本發(fā)明涉及一種具有生物活性功能的大豆糖肽及其制備方法，特別是涉及具有抗氧化活性和抑菌活性的大豆糖肽及其制備方法。
背景技術(shù)：
大豆蛋白是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)資源，來源廣泛，價(jià)格低廉，是亞洲的傳統(tǒng)食品，尤其在保障我國(guó)膳食蛋白質(zhì)供給方面發(fā)揮著重要的作用。蛋白質(zhì)的糖基化修飾是將親水性的糖類物質(zhì)以共價(jià)鍵連接的方式連接到蛋白質(zhì)分子之中，使其既具有蛋白質(zhì)的大分子特性，又具有糖類物質(zhì)的親水特性。美拉德反應(yīng)途徑的糖基化，可以改善蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)，但存在反應(yīng)周期長(zhǎng)、產(chǎn)品褐變、營(yíng)養(yǎng)損失和安全隱患等缺陷。
采用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶不僅能夠催化蛋白質(zhì)分子的賴氨酸殘基的-NH2與谷氨酰胺殘基之間發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，制得交聯(lián)蛋白質(zhì)，還能催化伯胺物質(zhì)的-NH2與蛋白質(zhì)分子谷氨酰胺殘基之間發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)。利用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶將殼寡糖（基本單位是D-氨基葡萄糖，伯胺類物質(zhì)）與大豆蛋白分子連接，實(shí)現(xiàn)了大豆蛋白的糖基化修飾，即可以制備大豆糖蛋白。相比之下，該反應(yīng)具有專一性強(qiáng)、無副反應(yīng)、食品安全性高的優(yōu)點(diǎn)。
目前，利用該酶制備糖蛋白的研究?jī)H局限于幾個(gè)課題組在研究。多數(shù)為改善蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)，提高其作為功能性配料的可行性,如Zhao教授帶領(lǐng)的課題組和Betti教授帶領(lǐng)的課題組利用該酶的催化作用，將氨基葡萄糖導(dǎo)入到多種蛋白質(zhì)中制備糖蛋白，如有動(dòng)物蛋白（酪蛋白、肌動(dòng)球蛋白），植物蛋白（大豆分離蛋白）；一些也旨在增強(qiáng)蛋白質(zhì)的生物活性，Betti教授帶領(lǐng)的課題組分別將魚明膠蛋白水解物和小麥面筋蛋白水解物與氨基葡萄糖發(fā)生交聯(lián)，增強(qiáng)明膠肽及小麥肽的抗氧化及抑菌活性?？梢钥闯?，除了食源性糖肽，利用酶法定向制備糖肽，可為改善人類的膳食結(jié)構(gòu)，調(diào)整提供新的基礎(chǔ)理論依據(jù)，通過它們的有益作用來維護(hù)人類的健康和生活幸福。
轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶是一種微生物蛋白酶，通過分子插入、交聯(lián)反應(yīng)、脫氨作用，使蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。Alcalase堿性蛋白酶是由選育出的地衣芽孢桿菌生產(chǎn)而得，是一種高效的細(xì)菌蛋白酶，屬于內(nèi)切蛋白酶，主要作用于含疏水性羧基的肽鍵。Protamex復(fù)合蛋白酶是枯草桿菌蛋白酶，屬于內(nèi)切蛋白酶。這三種酶均已工業(yè)化生產(chǎn)，價(jià)格便宜，適合大豆糖肽的工業(yè)化生產(chǎn)的要求。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種具有生物活性功能的大豆糖肽及其制備方法，該方法利用糖基化大豆蛋白制成具有抗氧化活性的大豆糖肽和具有抑菌活性的大豆糖肽。
本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：
首先，制備糖基化大豆蛋白：
第一步：取大豆分離蛋白粉1kg，按固液比為0.4~0.6:10將其分散于水中，得到蛋白質(zhì)分散液；所述的固液比中固體用量為千克，液體用量單位為升；
第二步：所得蛋白質(zhì)分散液在90℃水浴加熱10分鐘，之后冷卻至40℃；對(duì)加熱處理的大豆蛋白分散液加入等體積的pH 7.5殼寡糖溶液，其中殼寡糖與大豆蛋白以質(zhì)量比1: 0.50；
第三步：攪拌均勻后，加入轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，每公斤蛋白質(zhì)加入10g轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，酶活力為1000U/g，攪拌均勻后，37℃振蕩3小時(shí)后，85℃加熱處理5分鐘，冷卻。
第四步：調(diào)節(jié)溶液pH至4.5，4000 r/min離心10 min，收集沉淀，水洗兩次。
利用糖基化大豆蛋白分別制成具有抗氧化活性的大豆糖肽和具有抑菌活性的大豆糖肽：
制備具有抗氧化活性的糖肽：
第一種：
將糖基化大豆蛋白沉淀物分散于水中，得到蛋白質(zhì)分散液，調(diào)節(jié)分散液pH 至8.0，固液比為0.4:10；所述的固液比中固體用量為大豆蛋白重量，千克，液體用量單位為升；攪拌均勻后，加入Alcalase堿性蛋白酶，按每公斤蛋白質(zhì)加入1g Alcalase堿性蛋白酶，攪拌均勻后，60℃條件下振蕩2小時(shí)；大豆蛋白酶解反應(yīng)結(jié)束后，85 ℃滅酶5 min，冷卻。調(diào)整溶液的pH至7.0。
濃縮：將上述濾液用蒸發(fā)器濃縮至固形物25-55%。噴霧干燥：入口溫度為110℃，入料流速為15%，抽氣量為80%，在此條件下，大豆肽的回收率≧50%。
第二種：
將沉淀物分散于水中，得到蛋白質(zhì)分散液，調(diào)節(jié)分散液pH 至7.0，固液比為0.4:10；所述的固液比中固體用量為大豆蛋白重量，千克，液體用量單位為升；攪拌均勻后，加入Protamex復(fù)合蛋白酶，每公斤蛋白質(zhì)加入10g Protamex復(fù)合蛋白酶，攪拌均勻后，55℃振蕩2小時(shí)。大豆蛋白酶解反應(yīng)結(jié)束后，85 ℃滅酶5 min，冷卻。調(diào)整溶液的pH至7.0。
濃縮：將上述濾液用蒸發(fā)器濃縮至固形物25-55%。噴霧干燥：入口溫度為110℃，入料流速為15%，抽氣量為80%，在此條件下，大豆肽的回收率≧50%。
經(jīng)Alcalase堿性蛋白酶水解所得的糖肽，水解度為4%，2mg/mL的抗氧化活性：DPPH自由基清除率為59.5%；羥基自由基清除率為38.4%；
經(jīng)Protamax復(fù)合蛋白酶水解所得的糖肽的抗氧化活性：DPPH自由基清除率大于50%；羥基自由基清除率大于35%。
制備具有抑菌活性的糖肽：
第一種：
將糖基化大豆蛋白沉淀物分散于水中，得到蛋白質(zhì)分散液，調(diào)節(jié)分散液pH 至2.0，固液比為0.4:10；所述的固液比中固體用量為大豆蛋白重量，千克，液體用量單位為升；攪拌均勻后，加入胃蛋白酶，每公斤蛋白質(zhì)加入2g胃蛋白酶，攪拌均勻后，37℃振蕩2小時(shí)；大豆蛋白酶解反應(yīng)結(jié)束后，85 ℃滅酶5 min，冷卻。調(diào)整溶液的pH至7.0。
濃縮：將上述濾液用蒸發(fā)器濃縮至固形物25-55%。噴霧干燥：入口溫度為110℃，入料流速為15%，抽氣量為80%，在此條件下，大豆肽的回收率≧50%。
第二種：
將沉淀物分散于水中，得到蛋白質(zhì)分散液，調(diào)節(jié)分散液pH 至8.0，固液比為0.4:10；所述的固液比中固體用量為大豆蛋白重量，千克，液體用量單位為升；攪拌均勻后，加入胰蛋白酶，每公斤蛋白質(zhì)加入10g胰蛋白酶，攪拌均勻后，37℃振蕩2小時(shí)。大豆蛋白酶解反應(yīng)結(jié)束后，85 ℃滅酶5 min，冷卻。調(diào)整溶液的pH至7.0。
濃縮：將上述濾液用蒸發(fā)器濃縮至固形物25-55%。噴霧干燥：入口溫度為110℃，入料流速為15%，抽氣量為80%，在此條件下，大豆肽的回收率≧50%。
本發(fā)明的有益效果是：采用一種專一性強(qiáng)、無副反應(yīng)、安全性高的酶（轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶）催化的方法將親水性的殼寡糖分子共價(jià)交聯(lián)到大豆蛋白分子中，制備糖蛋白。并通過食品級(jí)蛋白酶（堿性蛋白酶蛋白酶/復(fù)合蛋白酶）。這些反應(yīng)都有利于提供更多的電子供體和氫供體，而增強(qiáng)大豆蛋白的氧化性質(zhì)。胃蛋白酶/胰蛋白酶降解糖基化大豆蛋白后，所得糖肽能夠起到抑菌作用，尤其對(duì)革蘭氏陽性菌更加有效,濃度為2 mg/mL（水解度為4%）時(shí)，抑制大腸桿菌的能力達(dá)到90%以上。這將豐富食源性糖肽的來源，對(duì)開發(fā)食源性糖肽具有推動(dòng)作用。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明的目的是提供一種具有生物活性功能的大豆糖肽及其制備方法，該具有生物活性功能的大豆糖肽及其制備方法利用糖基化大豆蛋白制成具有抗氧化活性的大豆糖肽和具有抑菌活性的大豆糖肽。
本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：
首先，制備糖基化大豆蛋白：
第一步：取大豆分離蛋白粉1kg，按固液比為0.6:10將其分散于水中，得到蛋白質(zhì)分散液；所述的固液比中固體用量為千克，液體用量單位為升；
第二步：所得蛋白質(zhì)分散液在90℃水浴加熱10分鐘，之后冷卻至40℃；對(duì)加熱處理的大豆蛋白分散液加入等體積的pH 7.5殼寡糖溶液，其中殼寡糖與大豆蛋白以質(zhì)量比1: 0.50；
第三步：攪拌均勻后，加入轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，每公斤蛋白質(zhì)加入10g轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，酶活力為1000U/g，攪拌均勻后，37℃振蕩3小時(shí)后，85℃加熱處理5分鐘，冷卻。
第四步：調(diào)節(jié)溶液pH至4.5，4000 r/min離心10 min，收集沉淀，水洗兩次。
利用糖基化大豆蛋白分別制成具有抗氧化活性的大豆糖肽和具有抑菌活性的大豆糖肽：
實(shí)施例1
制備具有抗氧化活性的糖肽：
第一種：
將糖基化大豆蛋白沉淀物分散于水中，得到蛋白質(zhì)分散液，調(diào)節(jié)分散液pH 至8.0，固液比為0.4:10；所述的固液比中固體用量為大豆蛋白重量，千克，液體用量單位為升；攪拌均勻后，加入Alcalase堿性蛋白酶，按每公斤蛋白質(zhì)加入1g Alcalase堿性蛋白酶，攪拌均勻后，60℃條件下振蕩2小時(shí)；大豆蛋白酶解反應(yīng)結(jié)束后，85 ℃滅酶5 min，冷卻。調(diào)整溶液的pH至7.0。
濃縮：將上述濾液用蒸發(fā)器濃縮至固形物25-55%。噴霧干燥：入口溫度為110℃，入料流速為15%，抽氣量為80%，在此條件下，大豆肽的回收率≧50%。
第二種：
將沉淀物分散于水中，得到蛋白質(zhì)分散液，調(diào)節(jié)分散液pH 至7.0，固液比為0.4:10；所述的固液比中固體用量為大豆蛋白重量，千克，液體用量單位為升；攪拌均勻后，加入Protamex復(fù)合蛋白酶，每公斤蛋白質(zhì)加入10g Protamex復(fù)合蛋白酶，攪拌均勻后，55℃振蕩2小時(shí)。大豆蛋白酶解反應(yīng)結(jié)束后，85 ℃滅酶5 min，冷卻。調(diào)整溶液的pH至7.0。
濃縮：將上述濾液用蒸發(fā)器濃縮至固形物25-55%。噴霧干燥：入口溫度為110℃，入料流速為15%，抽氣量為80%，在此條件下，大豆肽的回收率≧50%。
經(jīng)Alcalase堿性蛋白酶水解所得的糖肽，水解度為4%，2mg/mL的抗氧化活性：DPPH自由基清除率為59.5%；羥基自由基清除率為38.4%；
經(jīng)Protamax復(fù)合蛋白酶水解所得的糖肽的抗氧化活性：DPPH自由基清除率為50.4%；羥基自由基清除率為37.7%。
實(shí)施例2
制備具有抑菌活性的糖肽：
第一種：
將糖基化大豆蛋白沉淀物分散于水中，得到蛋白質(zhì)分散液，調(diào)節(jié)分散液pH 至2.0，固液比為0.4:10；所述的固液比中固體用量為大豆蛋白重量，千克，液體用量單位為升；攪拌均勻后，加入胃蛋白酶，每公斤蛋白質(zhì)加入2g胃蛋白酶，攪拌均勻后，37℃振蕩2小時(shí)；大豆蛋白酶解反應(yīng)結(jié)束后，85 ℃滅酶5 min，冷卻。調(diào)整溶液的pH至7.0。
濃縮：將上述濾液用蒸發(fā)器濃縮至固形物25-55%。噴霧干燥：入口溫度為110℃，入料流速為15%，抽氣量為80%，在此條件下，大豆肽的回收率≧50%。
第二種：
將沉淀物分散于水中，得到蛋白質(zhì)分散液，調(diào)節(jié)分散液pH 至8.0，固液比為0.4:10；所述的固液比中固體用量為大豆蛋白重量，千克，液體用量單位為升；攪拌均勻后，加入胰蛋白酶，每公斤蛋白質(zhì)加入10g胰蛋白酶，攪拌均勻后，37℃振蕩2小時(shí)。大豆蛋白酶解反應(yīng)結(jié)束后，85 ℃滅酶5 min，冷卻。調(diào)整溶液的pH至7.0。
濃縮：將上述濾液用蒸發(fā)器濃縮至固形物25-55%。噴霧干燥：入口溫度為110℃，入料流速為15%，抽氣量為80%，在此條件下，大豆肽的回收率≧50%。