本發(fā)明屬藥物化學(xué)領(lǐng)域，涉及雜原子螺環(huán)化合物，具體涉及一種含薁結(jié)構(gòu)的新型吲哚螺環(huán)類化合物、合成及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

許多天然產(chǎn)物中都含有螺環(huán)結(jié)構(gòu)，其中雜原子螺環(huán)化合物具有抗腫瘤、抗焦慮、抗菌、降壓及鎮(zhèn)痛等廣泛的生物活性，由于作用機(jī)理獨(dú)特，且不易產(chǎn)生抗藥性,為臨床藥物的研發(fā)開(kāi)辟了新領(lǐng)域((a)Onishhi,T.；Sebahar,P.R.；Williams,R.M.Org.Lett.2003,17,3135；(b)Cremer,N.S.；Hamamouch,N.C.J.Am.Chem.Soc.2005,127,10130；(c)Zhou,B.；Yang,Y.X.；Shi,J.J.；Luo,Z.；Li,y.C.J.Org.Chem.2013,78,2897.)。

吲哚螺環(huán)化合物是一類重要的雜原子螺環(huán)化合物，廣泛地存在于許多具有生理及藥理活性的天然生物堿中，已成為許多藥物中不可或缺的結(jié)構(gòu)單元((a)Pavlovska1,T.L.；Redkin,R.G.；Lipson,V.V.；Atamanuk,D.V.Mol Divers,2016,20,299；(b)Shngh,G.S.；Desta,Z.Y.Chem.Rev.2012,112,6104.)。研究表明，吲哚螺環(huán)類化合物是人體內(nèi)一種重要的內(nèi)源性活性因子，大量存在于神經(jīng)系統(tǒng)中，可以將體內(nèi)的細(xì)胞單胺氧化酶維持在正常水平，從而有效地防止帕金森癥、驚厥、癲癇等神經(jīng)退化性疾病的發(fā)生((a)Glover,V.；Halket,J.；Watkins,P.J.J.Neurochem.1988,51,656；(b)Finberg,J.P.；Wang,J.；Goldstein,D.S.J.Neurochem.1995,65,1213.)。同時(shí)，該類化合物還具有很好的抗腫瘤、抗過(guò)敏、抗結(jié)核及抗血栓等生物活性((a)Yu,B.；Yu,D.Q.；Liu,H.M.Eur.J.Med.Chem.2015,97,673；(b)Cui,C.B.；Kakeya,H.；Osada,H.Tetrahedron,1996,52,12651.),因而在生物、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有非常重要的地位和非常廣泛的應(yīng)用前景。對(duì)該類化合物的開(kāi)發(fā)與合成已經(jīng)引起了藥物學(xué)家和化學(xué)家的關(guān)注((a)Zhu,S.L.；Jia,S.J.；Zhang,Y.Tetrahedron,2007,63,9365；(b)Chen,X.；Wei,Q.；Luo,S.；Xiao,H.；Gong,L.J.Am.Chem.Soc.2009,131,13819；(c)Tsubouchi,H.；Sasaki,H.；Itotani,M.；Haraguchi,Y.；Miyamura,S.；Matsumoto,M.；Hashizume,H.；Tomishige,T.；Kawasaki,K.；Sumida,T.；Hasegawa,T.；Tanaka,K.；Takemura,I.WO 2005042542,2005；(d)Shi,Y.；Lin,A.J.；Mao,H.B.；Mao,Z.J.；Li,W.P.；Hu,H.W.；Zhu,C.J.；Cheng,Y.X.Chem.Eur.J.2013,19,1914；(e)Zhang,J.；Gao,H.；Sun,J.；Yan,C.G.Eur.J.Org.Chem.2014,5598.)。

自1863年薁類化合物被發(fā)現(xiàn)后便受到廣泛關(guān)注，因其獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)以及表現(xiàn)出的特有的物理、化學(xué)和生物活性(Fischer,G.Adv.Heterocyclic Chem.2009,97,131.)，在多個(gè)領(lǐng)域中發(fā)揮著重要的作用。在醫(yī)藥領(lǐng)域，薁類化合物表現(xiàn)出的抗炎、抗癌(Asato,A.E.；Peng,A.；Hossain,M.Z.；Mirzadegan,T.；Bertram,J.S.J.Med.Chem.1993,36,3137.)和抗?jié)?Yanagisawa,T.；Wakabayashi,S.；Tomiyama,T.；Yasunami,M.；Takase,K.Chem.Pharm.Bull.1988,36,641.)等活性，用于治療臨床中出現(xiàn)的眼睛和牙周膜炎及心血管疾病等病癥。在化工領(lǐng)域，用作激光染料(US:20030129516)，液晶顯示器(JP:2069437)和光感受器(Becker,D.A.；Ley,J.J.；Echegoyen,L.；Alvarado,R.J.Am.Chem.Soc.2002,124,4678.)等。在天然產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的愈創(chuàng)蘭烴薁，表現(xiàn)出優(yōu)異的抗胃蛋白酶、抗炎、抗過(guò)敏及抗病毒等作用((a)Jung,F.Pharmazie,1951,6,192；(b)Kouichi,N.；Tomio,N.；Hiroyuki,Y.；Shogo,I.；Yoshiaki,K.Eur.J.Pharm.Biopharm.2003,56,347；(c)Kourounakis,A.P.；Rekka,E.A.；Kourounakis,P.N.J.Pharm.Pharmacol.1997,49,938.)。

在藥物合成、醫(yī)藥等領(lǐng)域，目前迫切需要開(kāi)發(fā)新的具有特異性的生物活性分子。通過(guò)對(duì)螺環(huán)化合物分子的結(jié)構(gòu)修飾，獲得新型生物活性化合物的一條重要途徑，具有廣闊的應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種具有腫瘤抑制活性的新型吲哚螺環(huán)類化合物。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種操作方便，原料易得，產(chǎn)率高，選擇性好的新型吲哚螺環(huán)類化合物制備方法。

本發(fā)明還提供一種吲哚螺環(huán)類化合物在作為抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：

新型吲哚螺環(huán)類化合物，具有如下結(jié)構(gòu)通式：

其中，R¹為H或烷氧羰基；R²為H、烷基、烷氧基、羥基、鹵素、硝基、氰基、羧酸及其酯中的一種；R³為H、烷基或芳基；X為氰基或烷氧羰基。

上述新型吲哚螺環(huán)類化合物的制備方法，可按如下步驟實(shí)施：

(1)將氟化鉀加入至2-羥基薁、靛紅及氰乙酸酯的醇溶液中進(jìn)行反應(yīng)；

(2)反應(yīng)完畢后，通過(guò)直接過(guò)濾或?qū)⒎磻?yīng)液濃縮得到粗產(chǎn)物；

(3)將所得粗產(chǎn)物通過(guò)重結(jié)晶，即得目的產(chǎn)物。

作為一種優(yōu)選方案，本發(fā)明步驟(1)中所述醇為甲醇、乙醇或異丙醇。

進(jìn)一步地，本發(fā)明所述2-羥基薁、靛紅及氰乙酸酯的摩爾比依次為1:1～1.5:1～1.5。

進(jìn)一步地，本發(fā)明以摩爾質(zhì)量計(jì)，所述氟化鉀的用量為靛紅的5～50％。

上述新型吲哚螺環(huán)類化合物的制備方法，還可按如下步驟實(shí)施：

(1)將氟化鉀加入至2-羥基薁、靛紅及丙二腈的醇溶液中進(jìn)行反應(yīng)；

(2)反應(yīng)完畢后，通過(guò)直接過(guò)濾或?qū)⒎磻?yīng)液濃縮得到粗產(chǎn)物；

(3)將所得粗產(chǎn)物通過(guò)重結(jié)晶，即得目的產(chǎn)物。

作為一種優(yōu)選方案，本發(fā)明所述2-羥基薁、靛紅及丙二腈的摩爾比依次為1:1～1.5:1～1.5。

上述新型吲哚螺環(huán)類化合物在作為抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明以2-羥基薁、靛紅及氰乙酸酯(或丙二腈)為反應(yīng)原料，在氟化鉀作用下，通過(guò)三組分反應(yīng)一步合成。

合成原理為：

上述合成過(guò)程中所述的2-羥基薁為具有如下結(jié)構(gòu)的化合物：

其中，R¹＝H,烷氧羰基。

該化合物可參考文獻(xiàn)((a)Nozoe,T.；Takase,K.；Shimazaki,N.Bull.Chem.Soc.Jap.1964,37,1644；(b)Chen,A.H.Proc.Natl.Sci.Counc.ROC(A).1999,23,437.)方法，以卓酚酮(Tropolone)為原料，通過(guò)與丙二酸酯的縮合反應(yīng)制得：

上述合成過(guò)程中所述的靛紅為具有如下結(jié)構(gòu)的化合物：

其中，R¹為H、烷基、烷氧基、羥基、鹵素、硝基、氰基、羧酸及其酯等中的一種；R²為H、烷基、芳基。

該類化合物可參考文獻(xiàn)(張曉飛，劉華業(yè)，高文濤，渤海大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2009，30，212.)方法，以芳香胺為原料，通過(guò)Sandmeyer反應(yīng)制備；1-取代靛紅衍生物可參考文獻(xiàn)((a)Clay,C.M.；Abdallah,H.M.；Jordan,C.；Knisley,K.；Ketcha D.M.Arkivoc,2012,vi,317；(b)Azizian,J.；Fallah-Bagher-Shaidaei,H.；Kafayati,H.Synth.Commun.2003,33,789.)方法，以靛紅為原料，通過(guò)N-烷基化反應(yīng)制得：

本發(fā)明的另一目的是提供新型吲哚螺環(huán)類化合物在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的新型吲哚螺環(huán)類化合物，經(jīng)人胃癌細(xì)胞(BGC-823)和人肝癌細(xì)胞(SMMC-7721)的抑制活性測(cè)定表明，其對(duì)人胃癌細(xì)胞和人肝癌細(xì)胞具有良好的抑制作用，具有較強(qiáng)的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景，有望進(jìn)一步發(fā)展成為新的腫瘤生長(zhǎng)抑制劑、用于癌癥的治療藥物或相關(guān)藥物的合成等。

本發(fā)明新型吲哚螺環(huán)類化合物的合成方法操作方便、原料易得、產(chǎn)率高、選擇性好，為合成多環(huán)稠合的吲哚螺環(huán)類化合物提供了有效的合成途徑。

本發(fā)明將以下面實(shí)施例作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不受此實(shí)施例的限制。

具體實(shí)施例

實(shí)施例1

2’-氨基-3’-氰基-2-氧螺(吲哚啉-3,4’-薁并[1,2-e]吡喃)-11’-甲酸乙酯(A₁)的合成

于50mL反應(yīng)瓶中，將氟化鉀(10mg,0.17mmol)加入到2-羥基薁-1-甲酸乙酯(216mg,1.0mmol)，靛紅(176mg,1.2mmol)和丙二腈(79mg,1.2mmol)的甲醇(25mL)溶液中，加熱回流3小時(shí)(用硅膠層析板(TLC)監(jiān)控反應(yīng))。反應(yīng)完畢后，將反應(yīng)混合物減壓濃縮，乙醇重結(jié)晶得到黃色固體，收率86％.

結(jié)構(gòu)分析如下：

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ:1.46(t,J＝7.2Hz,3H),4.47(q,J＝7.2Hz,2H),7.13-7.21(m,4H),7.20-7.28(m,3H),7.62(s,2H),8.46(d,J＝10.4Hz,1H),8.93(d,J＝9.2Hz,1H),11.63(brs,1H).

IR(KBr)ν:3421(NH),3335(NH),2237(CN),1652(C＝O),1718(C＝O)cm^-1.

MS(ESI)m/z:412[M+H]⁺.

元素分析(C₂₄H₁₇N₃O₄):實(shí)測(cè)值(理論值)，C 70.13(70.07),H 4.24(4.16),N 10.29(10.21).

實(shí)施例2

2’-氨基-1-甲基-2-氧螺(吲哚啉-3,4’-薁并[1,2-e]吡喃)-3’,11’-二甲酸乙酯(A₂)的合成

于50mL反應(yīng)瓶中，將氟化鉀(17mg,0.3mmol)加入到2-羥基薁-1-甲酸乙酯(216mg,1.0mmol)，1-甲基靛紅(193mg,1.2mmol)和氰乙酸乙酯(135mg,1.2mmol)的乙醇(30mL)溶液中，加熱回流5小時(shí)(用硅膠層析板(TLC)監(jiān)控反應(yīng))。反應(yīng)完畢后，將反應(yīng)混合物減壓濃縮，異丙醇重結(jié)晶得到藍(lán)色固體，收率85％.

結(jié)構(gòu)分析如下：

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ:0.79(t,J＝6.8Hz,3H),1.41(t,J＝7.2Hz,3H),2.62(s,3H),3.75(q,J＝6.8Hz,2H),4.42(q,J＝7.2Hz,2H),7.10-7.18(m,4H),7.20-7.26(m,3H),7.60(s,2H),8.47(d,J＝10.4Hz,1H),8.90(d,J＝9.2Hz,1H).

IR(KBr)ν:3434(NH),1652(C＝O),1689(C＝O),1718(C＝O)cm^-1.

MS(ESI)m/z:473[M+H]⁺.

元素分析(C₂₇H₂₄N₂O₆):實(shí)測(cè)值(理論值)，C 70.13(68.63),H 4.24(5.12),N 10.29(5.93).

實(shí)施例3

2’-氨基-3’-氰基-2-氧螺(吲哚啉-3,4’-薁并[1,2-e]吡喃)(A₃)的合成

于50mL反應(yīng)瓶中，將氟化鉀(23mg,0.4mmol)加入到2-羥基薁(144mg,1.0mmol)，靛紅(176mg,1.2mmol)和丙二腈(86mg,1.3mmol)的甲醇(30mL)溶液中，加熱回流1小時(shí)(用硅膠層析板(TLC)監(jiān)控反應(yīng))。反應(yīng)完畢后，將反應(yīng)混合物減壓濃縮，乙醇重結(jié)晶得到黃色固體，收率80％.

結(jié)構(gòu)分析如下：

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ:7.15-7.24(m,4H),7.21-7.30(m,3H),7.60(s,2H),7.82(s,1H),8.44(d,J＝10.4Hz,1H),8.90(d,J＝9.2Hz,1H),11.59(brs,1H).

IR(KBr)ν:3425(NH),3329(NH),2246(CN),1718(C＝O)cm^-1.

MS(ESI)m/z:340[M+H]⁺.

元素分析(C₂₁H₁₃N₃O₂):實(shí)測(cè)值(理論值)，C 70.13(74.33),H 4.24(3.86),N 10.29(12.38).

實(shí)施例4

2’-氨基-3’-氰基-1-甲基-2-氧螺(吲哚啉-3,4’-薁并[1,2-e]吡喃)(A₄)的合成

于50mL反應(yīng)瓶中，將氟化鉀(13mg,0.2mmol)加入到2-羥基薁(144mg,1.0mmol)，1-甲基靛紅(193mg,1.2mmol)和丙二腈(79mg,1.2mmol)的甲醇(30mL)溶液中，加熱回流1小時(shí)(用硅膠層析板(TLC)監(jiān)控反應(yīng))。反應(yīng)完畢后，將反應(yīng)混合物減壓濃縮，異丙醇重結(jié)晶得到黃色固體，收率88％.

結(jié)構(gòu)分析如下：

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ:2.65(s,3H),7.13-7.20(m,4H),7.21-7.30(m,3H),7.65(s,2H),7.80(s,1H),8.48(d,J＝10.4Hz,1H),8.97(d,J＝9.2Hz,1H).

IR(KBr)ν:3420(NH),2246(CN),1723(C＝O)cm^-1.

MS(ESI)m/z:354[M+H]⁺.

元素分析(C₂₂H₁₅N₃O₂):實(shí)測(cè)值(理論值)，C 74.89(74.78),H 4.36(4.28),N 11.96(11.89).

實(shí)施例5

2’-氨基-1-甲基-2-氧螺(吲哚啉-3,4’-薁并[1,2-e]吡喃)-3’-甲酸乙酯(A₅)的合成

于50mL反應(yīng)瓶中，將氟化鉀(17mg,0.3mmol)加入到2-羥基薁(144mg,1.0mmol)，1-甲基靛紅(193mg,1.2mmol)和氰乙酸乙酯(135mg,1.2mmol)的甲醇(30mL)溶液中，加熱回流5小時(shí)(用硅膠層析板(TLC)監(jiān)控反應(yīng))。反應(yīng)完畢后，將反應(yīng)混合物減壓濃縮，異丙醇重結(jié)晶得到黃色固體，收率83％。

結(jié)構(gòu)分析如下：

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ:0.82(t,J＝6.8Hz,3H),2.62(s,3H),3.74(q,J＝6.8Hz,2H),7.15-7.23(m,4H),7.21-7.30(m,3H),7.65(s,2H),7.83(s,1H),8.53(d,J＝10.4Hz,1H),8.92(d,J＝9.2Hz,1H).

IR(KBr)ν:3429(NH),1692(C＝O),1723(C＝O)cm-¹.

MS(ESI)m/z:401[M+H]⁺.

元素分析(C₂₄H₂₀N₂O₄):實(shí)測(cè)值(理論值)，C 71.99(71.91),H 5.12(5.03),N 7.07(7.00).

實(shí)施例6

2’-氨基-1,5-二甲基-2-氧螺(吲哚啉-3,4’-薁并[1,2-e]吡喃)-3’-甲酸乙酯(A₆)的合成

于50mL反應(yīng)瓶中，將氟化鉀(20mg,0.34mmol)加入到2-羥基薁(144mg,1.0mmol)，1,5-二甲基靛紅(210mg,1.2mmol)和氰乙酸乙酯(146mg,1.3mmol)的甲醇(30mL)溶液中，加熱回流6小時(shí)(用硅膠層析板(TLC)監(jiān)控反應(yīng))。反應(yīng)完畢后，將反應(yīng)混合物減壓濃縮，異丙醇重結(jié)晶得到黃色固體，收率86％.

結(jié)構(gòu)分析如下：

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ:0.80(t,J＝6.8Hz,3H),2.41(s,3H),2.62(s,3H),3.72(q,J＝6.8Hz,2H),7.14-7.20(m,4H),7.25-7.37(m,3H),7.69(s,2H),7.87(s,1H),8.59(d,J＝10.4Hz,1H),8.91(d,J＝9.2Hz,1H).

IR(KBr)ν:3415(NH),1704(C＝O),1728(C＝O)cm-¹.

MS(ESI)m/z:416[M+H]⁺.

元素分析(C₂₅H₂₂N₂O₄):實(shí)測(cè)值(理論值)，C 72.53(72.45),H 5.46(5.35),N 6.83(6.76).

實(shí)施例7

2’-氨基-3’-氰基-5-甲氧基-2-氧螺(吲哚啉-3,4’-薁并[1,2-e]吡喃)-11’-甲酸乙酯(A₇)的合成

于50mL反應(yīng)瓶中，將氟化鉀(20mg,0.34mmol)加入到2-羥基薁-1-甲酸乙酯(216mg,1.0mmol)，5-甲氧基靛紅(212mg,1.2mmol)和丙二腈(79mg,1.2mmol)的甲醇(25mL)溶液中，加熱回流2小時(shí)(用硅膠層析板(TLC)監(jiān)控反應(yīng))。反應(yīng)完畢后，將反應(yīng)混合物減壓濃縮，乙醇重結(jié)晶得到黃色固體，收率86％。

結(jié)構(gòu)分析如下：

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ:1.42(t,J＝7.2Hz,3H),3.96(s,3H),4.50(q,J＝7.2Hz,2H),7.10-7.17(m,2H),7.20(s,1H),7.25-7.34(m,3H),7.65(s,2H),8.56(d,J＝10.4Hz,1H),8.90(d,J＝9.2Hz,1H),11.75(brs,1H).

IR(KBr)ν:3426(NH),3326(NH),2243(CN),1663(C＝O),1719(C＝O)cm^-1.

MS(ESI)m/z:442[M+H]⁺.

元素分析(C₂₅H₁₉N₃O₅):實(shí)測(cè)值(理論值)，C 68.09(68.02),H 4.45(4.34),N 9.59(9.52).

實(shí)施例8

2’-氨基-3’-氰基-1-芐基-2-氧螺(吲哚啉-3,4’-薁并[1,2-e]吡喃)-11’-甲酸乙酯(A₈)的合成

于50mL反應(yīng)瓶中，將氟化鉀(6mg,0.1mmol)加入到2-羥基薁-1-甲酸乙酯(216mg,1.0mmol)，1-芐基靛紅(284mg,1.2mmol)和丙二腈(79mg,1.2mmol)的甲醇(25mL)溶液中，加熱回流5小時(shí)(用硅膠層析板(TLC)監(jiān)控反應(yīng))。反應(yīng)完畢后，將反應(yīng)混合物減壓濃縮，乙醇重結(jié)晶得到黃色固體，收率88％.

結(jié)構(gòu)分析如下：

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ:1.40(t,J＝7.2Hz,3H),3.35(s,2H),4.53(q,J＝7.2Hz,2H),7.11-7.24(m,9H),7.27-7.35(m,3H),7.65(s,2H),8.58(d,J＝10.4Hz,1H),8.95(d,J＝9.2Hz,1H).

IR(KBr)ν:3416(NH),2238(CN),1657(C＝O),1724(C＝O)cm-¹.

MS(ESI)m/z:503[M+H]⁺.

元素分析(C₃₁H₂₃N₃O₄):實(shí)測(cè)值(理論值)，C 74.33(74.24),H 4.69(4.62),N 8.46(8.38).

實(shí)施例9

2’-氨基-3’-氰基-1-甲基-5-氯-2-氧螺(吲哚啉-3,4’-薁并[1,2-e]吡喃)(A₉)的合成

于50mL反應(yīng)瓶中，將氟化鉀(30mg,0.5mmol)加入到2-羥基薁-1-甲酸乙酯(216mg,1.0mmol)，1-甲基-5-氯靛紅(234mg,1.2mmol)和丙二腈(79mg,1.2mmol)的甲醇(30mL)溶液中，加熱回流4小時(shí)(用硅膠層析板(TLC)監(jiān)控反應(yīng))。反應(yīng)完畢后，將反應(yīng)混合物減壓濃縮，異丙醇重結(jié)晶得到黃色固體，收率85％.

結(jié)構(gòu)分析如下：

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ:1.52(t,J＝7.2Hz,3H),2.66(s,3H),4.53(q,J＝7.2Hz,2H),7.16-7.20(m,2H),7.22-7.29(m,3H),7.32(s,1H),7.65(s,2H),8.53(d,J＝10.4Hz,1H),8.92(d,J＝9.2Hz,1H).

IR(KBr)ν:3429(NH),2243(CN),1659(C＝O),1730(C＝O)cm-¹.

MS(ESI)m/z:460[M+H]⁺.

元素分析(C₂₅H₁₈ClN₃O₄):實(shí)測(cè)值(理論值)，C 65.35(65.29),H 4.02(3.95),N 9.23(9.14).

抗腫瘤活性測(cè)試

采用MTT法測(cè)定本發(fā)明吲哚螺環(huán)衍生物對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用進(jìn)行評(píng)價(jià)，受試細(xì)胞采用人低分化胃癌細(xì)胞(BGC-823)和人肝癌細(xì)胞(SMMC-7721)，抗癌藥物順鉑作為陽(yáng)性對(duì)照品。

活性測(cè)試材料

實(shí)驗(yàn)方法：

(1)樣品的準(zhǔn)備：分別將待測(cè)試化合物(1mg)用20μLDMSO溶解，取2μL溶解后溶液用1000μL培養(yǎng)液稀釋(該培養(yǎng)液為含胎牛血清質(zhì)量濃度為10％的DMEM培養(yǎng)基)，使其濃度為100μg/mL，再用相同的培養(yǎng)液連續(xù)稀釋至使用濃度1-10μg/mL。

(2)培養(yǎng)基的配制：配制DMEM培養(yǎng)基，使得每1000mL DMEM培養(yǎng)基中含80萬(wàn)單位青霉素、1.0g鏈霉素和10％質(zhì)量的滅活胎牛血清。

(3)細(xì)胞的培養(yǎng)：分別將上述腫瘤細(xì)胞接種于步驟(2)配制的培養(yǎng)基中，于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3-5d傳代。

(4)測(cè)定樣品對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用

將細(xì)胞人胃癌細(xì)胞(BGC-823)、人肝癌細(xì)胞(SMMC-7721)，分別用EDTA-胰酶消化液消化，并用培養(yǎng)基稀釋成1×105/mL，加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100μL，置37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24小時(shí)后棄去原培養(yǎng)基，加入含測(cè)試樣品的培養(yǎng)基，每孔200μL，每個(gè)濃度加3孔，置37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，72小時(shí)后在細(xì)胞培養(yǎng)孔中加入5mg/mL的MTT，每孔10μL，置37℃孵育4小時(shí)，加入DMSO，每孔150μL，用酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)下比色。分別以同樣條件用不含樣品、含同樣濃度DMSO的培養(yǎng)基培養(yǎng)的上述癌癥細(xì)胞作為對(duì)照，計(jì)算樣品對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的半數(shù)致死濃度(IC₅₀)。

經(jīng)過(guò)上述步驟測(cè)量后，本發(fā)明化合物的IC₅₀如下表所示：

化合物A₁-A₉的抗腫瘤活性

由測(cè)試結(jié)果可見(jiàn)，本發(fā)明實(shí)施例提供的化合物表現(xiàn)出良好的抗胃癌和抗肝癌活性，其中化合物A₂、A₅和A₆的抗胃癌活性，以及化合物A₂、A₆和A₉的抗肝癌活性分別優(yōu)于臨床用抗癌藥物順鉑。尤為突出的是化合物A₂和A₆的表現(xiàn)出雙重活性，同時(shí)對(duì)胃癌細(xì)胞肝癌細(xì)胞具有高的活性。

綜上所述，本發(fā)明提供了一類具有抗癌活性的吲哚螺環(huán)衍生物，同時(shí)發(fā)現(xiàn)該類化合物具有優(yōu)良的抗胃癌和抗肝癌活性，從而為抗癌藥物的研發(fā)拓展了研究底物，為進(jìn)一步應(yīng)用提供可能，具有巨大的臨床價(jià)值和開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。

可以理解的是，以上關(guān)于本發(fā)明的具體描述，僅用于說(shuō)明本發(fā)明而并非受限于本發(fā)明實(shí)施例所描述的技術(shù)方案，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，仍然可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行修改或等同替換，以達(dá)到相同的技術(shù)效果；只要滿足使用需要，都在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。