本發(fā)明屬于生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種以三文魚為原料生產(chǎn)醫(yī)用級(jí)蛋白肽粉的方法。技術(shù)背景：蛋白肽粉不僅是發(fā)酵法制藥行業(yè)使用培養(yǎng)基的重要氮營養(yǎng)源，也是食品和保健品添加以及復(fù)合氨基酸的重要原料。以往的醫(yī)用級(jí)蛋白肽粉主要采用蛋白胨，以牛肉膏，魚溶漿粉等為主，但以此作為氮營養(yǎng)源在菌種培養(yǎng)和產(chǎn)菌率等方面的指標(biāo)均不能滿足要求，并且蛋白胨雜質(zhì)多，含有污染物和重金屬，影響產(chǎn)品的醫(yī)用安全。因此選擇無污染及重金屬含量低的原料成為提高蛋白胨品質(zhì)的主要因素。在選擇的過程中，由于海洋魚類生活于深海之中，無人為生態(tài)環(huán)境污染，重金屬含量低，且魚體蛋白含量高，研究人員將目光逐漸鎖定于海洋魚類。經(jīng)過比對(duì)，我們發(fā)現(xiàn)三文魚測得的魚皮蛋白含量在80%以上，三文魚魚肉蛋白含量高達(dá)17.2%、每100克魚肉能力能量達(dá)到139大卡，綜合比較各種魚類的營養(yǎng)指標(biāo)、保存難易、受污染的程度、對(duì)人體的危害等，我們得出深海冷水三文魚明顯優(yōu)于其它魚種如金槍魚、鱈魚、鳀魚、帶魚、鮐魚、魷魚，是很好的生產(chǎn)醫(yī)藥級(jí)蛋白肽粉的首選原料。目前有關(guān)于利用魚類作為原料進(jìn)行提取魚蛋白的報(bào)道。如申請(qǐng)?zhí)枺?01310096815X，一種利用復(fù)合蛋白酶制備活性膠原蛋白的方法，其采用的方法是在經(jīng)過預(yù)處理的魚皮混合液加入復(fù)合蛋白酶進(jìn)行酶解，復(fù)合蛋白酶選用木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、動(dòng)物蛋白水解酶、酸性蛋白酶和胃蛋白酶中兩種，將得到的酶解液進(jìn)行離心、超濾、濃縮、鹽析而得。如申請(qǐng)?zhí)枺?012102539328，一種魚腦微膠囊的制備方法，其采用的方法在經(jīng)過超聲波處理的魚腦均漿液中加入胰蛋白酶酶解后，滅酶，再加入胃蛋白酶酶解，獲得酶解液，在酶解液中加入其它營養(yǎng)成分經(jīng)過噴霧、干燥而得。申請(qǐng)?zhí)枺?015101175690，一種金槍魚魚骨膠原蛋白源鋅螯合膠原肽及其制備方法和用途，其方法是在經(jīng)過處理制得的金槍魚骨膠原蛋白料液中加入胃蛋白酶酶解，然后調(diào)整pH值，再加入胰蛋白酶酶解，得酶解產(chǎn)物，將酶解產(chǎn)物超濾、大孔樹脂層析柱脫雜、乙醇洗脫、冷凍干燥而得。申請(qǐng)?zhí)枺?004100356188，魚蛋白生物肽肥料的制備方法，其方法在鮮魚、鮮魚皮或鮮魚骨的下腳料中加入降解酶胰蛋白酶或胃蛋白酶進(jìn)行降解，然后過濾，濃縮、滅菌。雖然有上述關(guān)于魚蛋白的提取工藝，但采用上述酶解工藝對(duì)三文魚進(jìn)行提取，酶解結(jié)果顯示其水解度只能達(dá)到25-50%之間，水解程度較低，并且小肽分子量大于10000，蛋白肽呈現(xiàn)苦味，為消減苦味，目前常用的工藝是采用膜過濾，將10000以下的小肽分離出來，由此增加了分離難度、清洗膜的難度和污染。同時(shí)，三文魚中的脂肪含量高達(dá)7.8%、膠質(zhì)含量超過5%，酶解液不易分離和分層。采用常規(guī)的一步離心和膜分離相結(jié)合的方法無法將酶解液中的魚油、膠質(zhì)、脂和雜質(zhì)徹底分離，也給膜分離帶來了清洗的難度。另外酶解得物中游離氨基酸的含量過低，小于20%。上述酶解得物的指標(biāo)遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到醫(yī)藥級(jí)蛋白肽粉的要求，因此有必要針對(duì)三文魚的酶解工藝作進(jìn)一步改進(jìn)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為解決在利用三文魚作為原料進(jìn)行蛋白肽粉提取提純過程中所存在的技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種以三文魚為原料生產(chǎn)醫(yī)藥級(jí)蛋白肽粉的方法。為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：一種以三文魚為原料生產(chǎn)醫(yī)藥級(jí)蛋白肽粉的方法，其特征在于，該方法含有下列步驟：S1、原料準(zhǔn)備選擇新鮮的或冷凍的三文魚或其加工后剩余的副產(chǎn)物，如三文魚碎肉、魚排和魚皮作為原料，要求三文魚及其加工剩余副產(chǎn)物等原料的揮發(fā)性鹽基氮小于40，破碎為0.5-1.5cm的碎塊，將原料投入到酶水解反應(yīng)釜中，添加原料重量3-4倍的軟水；S2、第一步酶解選擇木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶作為內(nèi)切酶，其中木瓜蛋白酶、胃蛋白酶與胰蛋白酶的比例為：1：2：1，三種酶添加總量為底物重量的0.2-0.6%；酶解溫度60-65℃，PH5-8.5,酶解時(shí)間3-6小時(shí)，將溫度提升至85-95℃，滅酶30-40分鐘，得酶解液；S3、第一步分離將酶解液送入到固液離心機(jī)中進(jìn)行分離，離心機(jī)轉(zhuǎn)速2500-3500轉(zhuǎn)/分，離心差數(shù)0.85-0.95，將酶解后的魚渣和酶解液分離，得到含有魚油、膠質(zhì)和脂肪的初濾酶解液；S4、第二步酶解選擇氨肽酶或羧肽酶作為外切酶，氨肽酶或羧肽酶的添加量為初濾酶解液重量的0.1-0.5%，酶解溫度45-55℃，酶解時(shí)間為2-5小時(shí)，將酶解液升溫加熱到85-90℃，25-30分鐘進(jìn)行滅酶處理；S5、第二步分離將通過S4步驟得到的酶解液送入高速液液離心機(jī)，離心機(jī)轉(zhuǎn)速8000-10000轉(zhuǎn)/分，將酶解液中的魚油和脂肪分離出來，得到懸濁的酶解液；S6、酶解液靜置在懸濁的酶解液中加入明礬，添加量為底物重量的0.02-0.05%，靜置3-6小時(shí)，得沉降的酶解液；S7、第三步分離將沉降的酶解液，送入平板式離心，將絮凝物和大顆粒懸浮物體分離出來，得到澄清的酶解液，平板離心選用濾袋的目數(shù)600-1000目，離心機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)為800-1200轉(zhuǎn)；S8、蛋白肽粉提取將澄清酶解液經(jīng)過離子交換樹脂柱脫鹽和重金屬，再經(jīng)過微濾控制酶解液的分子量后，脫水，干燥，得到蛋白肽粉。進(jìn)一步的，步驟S2、S4和S6中的酶解或靜置是在密封狀態(tài)下進(jìn)行，在酶解的同時(shí)，向酶水解反應(yīng)釜中充入氮?dú)饣驅(qū)⒚杆夥磻?yīng)釜中抽成真空狀態(tài)，保證酶解物與空氣隔絕。本發(fā)明通過精選酶解所用的酶種，通過合理確定酶的添加量，控制酶解條件使所提取的蛋白肽粉的質(zhì)量得到大幅度提高，水解過程中的水解度可達(dá)到90%，蛋白收益率可達(dá)70%以上，得到的蛋白肽粉蛋白含量達(dá)97%以上，18種氨基酸含量85%以上。同時(shí)通過兩步酶解方法的采用，在酶解過程中采用內(nèi)切酶第一次酶解與外切酶第二次酶解分開進(jìn)行，酶解液中的游離氨基酸和小肽含量超過50%，且大大降低了苦味肽。通過上述兩種方法提取的三文魚蛋白肽粉各項(xiàng)指標(biāo)能夠完全滿足醫(yī)藥級(jí)蛋白肽粉的要求。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明所提供的方法做進(jìn)一步說明。實(shí)施例1一種以三文魚為原料生產(chǎn)醫(yī)藥級(jí)蛋白肽粉的方法，其特征在于，該方法含有下列步驟：S1、原料準(zhǔn)備選擇優(yōu)質(zhì)三文魚凍碎肉、魚排和魚皮1500公斤作為原料，要求三文魚原料的揮發(fā)性鹽基氮小于40，將原料粉碎至0.5~1.5cm碎塊，投入到10m3的水解釜中，補(bǔ)充新鮮軟水至原料重量的4倍。上述原料準(zhǔn)備的過程中，原料還可以選用新鮮的三文魚魚肉、魚骨，水解釜中軟水的添加量控制為固型物的3-4倍之間，具體數(shù)值根據(jù)原料的含水量進(jìn)行靈活掌控；S2、第一步酶水解向反應(yīng)釜中添加內(nèi)切酶，內(nèi)切酶優(yōu)選木瓜蛋白酶、胃蛋白酶及胰蛋白酶組成的復(fù)合酶，木瓜蛋白酶、胃蛋白酶與胰蛋白酶的添加重量比1：2：1，三種酶總量控制為酶解底物重量的0.5%，利用蒸汽將水解釜中的水及固物資加熱至60℃，調(diào)整PH值至7.5，水解時(shí)間5小時(shí)，得酶解液；在該步驟中，要求酶解過程，酶解物與外界空氣隔絕，具體做法是將水解反應(yīng)釜抽成真空，或向水解釜中充入氮?dú)猓员苊饧?xì)菌的滋生。另外在酶解過程中，酶解條件不受本實(shí)施例所提供的酶解條件限制，根據(jù)原料中魚肉、魚皮、內(nèi)臟、魚骨的各自含量合理調(diào)整酶解條件，一般酶解條件為：三種酶的添加總量控制為底物重量的0.3-0.6%之間，水解溫度控制在60-65℃、PH值5-8.5、水解時(shí)間3-6小時(shí)。在本步驟中，利用內(nèi)切酶的主要目的是將蛋白質(zhì)肽鏈切斷，將蛋白質(zhì)水解為氨基酸多肽；S3、第一步酶解液分離在本實(shí)施例中，先進(jìn)行酶解液的固液分離。該方法是是先用高速臥式螺旋沉降離心機(jī)分離殘?jiān)叵?，得到殘?jiān)土弦?。離心機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)為2500-3000轉(zhuǎn)，離心差數(shù)選0.85-0.95，在此分離中可以將100%的固相進(jìn)行分離，得到含懸浮液（次重相），膠質(zhì)和脂(次輕相)，三文魚油（輕液相）的初濾酶解液。S4、第二步酶水解由于木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶屬于內(nèi)切酶，僅能將蛋白質(zhì)的肽鏈切斷，得到氨基酸多肽和小于20%的游離氨基酸和小肽，為了得到游離氨基酸含量達(dá)到總氨基酸含量的40-60%，小肽含量達(dá)到80%的氨基酸酶解液，必須進(jìn)行以氨肽酶或羧肽酶為酶制劑的二次酶解。本實(shí)施案例中，選用氨肽酶或羧肽酶為外切酶，添加量為底物濃度的0.3%，酶解溫度為50℃，酶解時(shí)間為4.5小時(shí)。另外在酶解過程中，酶解條件不受本實(shí)施案例所提供的酶解條件限制，酶解條件可以實(shí)際料液的不同選用：酶制劑的添加為底物重量的0.1-0.5%，酶解溫度45-55℃，酶解時(shí)間為2-5小時(shí)。然后，將酶解液升溫加熱到85-90℃，25-30分鐘進(jìn)行滅酶處理。選擇氨肽酶或羧肽酶作為外切酶，氨肽酶或羧肽酶屬于肽鏈端解酶，可使氨基酸從多肽鏈的N-末端順序逐個(gè)地游離出來，從而得到游離氨基酸含量達(dá)40-60%的酶解液，避免了蛋白肽粉的苦味。本實(shí)施案例中，由于氨基酸分子量的變小，氨基酸的電離度發(fā)生變化，水包油和油包水的現(xiàn)象得以消除，料液極易分離為魚油、膠質(zhì)和脂（輕相）以及氨基酸液和懸浮物（重相），從而為得到澄清的酶解液做好充分準(zhǔn)備。S5、第二步酶水解液的分離經(jīng)過第二步酶解的混合酶解液經(jīng)過高速碟式離心，離心機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)為8000-10000轉(zhuǎn)，將魚油、膠質(zhì)和脂（輕相）以及氨基酸液和懸浮物（重相）進(jìn)行分離。本案例中，第二次酶解過程同樣是水解釜抽成真空或充入氮?dú)猓员苊饷附庖褐屑?xì)菌的滋生。S6、第三步酶解液靜置經(jīng)過步驟S5分離步驟后，料液中一些懸浮的，沒有徹底水解的蛋白質(zhì)和氨基酸多肽仍然留在離心液中，檢測結(jié)果表明，懸浮物含量為料液重量的2-5%，因此需要將該懸浮物進(jìn)行排除。本實(shí)施例采用的技術(shù)方案是在料液中添加0.02%的明礬，靜置4小時(shí)，利用懸浮物的電位差，將其沉淀下來，可將全部的懸浮物沉淀或吸附為大顆粒的固體。在此過程中，用于吸附和沉淀用途的明礬，根據(jù)料液中懸浮物的含量不同采用不同的添加量，添加量為懸浮物含量的0.02-0.05%，靜置3-6小時(shí)。本案例中，靜置過程同樣是水解釜抽成真空或充入氮?dú)?，以避免酶解液中?xì)菌的滋生。S7、第四步酶解液分離本案例中，經(jīng)過靜置的料液通過一個(gè)平板式離心機(jī)，濾袋目數(shù)選用800目，離心機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)選用1000轉(zhuǎn)，得到澄清的氨基酸酶解料液。在此過程中，平板式離心的工藝參數(shù)需根據(jù)沉淀和大顆粒物的不同，選用600-1000目的濾袋，離心機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)選用800-3000轉(zhuǎn)。S8、將酶解澄清液經(jīng)過離子交換樹脂樁脫鹽和重金屬，再經(jīng)過超濾后，濃縮脫水，干燥，得到蛋白肽粉。本案例中，濃縮脫水和干燥均在大流量負(fù)壓真空下進(jìn)行，真空度達(dá)到-0.08，蛋白粉中的腥味降低80%。本實(shí)施例中選用了三步分離和靜置相結(jié)合的方法，對(duì)酶解液的提純工藝做了進(jìn)一步的改進(jìn)。該方法為純物理法，不同于常規(guī)一步分離、使用活性炭脫色的到酶解清液，避免了酶解液的二次污染。通過本實(shí)施例所提供的生產(chǎn)方法所得蛋白肽粉的成分含量如下表：三文魚蛋白肽粉質(zhì)量指標(biāo)純度（折算為蛋白%）97.5灼燒殘?jiān)?）2.5氮含量（以氮計(jì)）（%）15.6水分（%）2.518種氨基酸含量（%）85脂肪（%）0.1氨基酸態(tài)氮（%）7.595%蛋白粉分子量（道爾頓）＜3000衛(wèi)生指標(biāo)達(dá)到藥品國家標(biāo)準(zhǔn)要求重金屬砷（%）0.3mg/1000g通過上表所列參數(shù)，該蛋白肽粉完全滿足醫(yī)藥級(jí)蛋白肽粉的指標(biāo)要求，可以作為醫(yī)用級(jí)蛋白胨、保健品級(jí)魚蛋白粉和復(fù)合氨基酸粉的原料。當(dāng)前第1頁1 2 3