核苷酸序列，且與seqidno.1所示的核苷酸序列至少有85％同源性的核苷酸序列。

作為優(yōu)選，所述外顯子2與外顯子1的部分序列為反向互補(bǔ)序列。

作為優(yōu)選，所述外顯子2具有如seqidno.3所示的核苷酸序列；或seqidno.3所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個或多個核苷酸序列獲得的核苷酸序列，且與seqidno.3所示的核苷酸序列至少有85％同源性的核苷酸序列。

所述外顯子1及外顯子2之間含有內(nèi)含子。

作為優(yōu)選，所述內(nèi)含子具有如seqidno.2所示的核苷酸序列，或seqidno.2所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個或多個核苷酸序列獲得的核苷酸序列，且與seqidno.2所示的核苷酸序列至少有85％同源性的核苷酸序列。

本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解所述取代、缺失或添加一個或多個核苷酸中的多個包括但不限于2個、3個或4個。

本發(fā)明還提供了上述干擾基因在干擾udp-glucosedehydrogenase基因的表達(dá)中的應(yīng)用。

進(jìn)一步，本發(fā)明還提供了一種表達(dá)載體，含有上述的干擾基因。

本發(fā)明還提供了一種宿主細(xì)胞，含有本發(fā)明所述的表達(dá)載體。

作為優(yōu)選，所述宿主細(xì)胞為微藻，如微擬球藻、小球藻等。在一些具體實施方案中，所述宿主細(xì)胞為微擬球藻。

本發(fā)明還提供了所述宿主細(xì)胞在提高脂質(zhì)含量和促進(jìn)脂質(zhì)分泌中的應(yīng)用。

進(jìn)一步，本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)生物柴油的方法，將所述宿主細(xì)胞在光生物反應(yīng)器大量繁殖，在宿主細(xì)胞達(dá)到平臺期時收集脂質(zhì)，分離純化獲得生物柴油。

作為優(yōu)選，所述宿主細(xì)胞為微藻。更優(yōu)選為微擬球藻。

微藻通過光合作用固定碳元素，再通過誘導(dǎo)將所述碳元素轉(zhuǎn)化為脂質(zhì)

本發(fā)明提供了一種干擾基因及其應(yīng)用，所述干擾基因沒有在任何文獻(xiàn)報道，在genbank等公開數(shù)據(jù)庫也沒有任何注釋。本發(fā)明從微擬球藻中克隆并構(gòu)建了一種干擾基因，所述基因包括外顯子1、內(nèi)含子及外顯子2；所述外顯子1具有(i)如seqidno.1所示的核苷酸序列；或(ii)seqidno.1所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個或多個核苷酸序列獲得的核苷酸序列，且與seqidno.1所示的核苷酸序列至少有85％同源性的核苷酸序列。該干擾基因能干擾udp-glucosedehydrogenase基因的表達(dá)。將該干擾基因構(gòu)建到表達(dá)載體中轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。在藻細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄后，外顯子1和內(nèi)含子作為發(fā)夾前臂和莖環(huán)，外顯子2為發(fā)夾的后臂，會形成莖環(huán)發(fā)夾結(jié)構(gòu)(圖1b)，在dicer酶的作用下，切割形成sirna，sirna會與靶基因互補(bǔ)，干擾udp-glucosedehydrogenase基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)通過所述基因干擾udp-glucosedehydrogenase表達(dá)后，微擬球藻能高效產(chǎn)油且能胞外分泌脂質(zhì)，得到高產(chǎn)油脂并能進(jìn)行胞外分泌油的藻株，解決了現(xiàn)有技術(shù)中微藻產(chǎn)油效率低、成本高、工序繁多，不能滿足工業(yè)需求的技術(shù)問題。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。

圖1是ugdh的分子預(yù)測分析(a)ugdh蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測分析，(b)ugdh發(fā)夾結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2是ugdh轉(zhuǎn)化藻的測序比對結(jié)果圖；

圖3是ugdh轉(zhuǎn)化藻分子驗證膠圖，m為marker，右欄為轉(zhuǎn)化藻；

圖4是ugdh轉(zhuǎn)化藻和野生型藻qpcr分析，**表示(p<0.01)，wt是對照藻，ugdh1和ugdh2是轉(zhuǎn)化藻；

圖5是ugdh轉(zhuǎn)化藻和野生型藻的光合作用和生長曲線(a)ugdh轉(zhuǎn)化藻和野生型藻的光合作用，(b)ugdh轉(zhuǎn)化藻和野生型藻的生長曲線，其中，wt是對照藻，ugdh1和ugdh2是轉(zhuǎn)化藻，wt是對照藻，ugdh1和ugdh2是轉(zhuǎn)化藻；

圖6是ugdh轉(zhuǎn)化藻和野生型藻激光掃描共聚焦熒光顯微鏡結(jié)果圖，其中，(a)野生型藻，(b)ugdh轉(zhuǎn)化藻，bar＝5μm；

圖7是ugdh轉(zhuǎn)化藻和野生型藻透射電鏡圖，其中，(a)野生型藻，(b)ugdh轉(zhuǎn)化藻.bar＝5μm；

圖8是ugdh轉(zhuǎn)化藻和野生型藻總糖含量測定，wt是對照藻，ugdh1和ugdh2是轉(zhuǎn)化藻；

圖9是ugdh轉(zhuǎn)化藻和野生型藻中性脂含量測定，wt是對照藻，ugdh1和ugdh2是轉(zhuǎn)化藻；

圖10是ugdh轉(zhuǎn)化藻和野生型藻胞內(nèi)胞外甘油總酯測定，其中，(a)細(xì)胞外甘油總酯產(chǎn)量測定分析，(b)細(xì)胞內(nèi)甘油總酯產(chǎn)量測定分析，wt是對照藻，ugdh1和ugdh2是轉(zhuǎn)化藻；

圖11是ugdh轉(zhuǎn)化藻和野生型藻胞內(nèi)胞外脂肪酸總成分測定，其中，(a)細(xì)胞外脂肪酸總成分測定分析，(b)細(xì)胞內(nèi)脂肪酸總成分測定分析，wt是對照藻，ugdh1和ugdh2是轉(zhuǎn)化藻；

圖12是ugdh轉(zhuǎn)化藻和野生型藻胞內(nèi)胞外脂肪酸成分測定，其中，(a)細(xì)胞外脂肪酸總成分測定分析，(b)細(xì)胞內(nèi)脂肪酸總成分測定分析，wt是對照藻，ugdh1和ugdh2是轉(zhuǎn)化藻；

圖13是ugdh轉(zhuǎn)化藻全局通路圖。

具體實施方式

本發(fā)明提供了一種干擾基因及其應(yīng)用，用于解決現(xiàn)有技術(shù)中，微藻產(chǎn)油效率低、成本高、工序繁多，不能滿足工業(yè)需求的技術(shù)缺陷。

下面將對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

為了更詳細(xì)說明本發(fā)明，下面結(jié)合實施例對本發(fā)明提供的一種，進(jìn)行具體地描述。

實施例1ugdh干擾基因的構(gòu)建

提取微擬球藻的基因組dna，采用美基公司的植物dna提取試劑盒進(jìn)行。引物由上海生工生物工程有限公司合成，經(jīng)page方法純化，使用時稀釋到20μm。采用引物對seqidno.4，seqidno.5和引物對seqidno.6，seqidno.7(表1)，反應(yīng)體系如表2和表3，以微擬球藻的基因組為模板，分別擴(kuò)增得到發(fā)夾片段1(外顯子1和內(nèi)含子片段)和發(fā)夾片段2(外顯子2)(圖1b)。

把上述克隆發(fā)夾片段1和發(fā)夾片段2通過采用clonexpressmultisonestepcloning試劑盒(vazymebiotechco.,ltd，nanjing)同源重組的方法連接到含有博來霉素抗性表達(dá)盒的載體，含有博來霉素抗性表達(dá)盒的載體，得到含有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的重組干擾載體，標(biāo)記為pna03-udghi。

表1pcr引物

表2發(fā)夾片段1的pcr反應(yīng)體系(20μl)

表3發(fā)夾片段2的pcr反應(yīng)體系(20μl)

實施例2微擬球藻轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化藻的篩選

參考li等(2016)的電擊方法把重組載體整合到微擬球藻基因組中，電擊完成后，將藻細(xì)胞轉(zhuǎn)移到5ml的f/2無硅培養(yǎng)基，黑暗培養(yǎng)24h，隨后，將5ml藻細(xì)胞離心10min(4400rpm)收集，并均勻涂到含有5μg/ml博來霉素的平板內(nèi)。通過4-5次博來霉素的篩選獲得具有抗性的轉(zhuǎn)化藻，篩選出兩株具有抗性的ugdh轉(zhuǎn)化藻，命名為ugdh1和ugdh2轉(zhuǎn)化藻。

實施例3轉(zhuǎn)化藻的驗證

驗證步驟如下：把100ml轉(zhuǎn)化藻和100ml野生型微擬球藻4400rpm離心10min收集，用美基公司的植物dna提取試劑盒提取基因組dna，用引物seqidno.8和引物seqidno.9進(jìn)行pcr，并進(jìn)行切膠回收測序，如圖2所示，測序結(jié)果證明轉(zhuǎn)化藻基因組內(nèi)含有所述干擾基因。

如圖3所示，電泳膠圖顯示轉(zhuǎn)化藻在大概473bp處有條帶。

實施例4驗證發(fā)夾結(jié)構(gòu)干擾效率

本發(fā)明對轉(zhuǎn)化藻的ugdh基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行熒光實時定量分析。

real-timeqpcr就是在pcr擴(kuò)增過程中，通過熒光信號，對pcr進(jìn)程進(jìn)行實時檢測。由于在pcr擴(kuò)增的指數(shù)時期，模板的ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，所以成為定量的依據(jù)。real-timeqpcr由于其操作簡便，靈敏度高，重復(fù)性好等優(yōu)點發(fā)展非常迅速。對rt-pcr產(chǎn)生的結(jié)果，分析時采用2^-ct法，即按照如下公式進(jìn)行計算：

1.δct(目的基因ct—內(nèi)參ct)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差；

2.δδct(待測樣品中目的基因δct—參照樣品中目的基因δct)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差；

3.相對表達(dá)量(2^-δδct)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

熒光實時定量分析實驗步驟如下：野生型藻和轉(zhuǎn)化藻放置新的培養(yǎng)基中且藻密度控制在1×10⁶個/ml，取第十天的微藻，微藻的數(shù)量控制在3×10⁸個，4400rpm離心10min。采用rnaisolationkit(takara)對微藻的總rna進(jìn)行提取，并使用theprimescript^tmrtreagentkitwithgdnaeraser(takara)試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄所用的引物為隨機(jī)引物。針對ugdh基因的特異引物對seqidno.10和seqidno.11；內(nèi)參為β-tublin，其引物為seqidno.12和seqidno.13。用于實時定量擴(kuò)增，所用pcrsupermix(invitrogen,usa)，實驗所用的檢測設(shè)備為abiprism7500sequencedetectionsystem(appliedbiosystems,美國)。結(jié)果如圖4所示。

由此可見，該啟動子在微擬球藻中能夠顯著地抑制ugdh基因表達(dá)，與野生型藻相比，ugdh1轉(zhuǎn)化藻和ugdh2的轉(zhuǎn)錄水平都降低80％，表明pna03-ugdh的發(fā)夾結(jié)構(gòu)成功干擾了ugdh基因的表達(dá)。

實施例5轉(zhuǎn)化藻株的生長特征和光合作用分析

光合作用測定的步驟如下：采用fv/fm(可變/最大熒光之比)的比值來測定光合作用效率，轉(zhuǎn)化藻和野生型藻黑暗處理40min后，使用td-700fluorometer(turnerdesign,美國)測定。

如圖5a所示，ugdh的兩株轉(zhuǎn)化藻和野生型的fv/fm基本一樣，說明了對ugdh基因的rna干擾，并不影響其光合效率。

生長曲線的測定步驟如下，對微擬球藻進(jìn)行取樣。利用倒置的顯微鏡和血球計數(shù)板進(jìn)行計算。微擬球藻的計算公式如下：celldensity＝(n/80)×400×10⁴，其中celldensity表示微擬球藻的藻細(xì)胞密度，n表示細(xì)胞總數(shù)(80個方格)。測定了生長曲線，評估轉(zhuǎn)基因藻的生物量和生長速度。

結(jié)果如圖5b所示，ugdh1轉(zhuǎn)化藻，ugdh2轉(zhuǎn)化藻和野生型藻生長規(guī)律基本一致，因此，對ugdh基因的干擾，并不會抑制微藻的生長。此外，我們對轉(zhuǎn)化藻和野生型藻的光合效率進(jìn)行分析，來評估光合作用。

實施例6轉(zhuǎn)化藻株中性脂在激光掃描共聚焦熒光顯微鏡觀察

驗證的步驟：如下熒光共聚焦的分析過程如下：取300μl的藻液，加入0.5g/ml的甘油和3.75μl尼羅紅(0.3μg/ml)，混勻后，常溫下黑暗孵育5min，進(jìn)行尼羅紅染色后，使用激光共聚焦分析儀zeisslsm510meta(zeiss,germany)進(jìn)行分析。激發(fā)波長為488nm，發(fā)射波長為505-550nm。

為了進(jìn)一步更直觀地觀察中性脂的含量，對微擬球藻進(jìn)行激光掃描共聚焦熒光顯微鏡觀察，結(jié)果如圖6所示，在野生型藻中，并沒有發(fā)現(xiàn)有油體分泌出來，而在ugdh轉(zhuǎn)化藻中，可以看到非常多的油滴在細(xì)胞的周圍，其細(xì)胞所含的油也明顯比野生型多。因此，干擾udgh基因，可能會導(dǎo)致細(xì)胞壁變薄，致使油滴分泌到細(xì)胞外，同時可能也會促使更多的碳流向三酰甘油(tag)的合成途徑。

實施例7透射電鏡的分析

為了進(jìn)一步研究干擾ugdh對微擬球藻細(xì)胞壁的影響，我們進(jìn)行透射電鏡分析，驗證的步驟如下：在4℃，4400rpm條件下離心10分鐘，分別收集試驗組和對照組的藻細(xì)胞。取上清液后的藻細(xì)胞樣品用1×pbs緩沖液清洗3次，最后5000rpm離心3分鐘收集藻細(xì)胞。收集的藻細(xì)胞用溶于ph7.2的0.1m的nah2po4緩沖液中的2.5％(v/v)戊二醛及2％(w/v)多聚甲醛進(jìn)行固定，并用真空泵在4℃條件下抽真空30分鐘。之后將固定液離心并去掉上清液，重新用固定液在4℃條件下固定12h。固定完成后離心去除固定液并用0.1mnah2po4緩沖液(ph7.2)清洗4次(15分鐘和30分鐘各兩次)。之后樣品用1％(w/v)四氧化鋨在4℃下固定3h，完成后用0.1m的nah2po4緩沖液(ph7.2)清洗4次(15分鐘和30分鐘各兩次)。完成后用梯度濃度的乙醇(30％，50％，70％，80％，90％v/v)對樣品進(jìn)行脫水，每隔10分鐘更換一種濃度，最后用100％的乙醇沖洗兩次(每次30分鐘)。之后樣品分別重懸于環(huán)氧丙烷(2次，每次30分鐘)和1:1(v/v)環(huán)氧丙烷：環(huán)氧樹脂(1次，30分鐘)中進(jìn)行細(xì)胞滲透。完成后藻細(xì)胞固定于100％w/v環(huán)氧樹脂中反應(yīng)24h，且在70℃中包埋的時間不少于8h。藻細(xì)胞完成包埋后利用8800ultratomeiii進(jìn)行超微切片，并用乙酸雙氧鈾及檸檬酸鉛對切片進(jìn)行染色。處理后的切片利用tecnai-10透射電子顯微鏡進(jìn)行觀察。

結(jié)果如圖7所示，在野生型微擬球藻中，細(xì)胞壁渾厚有序(圖7a)，而在ugdh轉(zhuǎn)基因藻中，細(xì)胞壁變細(xì)，形狀無規(guī)則。因此，在微擬球藻中，干擾ugdh基因的表達(dá)，會干擾細(xì)胞壁的生成(圖7b)。

實施例8總糖含量分析

為了更進(jìn)一步說明ugdh對細(xì)胞壁影響，我們進(jìn)行總糖含量定量，總糖含量的測定過程如下：取藻液50ml，采用4400rpm，10min來收集藻。準(zhǔn)備1.5mlep管，并稱量重量，將藻轉(zhuǎn)移到1.5ml的ep管內(nèi)。將藻置于凍干儀器，凍干8h后，稱量其重量，通過計算得到藻的干重。將凍干好的藻粉，用10ml去離子水重新混勻懸浮，將5ml藻液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，向新的離心管中加入3ml的5％的苯酚溶液(w/v)，混勻后，加入15ml的濃硫酸，混勻，常溫靜置10min，隨后，置于30度孵育20min后，取100ul的轉(zhuǎn)移到96孔酶標(biāo)板，放到酶標(biāo)儀中讀數(shù)，參數(shù)為483nm。

如圖8所示，在ugdh1和ugdh2這兩株轉(zhuǎn)化藻中，其總糖都顯著下調(diào)了50％。因此，結(jié)果表明了對ugdh基因進(jìn)行干擾，會顯著下調(diào)糖的含量。

實施例9轉(zhuǎn)化藻株中性脂分析

利用尼羅紅染色的方法，采用流式細(xì)胞儀來確定中性脂含量。實驗步驟如下：取300ul的藻液，加入0.5g/ml的甘油和3.75μl尼羅紅(0.3μg/ml)，混勻后，常溫下黑暗孵育5min，隨后使用流式細(xì)胞儀(beckmangallios)進(jìn)行測定。激發(fā)波長為530nm，發(fā)射波長為592nm。

如圖9所示，ugdh兩株轉(zhuǎn)化藻的單細(xì)胞中性脂含量在各個生長周期都顯著大于野生型藻，在11天，在ugdh2轉(zhuǎn)化藻的單細(xì)胞中性脂含量比野生型藻增加100％。因此，干擾udgh基因，會導(dǎo)致細(xì)胞壁變薄，使油滴分泌到細(xì)胞外，同時也會促使更多的碳流向甘油總酯的合成。

實施例10甘油總脂和脂肪酸成分分析

采用gc-ms方法對微藻胞內(nèi)和胞外進(jìn)行脂肪酸定量和脂肪酸組分測定。胞外脂肪酸測定方法如下，取25ml藻液，4400rpm，10min，去掉沉淀，將上清轉(zhuǎn)移到新的50ml離心管，加入koh-ch3oh，超聲波破碎，上清和hcl-甲醇混勻后75度10min分層，用正己烷萃取，加入c19內(nèi)標(biāo)，由氮吹儀吹干。用于脂肪酸干重和組分的分析。

如圖10所示，ugdh轉(zhuǎn)化藻胞外的甘油總酯的產(chǎn)量比野生型增加了6倍，提高了600％。

在圖11可知，ugdh轉(zhuǎn)化藻胞外的sfa(飽和脂肪酸)下調(diào)，而pufa(多不飽和脂肪)上調(diào)，mufa(單不飽和脂肪酸)基本沒有變化，在ugdh2轉(zhuǎn)化藻，sfa減少了51％，而pufa增加了6倍。ugdh轉(zhuǎn)化藻胞內(nèi)的sfa上調(diào)25％，而pufa下調(diào)(圖11)。因此，分泌到胞外的脂質(zhì)為pufa。

如圖12所示，而ugdh2轉(zhuǎn)化藻的胞外二十碳五烯酸(epa，eicosapentaenoicacid，以下簡稱c20:5)，c20：5增加了5.1倍，ugdh轉(zhuǎn)化藻的胞內(nèi)c20：5減少40％，說明了c20:5更容易分泌到細(xì)胞外。因此，干擾udgh基因，會導(dǎo)致細(xì)胞壁變薄，致使油滴分泌到細(xì)胞外，同時也會促使更多的碳流向甘油總酯的合成，而多不飽和脂肪酸更容易分泌到細(xì)胞外，c20：5的脂肪酸更容易分泌到細(xì)胞外。

綜上所述，如圖13可知，本發(fā)明的干擾基因干擾ugdh的表達(dá)，一方面提高胞內(nèi)脂質(zhì)合成，還促進(jìn)胞內(nèi)脂質(zhì)往胞外分泌。其中，所述干擾基因沒有在任何文獻(xiàn)報道，在genbank等公開數(shù)據(jù)庫也沒有任何注釋。本發(fā)明從微擬球藻中克隆并構(gòu)建了一種干擾基因，所述基因包括外顯子1、內(nèi)含子及外顯子2；所述外顯子1具有(i)如seqidno.1所示的核苷酸序列；或(ii)seqidno.1所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個或多個核苷酸序列獲得的核苷酸序列，且與seqidno.1所示的核苷酸序列至少有85％同源性的核苷酸序列；所述外顯子2有(i)如seqidno.3所示的核苷酸序列；或(ii)seqidno.3所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個或多個核苷酸序列獲得的核苷酸序列，且與seqidno.3所示的核苷酸序列至少有85％同源性的核苷酸序列。將該干擾基因構(gòu)建到表達(dá)載體中轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。在藻細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄后，外顯子1和內(nèi)含子作為發(fā)夾前臂和莖環(huán)，外顯子2為發(fā)夾的后臂，會形成莖環(huán)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，在dicer酶的作用下，切割形成sirna，sirna會與靶基因互補(bǔ)，干擾udp-glucosedehydrogenase基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)通過所述基因干擾udp-glucosedehydrogenase表達(dá)后，微擬球藻能高效產(chǎn)油且能胞外分泌脂質(zhì)，得到高產(chǎn)油脂并能進(jìn)行胞外分泌油的藻株，解決了現(xiàn)有技術(shù)中微藻產(chǎn)油效率低、成本高、工序繁多，不能滿足工業(yè)需求的技術(shù)問題。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。

sequencelisting

110暨南大學(xué)

120一種干擾基因及其應(yīng)用

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