一種海洋氨氧化古菌的快速富集培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種海洋氨氧化古菌的快速富集培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 硝化-反硝化生物脫氮是廢水脫氮最常用的技術(shù)之一，氨氧化過(guò)程是硝化過(guò)程的 關(guān)鍵步驟和限速步驟。長(zhǎng)期以來(lái)，氨氧化細(xì)菌被認(rèn)為是氨氧化過(guò)程的主要承擔(dān)者。2005年， 氨氧化古菌的發(fā)現(xiàn)為自然界氨氧化乃至氮循環(huán)過(guò)程增添了新內(nèi)容。近年來(lái)，一系列的生理 學(xué)研究表明，氨氧化古菌對(duì)極端環(huán)境的適應(yīng)性遠(yuǎn)勝于氨氧化細(xì)菌，這也使得氨氧化古菌在 廢水脫氮工藝中的應(yīng)用有了巨大的前景和不容無(wú)視的優(yōu)勢(shì)。
[0003] 氨氧化細(xì)菌是廢水處理系統(tǒng)中常見(jiàn)的微生物，但因其生長(zhǎng)緩慢、世代時(shí)間較長(zhǎng)而 難以進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，而且氨氧化細(xì)菌受環(huán)境條件的影響較大。相比而言，氨氧化古菌具有 較寬的環(huán)境條件耐受范圍。氨氧化古菌對(duì)基質(zhì)氨氮的親和力遠(yuǎn)高于氨氧化細(xì)菌，其親和力 常數(shù)為0. 13-2. 0yM;實(shí)驗(yàn)室中培養(yǎng)的氨氧化細(xì)菌在pH值低于6. 5時(shí)無(wú)法正常生長(zhǎng)，而氨 氧化古菌可以在pH值為4. 5左右時(shí)進(jìn)行氨的氧化；氨氧化細(xì)菌的最適生長(zhǎng)溫度為30-35°C， 氨氧化古菌可以在2-80°C條件下正常生長(zhǎng)；氨氧化古菌對(duì)氧氣的親和力比氨氧化細(xì)菌高 10倍以上。上述特性使得氨氧化古菌在廢水深度處理、酸性廢水的生物脫氮、高溫/低溫廢 水生物脫氮以及低溶解氧廢水的生物脫氮等方面具有不容忽視的優(yōu)勢(shì)。
[0004] 氨氧化古菌廣泛分布于各個(gè)生態(tài)系統(tǒng)中，包括海洋生態(tài)系統(tǒng)、淡水生態(tài)系統(tǒng)、農(nóng)田 生態(tài)系統(tǒng)、濕地生態(tài)系統(tǒng)等。氨氧化古菌在自然界中的數(shù)量巨大，其數(shù)量通常為氨氧化細(xì)菌 數(shù)量的10-1000倍。在海洋環(huán)境中，氨氧化古菌可以占到微生物總數(shù)量的20%，所以選擇海 洋沉積物作為接種物為氨氧化古菌的快速富集培養(yǎng)奠定了基礎(chǔ)。
[0005] 傳統(tǒng)的梯度稀釋-平板劃線法對(duì)海洋氨氧化古菌的富集培養(yǎng)并不適用。首先是因 為海洋生境中細(xì)菌的數(shù)量多于古菌，利用傳統(tǒng)方法進(jìn)行富集，富集培養(yǎng)液中會(huì)存在大量的 非目標(biāo)菌；其次，氨氧化古菌伴生細(xì)菌生長(zhǎng)的現(xiàn)象明顯，原因是氨氧化古菌基因組中缺少三 羧酸循環(huán)關(guān)鍵環(huán)節(jié)催化酶的編碼基因，氨氧化古菌必須利用細(xì)菌三羧酸循環(huán)代謝產(chǎn)生的中 間產(chǎn)物才能正常生長(zhǎng)。因此在傳統(tǒng)方法中，一旦氨氧化古菌的伴生菌死亡，氨氧化古菌就無(wú) 法繼續(xù)生長(zhǎng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是為了獲得海洋氨氧化古菌的高富集培養(yǎng)物，從而提供了一種海洋 氨氧化古菌的快速富集培養(yǎng)方法。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下： 一種海洋氨氧化古菌的快速富集培養(yǎng)方法，所述方法包括下述步驟： A:富集培養(yǎng)接種物來(lái)源的選擇和前處理； B:海洋氨氧化古菌培養(yǎng)條件的確定,包括培養(yǎng)溫度、氨氮濃度、pH、溶解氧濃度的確 定； C:海洋氨氧化古菌富集培養(yǎng)基的配制，培養(yǎng)基中添加抗生素和微生物三羧酸循環(huán)的中 間代謝產(chǎn)物； D:海洋氨氧化古菌的富集培養(yǎng)； E:海洋氨氧化古菌富集過(guò)程中的分子生物學(xué)檢測(cè)。
[0008] 優(yōu)選的，所述步驟A中，選取不同海域的海底沉積物，通過(guò)氨氧化古菌功能基因的 定量檢測(cè)，確定用氨氧化古菌數(shù)量最多的沉積物樣品作為海洋氨氧化古菌富集培養(yǎng)的接種 物。
[0009] 優(yōu)選的，所述步驟A中，首先測(cè)定沉積物孔隙水的氨氮濃度、pH，然后將沉積物置 于1L的燒杯中，加入一定量的海水，攪拌后靜置沉淀，舍棄底部生物量較少的沙粒，抽取上 部沉積物作為海洋氨氧化古菌富集培養(yǎng)的接種物。
[0010] 優(yōu)選的，所述步驟B中，海洋氨氧化古菌培養(yǎng)溫度控制在沉積物樣品采集海域的 年平均溫度15°C;培養(yǎng)基pH控制在7. 5±0. 1 (與沉積物孔隙水平均pH接近）；富集培養(yǎng)基 氯化銨濃度為〇. 25mM，與原位生境濃度接近；富集培養(yǎng)中溶解氧濃度控制在1. 0-1. 5mg/L， 更加適合對(duì)氧氣親和力高的氨氧化古菌生長(zhǎng)。
[0011] 優(yōu)選的，所述步驟C中，海洋氨氧化古菌富集培養(yǎng)基包括：沉積物樣品采集海域海 水、氯化銨(終濃度為0. 25禮)、抗生素和三羧酸循環(huán)的中間代謝產(chǎn)物。
[0012] 優(yōu)選的，所述步驟C中，抗生素包括鏈霉素、慶大霉素、奇霉素、青霉素，培養(yǎng)基中 四種抗生素濃度均為50mg/L。
[0013] 優(yōu)選的，所述步驟C中，三羧酸循環(huán)的代謝產(chǎn)物包括a-酮戊二酸、草酰乙酸、丙酮 酸，三種中間產(chǎn)物的濃度均為100yM。
[0014] 優(yōu)選的，所述步驟C中，富集培養(yǎng)基的配制方法為：稱取氯化銨0. 014g、四種抗生 素各0. 05g、a-酮戊二酸〇. 015g、草酰乙酸0. 013g、丙酮酸0. 009g，溶于1L海水中，將pH 調(diào)為7. 5±0. 1，配制完成后，使用0. 22ym的濾膜進(jìn)行過(guò)濾，防止非目標(biāo)菌隨培養(yǎng)基進(jìn)入富 集培養(yǎng)物中。
[0015] 優(yōu)選的，所述步驟D中，氨氧化古菌的富集培養(yǎng)在連續(xù)流反應(yīng)器中進(jìn)行，水力停留 時(shí)間為48h。
[0016]優(yōu)選的，所述步驟E中，氨氧化古菌富集培養(yǎng)的過(guò)程中，使用熒光定量PCR和熒光 原位雜交對(duì)氨氧化古菌的富集程度進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。
[0017] 本發(fā)明的有益效果：1)海洋氨氧化古菌富集培養(yǎng)物的獲得將為海洋氨氧化古菌 的生理特性研究奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為海洋氨氧化過(guò)程和氮循環(huán)的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論支 撐。2)氨氧化古菌對(duì)于環(huán)境條件的變化有很強(qiáng)的耐受性，其耐低氧的特性可以大大降低生 物脫氮過(guò)程硝化段的運(yùn)行成本，其對(duì)氨氮極高的親和力可以為廢水的深度處理提供保障和 新思路。
【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1是海洋氨氧化古菌的快速富集培養(yǎng)方法流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖、附表及實(shí)施 例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā) 明，并不用于限定本發(fā)明。
[0020] 如圖1所示，本發(fā)明的流程如下： (1)選取舟山潮間帶、舟山潮下帶和東海大陸架沉積物三個(gè)取樣點(diǎn)，通過(guò)氨氧化古菌功 能基因的定量檢測(cè)，確定用氨氧化古菌數(shù)量最多的東海大陸架沉積物作為海洋氨氧化古菌 富集