本發(fā)明屬于生物化工和生物技術領域，具體涉及一種酯酶EstC10及其編碼基因和應用。

背景技術：

酯酶廣泛存在于動物、植物及微生物中，是一類催化水解或形成酯鍵的酶，作用的底物通常是脂肪鏈小于十個碳原子的酯類。酯酶屬于α/β折疊水解酶超家族，催化中心一般由絲氨酸、天冬氨酸/谷氨酸和組氨酸組成，保守序列為絲氨酸附近的五肽(GXSXG)序列。酯酶能催化水解、酯化、轉酯化等多種化學反應，是一種很重要的工業(yè)生物催化劑，被廣泛運用于精細化工、洗滌、醫(yī)藥、食品、造紙、皮革加工、紡織、廢水處理和飼料工業(yè)等領域。從催化特性來看，酯酶具有高度的化學選擇性和立體異構選擇性，且反應不需要輔酶、反應條件溫和、副產(chǎn)物少。在生產(chǎn)應用中的酯酶的另一顯著特點是它能在異相系統(tǒng)(即油-水界面)或有機相中作用。在水相中，酯酶通常催化水解反應，而在有機相中，它卻能催化酯化和轉酯化反應。通過微生物酯酶的生物轉化制備新型藥物中間體或者去除藥物消旋體的非有效成分，是一種重要的手性技術，有著非常廣闊的應用前景，它可以為合成手性藥物提供新的平臺，為大量制備光學純化合物提供新的方法。酶法選擇性拆分消旋體化合物，具有立體專一性高，副反應少，產(chǎn)率高，產(chǎn)物光學純度好以及反應條件溫和的優(yōu)點，所以是一種被廣泛認可的拆分方法。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種新的酯酶EstC10及其編碼基因和應用。

本發(fā)明從一株嗜熱芽孢桿菌(Bacillus sp.)CX01中開發(fā)得到一種酯酶EstC10及其編碼基因EstC10，構建了含有酯酶基因EstC10的重組表達載體和基因工程菌，培養(yǎng)基因工程菌后獲得酯酶EstC10，其可應用于拆分(±)-2-氯丙酸甲酯、(±)-乳酸甲酯。

本發(fā)明的第一個目的是提供一種酯酶EstC10，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種編碼所述的酯酶EstC10的酯酶基因EstC10。

所述的酯酶基因EstC10的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本發(fā)明還提供一種含有所述的酯酶基因EstC10的重組表達載體。所述的表達載體，優(yōu)選pET-28α(+)載體。

本發(fā)明還提供一種含有所述的酯酶基因EstC10的基因工程菌。所述的基因工程菌，優(yōu)選大腸桿菌(Escherichia coli)BL21(DE3)。

本發(fā)明的第三個目的是提供所述的酯酶EstC10在催化酯類水解、酯化和/或轉酯化反應中的應用。

優(yōu)選，所述的應用為酯酶EstC10在拆分(±)-2-氯丙酸甲酯制備得到R-2-氯丙酸甲酯中的應用。

優(yōu)選，所述的應用為酯酶EstC10在拆分(±)-乳酸甲酯制備得到D-乳酸甲酯中的應用。

本發(fā)明的酯酶基因EstC10來自嗜熱芽孢桿菌(Bacillus sp.)CX01，保存在中國科學院南海海洋研究所。本發(fā)明利用生物信息學分析方法，分析得到一個酯酶基因EstC10。通過PCR的方法，從上述嗜熱芽孢桿菌(Bacillus sp.)CX01基因組中克隆得到酯酶基因EstC10，全長為747bp(從起始密碼子到終止密碼子)，編碼248個氨基酸。將酯酶基因EstC10與表達載體pET-28α(+)連接后轉化大腸桿菌BL21(DE3)，培養(yǎng)并誘導表達后，得到了重組酯酶EstC10。酯酶EstC10能催化酯類水解、酯化和/或轉酯化反應，酯酶EstC10作為催化劑拆分(±)-2-氯丙酸甲酯，可制備得到R-2-氯丙酸甲酯；酯酶EstC10作為催化劑拆分(±)-乳酸甲酯，可制備得到D-乳酸甲酯。

附圖說明

圖1是酯酶EstC10的SDS-PAGE電泳；M為蛋白marker，泳道1為誘導前總蛋白對照，泳道2為IPTG誘導后含重組酯酶基因EstC10的E.coli BL21(DE3)蛋白上清，泳道3為IPTG誘導后含重組酯酶基因EstC10的E.coli BL21(DE3)總蛋白，泳道4為純化的酯酶EstC10。

圖2是酯酶EstC10對不同側鏈長度?；膶ο趸椒吁サ奶禺愋?。

圖3是pH對酯酶EstC10活性的影響。

圖4是不同pH對酯酶EstC10的穩(wěn)定性影響。

圖5是溫度對酯酶EstC10活性的影響。

圖6是不同溫度對酯酶EstC10穩(wěn)定性的影響。

圖7是在酯酶EstC10作用下(±)-2-氯丙酸甲酯e.e._s和Y隨底物濃度的變化曲線。

圖8是在酯酶EstC10作用下(±)-2-氯丙酸甲酯e.e._s和Y隨反應時間的變化曲線。

圖9是(±)-2-氯丙酸甲酯氣相色譜圖，S表示S-2-氯丙酸甲酯，R表示R-2-氯丙酸甲酯。

圖10是最適反應條件下酯酶EstC10對(±)-2-氯丙酸甲酯的選擇性水解氣相色譜圖，R表示R-2-氯丙酸甲酯。

圖11是在酯酶EstC10作用下(±)-乳酸甲酯e.e._s和Y隨底物濃度的變化曲線。

圖12是在酯酶EstC10作用下(±)-乳酸甲酯e.e._s和Y隨反應時間的變化曲線。

圖13是(±)-乳酸甲酯氣相色譜圖，D表示D-乳酸甲酯，L表示L-乳酸甲酯。

圖14是最適反應條件下酯酶EstC10對(±)-乳酸甲酯的選擇性水解氣相色譜圖，D表示D-乳酸甲酯。

具體實施方式

以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。

本發(fā)明的酯酶基因EstC10來源于基因組測序的嗜熱芽孢桿菌(Bacillus sp.)CX01，該菌保存在中國科學院南海海洋研究所實驗室。

實施例1：酯酶基因EstC10開放閱讀框邊界確定及引物設計

提取嗜熱芽孢桿菌(Bacillus sp.)CX01的基因組DNA，經(jīng)全基因組測序后，利用生物信息學手段對基因組進行基因注釋，分析其中的酯酶基因，確定了其中酯酶基因EstC10的開放閱讀框，其基因序列如SEQ ID NO.1所示，全長為747bp(從起始密碼子到終止密碼子)，其編碼的酯酶EstC10的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，共248個氨基酸。根據(jù)分析得到的酯酶基因序列，設計全長擴增引物如下：上游引物：5′-CATGGATCCATGAAAATCGTCAAACCA-3′(下劃線為BamH I酶切位點)；下游引物：5′-CATCTCGAGTTATGTCTGCCAATCCAG-3′(下劃線為Xho I酶切位點)。

實施例2：酯酶基因EstC10的克隆及載體構建

2.1PCR擴增

將實施例1設計的引物(上游引物：5′-CATGGATCCATGAAAATCGTCAAACCA-3′；下游引物：5′-CATCTCGAGTTATGTCTGCCAATCCAG-3′)送至上海生物工程有限公司合成，合成的引物使用TE緩沖液溶解成終濃度為10μM，以提取的嗜熱芽孢桿菌(Bacillus sp.)CX01總DNA作為DNA模板，建立如表1所示反應體系：

表1PCR反應體系

使用以下PCR擴增程序擴增酯酶基因EstC10：94℃變性5min；94℃變性30s，51℃退火30s，72℃延伸2min，進行32個循環(huán)；72℃延伸10min，冷卻到18℃。

將PCR產(chǎn)物在0.8％瓊脂糖凝膠中，120V電壓下電泳20min，置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察，回收747bp左右的條帶。PCR產(chǎn)物按照膠回收試劑盒的方法進行回收，使用30μL無菌水洗脫，得到純化回收的PCR產(chǎn)物。

2.2酶切

PCR產(chǎn)物使用以下體系進行酶切，酶切時間1.5h。酶切體系為：BamH I 2μL，Xho I 2μL，DNA<0.3μg，滅菌的雙蒸水加至40μL。酶切后按照膠回收試劑盒方法回收經(jīng)過雙酶切的PCR產(chǎn)物。

質粒pET-28α(+)的雙酶切：挑取含有質粒pET-28α(+)的大腸桿菌DH5α單菌落，過夜培養(yǎng)。使用質粒提取試劑盒提取質粒，用BamH I和Xho I按以下體系雙酶切，酶切時間1.5h。酶切體系為：BamH I 2μL，Xho I 2μL，DNA<0.3μg，滅菌的雙蒸水加至40μL。酶切后在0.8％瓊脂糖凝膠中電泳，按照膠回收試劑盒方法回收經(jīng)過雙酶切的線性pET-28a(+)載體。

上述雙酶切使用的限制性內切酶為Thermo公司生產(chǎn)的快速內切酶，酶切后的純化回收使用核酸純化回收試劑盒(Magen，Hipure Gel Pure DNA Micro Kit)，質粒提取試劑盒為上海捷瑞生物工程有限公司的質粒小量制備試劑盒，操作方法按其使用說明書。

2.3連接

將經(jīng)過雙酶切的PCR產(chǎn)物和雙酶切的pET-28α(+)載體按以下體系進行連接：雙酶切PCR產(chǎn)物5μL，雙酶切的pET-28α(+)載體1μL，T4連接酶(5U/μL)0.5μL，連接緩沖液(5×)1μL用去離子水補足5μL，連接溫度為20℃，20min。

2.4轉化及篩選

取5μL連接產(chǎn)物加入50μL大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，冰浴20～30min，后于42℃水浴鍋熱激90s，冰浴2min后加入500μL LB液體培養(yǎng)基，37℃200rpm轉速下，孵育培養(yǎng)1h。取一定量的菌液涂布于含50μg/mL卡那霉素的LB平板，培養(yǎng)20h后挑選單菌落。單菌落于5mL LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)后提取質粒，進行雙酶切驗證，酶切片段與基因大小相同的即為陽性克隆。

2.5基因核苷酸序列測定

將篩選的陽性克隆送至上海美吉生物醫(yī)藥有限公司進行測序，測序結果與酯酶基因EstC10序列進行比對，進一步確認是將酯酶基因EstC10插入到pET-28α(+)質粒中，結果完全正確后確認得到帶有酯酶基因EstC10的pET-28α(+)質粒(命名為pET-28α(+)-EstC10，可用于進行下一步試驗。

實施例3：酯酶EstC10在E.coli BL21(DE3)中的高效表達

3.1大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞制備

1.將少量大腸桿菌BL21(DE3)菌種接入5mL LB試管液中，200rpm、37℃過夜培養(yǎng)；

2.按1％體積比的接種量將試管中的菌液接種到200mL LB搖瓶中，200rpm、20℃過夜培養(yǎng)，得到原培養(yǎng)物；

3.將培養(yǎng)好的搖瓶在冰水中迅速冷卻至0℃，分裝至冰預冷的離心管(50mL)，冰置數(shù)分鐘；

4.4℃、4000rpm離心10min回收細胞，棄上清；

5.用冰預冷的10mL 0.1M的CaCl₂重懸細胞，4℃、4000rpm離心10～15min回收細胞；

6.重復5，用10mL 0.1M的CaCl₂重懸細胞，冰浴30min以上；

7.4℃，4000rpm離心10min回收細胞；

8.每50mL原培養(yǎng)物用5mL含體積分數(shù)7.5％DMSO的0.1M CaCl₂來重懸，分裝于1.5mL離心管，50～100μL每管。-80℃保藏。由此得到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞。

3.2轉化

取實施例2中得到的pET-28α(+)-EstC10質粒0.5～1μL與50μL大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞混合，冰浴30min，于42℃水浴鍋熱激90s，冰浴2min后加入500μL LB液體培養(yǎng)基，37℃200rpm培養(yǎng)1h。培養(yǎng)物離心后涂布50μg/mL的卡那霉素LB平板，培養(yǎng)過夜20h后挑選單菌。由此得到含有pET-28α(+)-EstC10的大腸桿菌BL21(DE3)。

實施例4：酯酶EstC10的表達和純化

4.1蛋白誘導

含有pET-28α(+)-EstC10的大腸桿菌BL21(DE3)在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD₆₀₀為0.85左右，加IPTG至終濃度0.2mM，22℃培養(yǎng)16h。300mL菌液4000rpm、4℃離心20min，收集菌體，用30mL(50mM，pH 7.4)Tris-HCl緩沖液重懸菌體，超聲400w，超4s，停6s，破碎15min分鐘，離心，收集上清。

4.2酯酶EstC10的純化與SDS-PAGE電泳

用鎳離子親和層析柱純化4.1中收集的上清，具體實施方案如下：使用25mM的咪唑洗脫5個柱體積，40mM咪唑洗脫20～30個柱體積，最后使用3.5mL 100mM咪唑洗脫，收集最后的3mL洗脫液。用脫鹽柱SephadexG25進行脫鹽，具體操作方法參照GE公司的操作手冊進行。將純化的酯酶進行SDS-PAGE凝膠電泳，得到純化的酯酶EstC10(圖1)，純化的蛋白大小約35kD，符合理論預期。

4.3酯酶EstC10活性測定

酯酶EstC10活力測定采用對硝基苯酚酯，具體方法如下：①用乙腈配制5mM的對硝基苯酚酯；②在0.2mL反應體系中加入187.5μL Tris-HCl buffer(50mM，pH 8.0)，8μL對硝基苯酚酯，2.5μL純酶液(稀釋20倍后的濃度0.0025μg/μL)；③20℃下，反應4min后，加入50μL正丙醇終止反應，于405nm測定吸光度。

酶活力單位定義：1min內水解對硝基苯酚酯，釋放1μM對硝基苯酚所需的酶量定義為一個酶活力單位。

實施例5：酯酶EstC10的酶學性質

5.1水解不同側鏈長度的對硝基苯酚酯

按照4.3的測定條件，比較酯酶EstC10水解不同長度?；膶ο趸椒吁₂-C₁₂，結果如圖2。說明酯酶EstC10對長鏈對硝基苯酚酯特異性差，而對于短鏈長度的對硝基苯酚酯的作用效果較好，最佳的底物是C₂，即對硝基苯酚乙酸酯。

5.2最適pH和pH穩(wěn)定性

配制不同的緩沖溶液，這些緩沖溶液具有不同的pH，如表2所示，其濃度均為50mM。

表2不同pH的緩沖體系

將4.3中測定條件所述的緩沖液(Tris-HCl buffer)按照表2中的緩沖溶液分別進行替換，測定重組酯酶EstC10的酶活力，底物為對硝基苯酚乙酸酯。pH對重組酯酶EstC10活性的影響結果見圖3。在50mM的PBS pH8.0時，酯酶EstC10的酶活性最高，pH值在7.0–8.0之間有較高的酶活性。當pH低于8.0時，其活性迅速降低。pH8.0時，酯酶EstC10在Tris-HCl緩沖液中的酶活力為PBS緩沖液中的77.6％。酯酶EstC10在不同pH的緩沖液中的穩(wěn)定性見圖4。pH在6.0-8.0時酶活性較穩(wěn)定，處理7h后殘余活性在55％以上。而在過堿條件下，酶活性喪失則較為明顯。

5.3最適溫度和溫度穩(wěn)定性

使用50mM的PBS pH8.0作為緩沖液，對硝基苯酚乙酸酯作為底物，按照4.3中的反應體系，在不同溫度下測定酶活。測得酯酶EstC10催化水解對硝基苯酚乙酸酯的最適溫度為35℃(圖5)。在30-45℃間的酶活力達80％以上，溫度大于50℃時酶活性急劇下降。將酯酶EstC10在不同溫度(30-50℃)下，間隔一定時間取出測酶活力，結果見圖6。酯酶EstC10在低于45℃時，酶活性保持較高，處理90min后殘余酶活性仍保持65％以上。隨著處理溫度的升高，酯酶殘余酶活力逐漸下降，當溫度高于50℃時酶活性急劇降低，在50℃處理30min后，殘余酶活力基本喪失(圖6)，說明酯酶在低于45℃時穩(wěn)定性較好。

5.4金屬離子對酯酶EstC10活性的影響

按照表3中的離子種類和濃度處理酯酶，以未添加任何離子或表面活性劑的反應體系中的酶活力為100％，作為對照，在室溫下孵育3h，按4.3測定方法(以對硝基苯酚乙酸酯作為底物)測定相對酶活。金屬離子對酶活性的影響見表3。與對照相比，低濃度的Ni²⁺、Co²⁺、Fe³⁺、Zn²⁺和Cu²⁺對酯酶催化對硝基苯酚乙酸酯的活力有不同程度的抑制作用。隨金屬離子濃度的增大，抑制作用加強。而Na⁺、Ba²⁺、K⁺、Mg²⁺和Ca²⁺對酯酶EstC10酶活力的影響很小。

表3金屬離子對酯酶EstC10活力的影響

5.5表面活性劑對酯酶EstC10活性的影響

按照表4中的表面活性劑的種類和濃度處理酯酶EstC10，以未添加任何離子或表面活性劑的反應體系中的酶活力為100％，作為對照。在室溫下孵育3h，按4.3測定方法(以對硝基苯酚乙酸酯作為底物)測定相對酶活。表面活性劑對酶活性的影響見表4。在質量分數(shù)0.1％和0.5％兩個濃度下，Tween-20和三聚磷酸鈉對酶活性具有激活作用，而質量分數(shù)0.1％濃度的Tween-80對酶活性具有抑制作用，并且隨著濃度增加抑制作用增強。SDS、SDBS、CTAB在質量分數(shù)0.1％濃度下對酶具有強抑制性。

表4表面活性劑對酯酶EstC10活性的影響

5.6有機溶劑對酯酶EstC10活性的影響

按照表5中所示有機溶劑種類和終濃度，在反應體系中加入有機溶劑處理酯酶EstC10酶液，處理條件為室溫，PBS(pH8.0)緩沖溶液中孵育3h，以未加入有機溶劑的反應體系中酯酶EstC10活力為100％作為對照，再按照4.3的測定方法(以對硝基苯酚乙酸酯作為底物)測定相對酶活，結果如表5所示。在體積分數(shù)10％的濃度下，正己烷、庚烷、三氯甲烷和DMSO對酯酶EstC10作用很小，庚烷和DMSO無明顯影響，而其他有機溶劑對酯酶EstC10有不同程度的抑制作用。在高濃度(體積分數(shù)50％)下，酯酶EstC10在正己烷中保持較高的酶活，殘余酶活力為50％以上。以上結果說明該酯酶能夠耐有機溶劑。

表5有機溶劑對酯酶EstC10活性的影響

實施例6：酯酶EstC10拆分(±)-2-氯丙酸甲酯

6.1有機溶劑對酯酶EstC10拆分(±)-2-氯丙酸甲酯的影響

在反應體系加入10mg酯酶EstC10粗酶粉，80mM底物(±)-2-氯丙酸甲酯，10％(v/v)有機溶劑，以未加有機溶劑為對照，在37℃下反應15min，用氣相色譜手性柱檢測，根據(jù)峰面積計算底物對映體過量值(Enantionmeric excess，e.e._s)和得率(Yield，Y)，結果見表6。公式1：公式2：

A_S和A_R分別表示R-2-氯丙酸甲酯和S-2-氯丙酸甲酯的峰面積。A₀和A分別表示反應前后R-2-氯丙酸甲酯的峰面積。從表6可以看出絕大多數(shù)有機溶劑的存在降低了酯酶EstC10的立體選擇性。

表6有機溶劑對酯酶EstC10拆分(±)-2-氯丙酸甲酯的影響

6.2反應溫度對酯酶EstC10拆分(±)-2-氯丙酸甲酯的影響

在PBS(pH8.0)反應體系中加入10mg酯酶EstC10粗酶粉，80mM底物(±)-2-氯丙酸甲酯，在不同溫度下反應15min，手性氣相色譜測定酯酶EstC10拆分(±)-2-氯丙酸甲酯的立體選擇性，結果見表7。從表中可以看出，在25-37℃，e.e._s隨溫度的升高，高于37℃，e.e._s降低，因此酯酶EstC10拆分(±)-2-氯丙酸甲酯的最適溫度為37℃。

表7溫度對酯酶EstC10拆分(±)-2-氯丙酸甲酯的影響

6.3表面活性劑對酯酶EstC10拆分2-氯甲酯的影響

在優(yōu)化條件下(37℃，pH8.0PBS緩沖液)在反應體系中加入終濃度為80mM的底物(±)-2-氯丙酸甲酯，0.1％(w/v)的表面活性劑(Tween-20、Tween-80、TritonX-100、三聚磷酸鈉)，加入10mg酯酶EstC10粗酶粉反應15min后，樣品用于氣相色譜檢測，結果見表8。從表8中可以看出，與對照相比，在表面活性劑存在的情況下，e.e._s有不同程度的降低，三聚磷酸鈉和Tween-20對酯酶EstC10拆分(±)-2-氯丙酸甲酯的影響相對較小。

表8表面活性劑對酯酶EstC10拆分(±)-2-氯丙酸甲酯的影響

6.4金屬離子對酯酶EstC10拆分(±)-2-氯丙酸甲酯的影響

在優(yōu)化條件下(37℃，pH8.0PBS緩沖液)在反應體系中加入終濃度為80mM的底物(±)-2-氯丙酸甲酯，2mM的金屬離子，加入10mg酯酶EstC10粗酶粉反應15min后，樣品用于氣相色譜檢測，結果見表9。與對照相比，大多數(shù)金屬離子的存在使得e.e._s降低，Na⁺和Mg²⁺對(±)-2-氯丙酸甲酯的拆分基沒有影響。

表9金屬離子對酯酶EstC10拆分(±)-2-氯丙酸甲酯的影響

6.5底物濃度對酯酶EstC10拆分(±)-2-氯丙酸甲酯的影響

在優(yōu)化條件下(37℃，pH8.0PBS緩沖液)，在反應體系中加入10mg酯酶EstC10粗酶粉，60-120mM底物(±)-2-氯丙酸甲酯，反應15min后，樣品用于GC檢測，結果見圖7。從圖7中可以看出，當?shù)孜餄舛葹?0-70mM時，基本完全水解。隨著底物濃度的增加，e.e._s會迅速下降。底物濃度為80mM時，e.e._s達到93％，得率為33％，因此80mM為酯酶EstC10選擇性水解(±)-2-氯丙酸甲酯的最適底物濃度。

6.6反應時間對酯酶EstC10拆分(±)-2-氯丙酸甲酯的影響

在優(yōu)化條件下(37℃，pH8.0PBS緩沖液)，在反應體系中加入10mg的酯酶EstC10粗酶粉，80mM底物(±)-2-氯丙酸甲酯，每隔15min或10min取出500μL，用乙酸乙酯萃取，無水硫酸鈉除水，氣相色譜手性柱檢測，結果見圖8。從圖8中可以看出，隨著反應時間的延長，e.e._s逐漸升高。反應30min后，e.e._s變化不明顯，因此酯酶EstC10催化(±)-2-氯丙酸甲酯的最適時間是30min，最適反應條件下酯酶EstC10催化拆分(±)-2-氯丙酸甲酯為R-2-氯丙酸甲酯的e.e._s為99％，得率為28％。最適條件下反應前、后的氣相色譜圖見圖9和圖10。

實施例7：酯酶EstC10拆分(±)-乳酸甲酯

7.1有機溶劑對酯酶EstC10拆分(±)-乳酸甲酯的影響

在反應體系加入10mg酯酶EstC10粗酶粉，80mM底物(±)-乳酸甲酯，10％(v/v)有機溶劑，以未加有機溶劑為對照，在37℃下反應15min，用氣相色譜手性柱檢測，根據(jù)峰面積計算底物對映體過量值(Enantionmeric excess，e.e._s)和得率(Yield，Y)，結果見表10。

公式1：公式2：

A_D和A_L分別表示D-乳酸甲酯和L-乳酸甲酯的峰面積。A₀和A分別表示反應前、后D-乳酸甲酯的峰面積。

在有機溶劑存在的情況下，e.e._s有不同程度的降低，異辛烷、正己烷和正庚烷的影響相對較小。

表10有機溶劑對酯酶EstC10拆分(±)-乳酸甲酯的影響

7.2溫度對酯酶EstC10拆分(±)-乳酸甲酯的影響

在PBS(pH8.0)反應體系中加入10mg酯酶EstC10粗酶粉，80mM底物(±)-乳酸甲酯，在不同溫度下反應15min，手性氣相色譜測定酯酶拆分(±)-乳酸甲酯的立體選擇性，結果見表11。從表11中可以看出，e.e._s隨溫度的升高而增加，當溫度高于37℃時，e.e._s隨溫度的升高而降低，在37℃時具有最大的e.e._s和轉化率，因此酯酶拆分(±)-乳酸甲酯的最適溫度為37℃。

表11溫度對酯酶EstC10拆分(±)-乳酸甲酯的影響

7.3表面活性劑對酯酶EstC10拆分(±)-乳酸甲酯的影響

在優(yōu)化條件下(37℃，pH8.0PBS緩沖液)在反應體系中加入終濃度為80mM的底物(±)-乳酸甲酯，0.1％(w/v)的表面活性劑(Tween-20、Tween-80、TritonX-100、三聚磷酸鈉)，加入10mg酯酶EstC10粗酶粉反應15min后，樣品用于氣相色譜檢測，結果見表12。從表中可以看出，與對照相比，在三聚磷酸鈉存在的情況下，e.e._s有明顯提高，Tween-20對酯酶EstC10拆分(±)-乳酸甲酯基本沒有影響。

表12表面活性劑對酯酶EstC10拆分(±)-乳酸甲酯的影響

7.4金屬離子對酯酶EstC10拆分(±)-乳酸甲酯的影響

在優(yōu)化條件下(37℃，pH8.0PBS緩沖液)在反應體系中加入終濃度為80mM的底物(±)-乳酸甲酯，2mM的金屬離子，0.1％(w/v)的三聚磷酸鈉，加入10mg酯酶EstC10粗酶粉反應15min后，樣品用于氣相色譜檢測，結果見表13。從表中可以看出，與對照相比，大多數(shù)金屬離子的存在使e.e._s降低，Li⁺、Ca²⁺、Na⁺和Mn²⁺對(±)-乳酸甲酯的拆分基本沒有影響。

表13金屬離子對酯酶EstC10拆分(±)-乳酸甲酯的影響

7.5底物濃度對酯酶EstC10拆分(±)-乳酸甲酯的影響

在優(yōu)化條件下(37℃，pH8.0PBS緩沖液)，在反應體系中加入10mg酯酶EstC10粗酶粉，60-120mM底物(±)-乳酸甲酯，0.1％(w/v)的三聚磷酸鈉，加入10mg酯酶EstC10粗酶粉反應15min后，樣品用于GC檢測，結果見圖11。從圖11中可以看出，當?shù)孜餄舛葹?0mM時，基本完全水解。隨著底物濃度的增加，e.e._s會迅速下降。底物濃度為70mM時，e.e._s達到96％，得率為21％，因此70mM為酯酶EstC10選擇性水解(±)-乳酸甲酯的最適底物濃度。7.6反應時間對酯酶EstC10拆分(±)-乳酸甲酯的影響

在優(yōu)化條件下(37℃，pH8.0PBS緩沖液)，在反應體系中加入10mg的酯酶EstC10粗酶粉，70mM底物(±)-乳酸甲酯，0.1％(w/v)的三聚磷酸鈉，每隔10min取出500μL，用乙酸乙酯萃取，無水硫酸鈉除水，氣相色譜手性柱檢測，結果見圖12。從圖12中可以看出，隨著反應時間的延長，e.e._s逐漸升高。反應30min后，e.e._s達到99％，Y得率從20％降至11％，綜合考慮，酯酶EstC10催化(±)-乳酸甲酯的最適時間是20min，最適反應條件下酯酶EstC10催化拆分(±)-乳酸甲酯為D-乳酸甲酯的e.e._s為97％，得率為20％。最適條件下反應前、后的氣相色譜圖見圖13和圖14。