本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種具有抗甲型流感病毒活性的吡啶并吡唑酮類衍生物。

背景技術(shù)：

近年來流感病毒頻繁爆發(fā)，嚴(yán)重危害到人類和動物的生命健康。由于流感病毒抗原性轉(zhuǎn)變和抗原性漂移的存在，使流感病毒具有了極高的變異性，新型流感病毒的出現(xiàn)也對社會衛(wèi)生事業(yè)造成了巨大威脅。2013年我國多省(市)出現(xiàn)的高致病性H7N9流感病毒，就是一種新重組的禽流感病毒，確診感染病例的死亡率接近30％。近兩年，廣東等地又出現(xiàn)了人感染新型H5N6和H10N8等禽流感病毒的病例。因此，流感的防治，尤其是藥物治療，已迫在眉睫。

迄今為止，在全球臨床應(yīng)用的抗流感藥物神經(jīng)氨酸酶抑制劑和M2離子通道抑制劑兩類共5種，目前兩類藥物的耐藥病毒株均已經(jīng)出現(xiàn)。因此，目前函需探索新的藥物作用靶點(diǎn)，開發(fā)新的抗流感藥物，尋找新的治療方案。

流感病毒進(jìn)入抑制劑有望發(fā)展成為新型抗流感藥物。流感病毒通過其表面血凝素蛋白(HA)介導(dǎo)，首先是HA1亞基與靶細(xì)胞表面的唾液酸受體結(jié)合，通過胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞，在胞內(nèi)體的低pH環(huán)境下，HA2亞基發(fā)生構(gòu)象改變，使隱藏的融合肽暴露出來，插到胞內(nèi)體膜上，同時三分子HA2也形成類似六螺旋束的結(jié)構(gòu)，拉近病毒膜與胞內(nèi)體膜的距離而發(fā)生融合，形成融合孔，將病毒的核酸釋放到胞漿內(nèi)。阻斷病毒進(jìn)入靶細(xì)胞的過程，可以有效抑制流感病毒的感染。血凝素蛋白在這一過程中發(fā)揮重要作用，有望成為潛在的抗病毒藥物靶點(diǎn)，開發(fā)新的抗病毒藥物。

天然產(chǎn)物具有結(jié)構(gòu)的多樣性和生物活性的多樣性。天然產(chǎn)物及其衍生物在以往的疾病治療中發(fā)揮了無可限量的作用，也是當(dāng)今藥物研發(fā)過程中最具有潛力的資源之一。本發(fā)明首次合成一種吡啶并吡唑酮類衍生物，命名為化合物J1，具有顯著的抗甲型流感病毒的活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該化合物為研發(fā)出新型的抗甲型流感病毒的先導(dǎo)化合物，尋找新型結(jié)構(gòu)的抗流感病毒藥物提供了可能。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足之處而提供了一種化合物，3-(4-氯苯基)-4,5-二氫-1,4-二苯基-1氫-吡唑[3,4-b]吡啶-6(7氫)-酮，如式I所示，簡稱為化合物J1，所述化合物J1能夠抑制甲型流感病毒的進(jìn)入，從而為流感病毒性疾病的預(yù)防和治療提供一種新的途徑和手段，具有重要的研發(fā)價值和開發(fā)意義。本發(fā)明還提供了所述化合物J1的用途。

本發(fā)明一個方面提供了一種化合物，3-(4-氯苯基)-4,5-二氫-1,4-二苯基-1氫-吡唑[3,4-b]吡啶-6(7氫)-酮，其結(jié)構(gòu)如式I所示。

本發(fā)明另一個方面提供了一種式I所示化合物在制備抗流感病毒藥物中的應(yīng)用。

其中，所述流感病毒為甲型流感病毒，優(yōu)選為H1N1、H3N2、H5N1、H7N1、H7N2、H7N3、H7N7、H7N9、H9N2或H10N8。

本發(fā)明再一個方面提供了式I所示化合物在制備抑制H5N1和H7N9亞型假病毒進(jìn)入靶細(xì)胞的藥物中的應(yīng)用。

其中，所述式I所示化合物抗甲型流感病毒中的作用機(jī)制是靶向流感病毒血凝素HA2亞基，抑制流感病毒進(jìn)行膜融合，可以用于制備預(yù)防和治療流感的藥物。

本發(fā)明再一個方面提供了式I所示化合物的制備方法，其包括以下步驟：

1)將4-氯苯甲酰乙腈，苯肼加入水中，攪拌并加熱至回流；

2)回流0.5-5小時后，依次加入苯甲醛、米氏酸，在100℃下繼續(xù)攪拌至反應(yīng)完全；

3)以有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取，并合并有機(jī)相后去除溶劑，柱層析進(jìn)行純化后獲得式I所示化合物。

其中步驟2)中的有機(jī)溶劑選自乙酸乙酯。

本發(fā)明所述的化合物結(jié)構(gòu)式如下

上述所示的化合物J1能夠劑量依賴的抑制抗H5N1、H3N2、H1N1、H7N9亞型甲型流感病毒的進(jìn)入。

本發(fā)明所述的化合物J1靶向流感病毒血凝素HA2亞基，從而抑制流感病毒進(jìn)行膜融合，可以用于制備預(yù)防和治療流感的藥物。

本發(fā)明所述的化合物J1能作為先導(dǎo)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，獲得活性更好地化合物并制成抗流感病毒藥物。

本發(fā)明所述的化合物J1可用于制成抗甲型流感的藥物。結(jié)合現(xiàn)代常用藥物制劑手段，可將所述的化合物制成注射液、片劑、粉劑、顆粒劑、膠囊、口服液，從而采用比較方便的口服給藥形式，其中本發(fā)明化合物在所述藥物中的質(zhì)量百分比含量為1～20％。

上述各種劑型的藥物均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。

綜上所述，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果

1、本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)一種吡啶并吡唑酮類衍生物具有抗甲型流感病毒的作用，為流感病毒性疾病的預(yù)防和治療提供一種新的小分子天然藥物。

2、本發(fā)明所述的化合物J1在濃度范圍內(nèi)沒有細(xì)胞毒性。該化合物能夠劑量依賴的抑制H5N1、H3N2、H1N1、H7N9亞型甲型流感病毒的進(jìn)入，提供廣譜的抗病毒作用，可以用于制備預(yù)防和治療流感的藥物。

3、本發(fā)明所述的化合物具有吡啶并吡唑酮結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)新穎，目前未見該結(jié)構(gòu)的化合物抗流感病毒方面的報(bào)道，因此，可以作為先導(dǎo)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾。

4、本發(fā)明所述的化合物J1抗甲型流感病毒的作用機(jī)制為靶向流感病毒血凝素HA2亞基，從而抑制流感病毒進(jìn)行膜融合，可以用于制備預(yù)防和治療流感的藥物。

5、本發(fā)明所述的化合物J1可單獨(dú)制成抗流感病毒藥物。

附圖說明

圖1禽流感假病毒實(shí)驗(yàn)檢測化合物J1對H5N1和H7N9流感病毒假病毒的抑制效果。A.H5N1假病毒對MDCK細(xì)胞的感染性；B.化合物J1對多種H5N1假病毒的抑制活性；C.化合物J1對H7N9假病毒的抑制活性。

圖2 MST實(shí)驗(yàn)檢測化合物靶向流感病毒血凝素蛋白HA。

圖3血凝抑制實(shí)驗(yàn)測定化合物不能作用于流感病毒血凝素蛋白HA1。

圖4 ELISA實(shí)驗(yàn)測定化合物靶向流感病毒血凝素蛋白HA2。

具體實(shí)施方式

為了更好地理解本發(fā)明的內(nèi)容，下面結(jié)合具體實(shí)施方法對本發(fā)明內(nèi)容作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明的保護(hù)內(nèi)容不局限以下實(shí)施例。

本發(fā)明所用材料

293T細(xì)胞和犬腎細(xì)胞(MDCK)在包含有10％熱滅活胎牛血清(FBS)，50單位毫升青霉素和50微克/毫升鏈霉素(P/S)的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。MDCK在病毒感染后,在含有1微克/毫升的TPCK胰蛋白酶但不含有胎牛血清的MEM中培養(yǎng)。所有的人源H5N1假病毒，分別是A/Qinghai/59/2005，A/Xinjiang/1/2006，A/Anhui/1/2005，A/Hong Kong/156/1997，A/Thailand/Kan353/2004，A/VietNam/1194/2004。所用流感病毒株具體為：A/HongKong/415742/2009(H1N1)、A/Vietnam/1194/2004(H5N1)、A/Anhui/1/2013(H7N9)，分別在MDCK細(xì)胞中增殖并在本研究中使用。所有與活病毒相關(guān)試驗(yàn)是在生物安全2級或3級設(shè)施中進(jìn)行。

實(shí)施例1吡啶并吡唑酮類衍生物J1的合成方法

在5mL的圓底燒瓶中加入4-氯苯甲酰乙腈(1mmol，179mg)，苯肼(1mmol，108mg)，水(2mL)，攪拌，加熱至回流(100℃)，2小時后，依次加入苯甲醛(1mmol，106mg)，米氏酸(1mmol，144mg)，100℃下繼續(xù)攪拌，1小時后，停止反應(yīng)，加入乙酸乙酯(3×5mL)萃取并合并有機(jī)相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑后，柱層析分離提純。得到產(chǎn)物3-(4-chlorophenyl)-4,5-dihydro-1,4-diphenyl-1H-pyrazolo[3,4-b]pyridin-6(7H)-one，3-(4-氯苯基)-4,5-二氫-1,4-二苯基-1氫-吡唑[3,4-b]吡啶-6(7氫)-酮243mg，產(chǎn)率61％，為白色固體。

上述化合物表征如下：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.03-7.96(m,NH),7.71–7.42(m,8H,aromactic),7.33(dd,J＝13.9,6.4Hz,3H,aromatic),7.26(d,J＝7.3Hz,1H,aromatic),7.21(d,J＝7.3Hz,2H,aromatic),4.50(d,J＝5.7Hz,1H,CH),3.22(dd,J＝16.0,7.7Hz,1H,CH2),2.90(dd,J＝15.9,2.0Hz,1H,CH2).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ169.17,147.65,141.79,138.78,137.09,134.06,130.90,129.96,129.15,128.69,128.39,128.25,127.41,126.87,123.39,101.72,40.88,35.40,-0.07.EI(-)-MS m/z,calcd for C24H18ClN3O(M)399.87,found 398.57。

實(shí)施例2選擇性指數(shù)

選擇性指數(shù)是通過50％的細(xì)胞毒性濃度(CC₅₀)除以50％的病毒抑制濃度(IC₅₀)計(jì)算而來的，該指標(biāo)數(shù)值越高則指示該藥物有越好的臨床應(yīng)用前景。我們通過法測定了本發(fā)明所述化合物的CC₅₀，再通過H5N1禽流感假病毒試驗(yàn)或者活病毒實(shí)驗(yàn)確定IC₅₀值，最終得到了本發(fā)明所述化合物的選擇性指數(shù)。

實(shí)施例3體外抗H5N1禽流感假病毒的活性實(shí)驗(yàn)

假病毒實(shí)驗(yàn)是指將表達(dá)H5N1流感病毒包膜蛋白的HA質(zhì)粒、NA質(zhì)粒和表達(dá)熒光素酶(Luciferase)報(bào)告基因的vpr和env缺陷的pNL4-3.Luc.R-E-質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，組裝只能復(fù)制一次的H5N1禽流感假病毒。由于禽流感病毒進(jìn)入靶細(xì)胞的過程由包膜蛋白HA所介導(dǎo)，因此假病毒實(shí)驗(yàn)是一個高度敏感、客觀、安全的模擬真病毒進(jìn)入的實(shí)驗(yàn)體系，可用于評價化合物抑制流感病毒進(jìn)入靶細(xì)胞的活性。293T細(xì)胞由293細(xì)胞派生，同時表達(dá)SV40大T抗原，含有SV40復(fù)制起始點(diǎn)與啟動子區(qū)的質(zhì)?？梢詮?fù)制。293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率高，蛋白表達(dá)水平高，轉(zhuǎn)染后2-3天用堿性磷酸酶分析可較容易地檢測到表達(dá)的蛋白。瞬時轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞是過表達(dá)蛋白并獲得細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞外蛋白的便捷方式。

實(shí)施例4H5N1假病毒的制備

1)293T細(xì)胞培養(yǎng)：10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，1％谷氨酰胺，2％青/鏈霉素。將處于對數(shù)生長期的293T細(xì)胞以3x10⁵/ml密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，毎孔2ml，37℃，5％CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱過夜；

2)次日，待細(xì)胞密度達(dá)到孔底面積80％左右，按照PEI轉(zhuǎn)染試劑說明書步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染；在一支無菌小EP管中加入15μl PEI轉(zhuǎn)染試劑和200μl不含血清和雙抗的DMEM培養(yǎng)基，室溫混勻5min；

3)往PEI-DMEM混合液體中加入3μg pNL4-3R^-E^-Luc質(zhì)粒，1μg HA質(zhì)粒和1μg NA質(zhì)粒，混勻室溫靜置20min；

4)將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入細(xì)胞中，輕輕轉(zhuǎn)動六孔板，使其分布均勻；

5)37℃，5％CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，吸去6孔板上清，加入含有新鮮10％胎牛血清和雙抗的DMEM培養(yǎng)液；

6)37℃，5％CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24h，搜集細(xì)胞培養(yǎng)上清，離心，搜集病毒上清，分裝，保存于-80℃冰箱中。

實(shí)施例5假病毒感染能力測定

1)以每孔1×10⁴個MDCK細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37℃，5％CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h至細(xì)胞長成單層；

2)將收集的病毒原液用DMEM培養(yǎng)基2倍倍比稀釋，加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個稀釋度3個復(fù)孔，終體積為200μL。設(shè)置細(xì)胞對照，不加假病毒。

3)在37℃，5％CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48h后，棄去上清，用200μL/孔PBS緩沖溶液洗滌兩次；

4)按照熒光素酶檢測試劑盒說明書操作，檢測病毒的感染能力，每孔加入60μl的細(xì)胞裂解液，至于振蕩器上振蕩20min；

5)吸取50μl 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的細(xì)胞裂解液，加入到96孔平底熒光素酶檢測板中，然后同時加入50μl的熒光素酶底物；

6)用酶標(biāo)儀測熒光素酶的化學(xué)發(fā)光值。以細(xì)胞對照孔化學(xué)發(fā)光值的2.5倍作為cutoff值，化學(xué)發(fā)光值大于cutoff均視為陽性。

實(shí)施例6檢測化合物J1對多種H5N1毒株假病毒進(jìn)入的抑制作用

1)以每孔1×10⁴個MDCK細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37℃，5％CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；

2)將50μl 2倍倍比稀釋的樣品與50μl假病毒在37℃下孵育30min；

3)往96孔板中加入化合物和假病毒的混合物，在37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48小時；陽性對照藥物為CL-385319。

4)30min后，將病毒與樣品的混合物共同加入到96孔平底培養(yǎng)板中，在37℃，5％CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h；

5)在37℃，5％CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48h后，棄去上清，用PBS緩沖溶液洗滌兩次；

6)按照熒光素酶檢測試劑盒說明書操作，檢測病毒的感染能力，每孔加入60μl的細(xì)胞裂解液，至于振蕩器上振蕩20min；

7)吸取50μl 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的細(xì)胞裂解液，加入到96孔平底熒光素酶檢測板中，然后同時加入50μl的熒光素酶底物；

8)用酶標(biāo)儀測熒光素酶的化學(xué)發(fā)光值。

9)根據(jù)化學(xué)發(fā)光值的大小，判斷藥物抑制病毒進(jìn)入的活性。

化合物抑制率(％)＝[1-(E-N)/(P-N)]×100

E代表實(shí)驗(yàn)組的化學(xué)發(fā)光值，N代表陰性對照組的化學(xué)發(fā)光值，P代表陽性對照組的化學(xué)發(fā)光值。化合物的半數(shù)抑制濃度(IC₅₀)作為化合物的抗流感病毒活性的指標(biāo)。陽性對照藥為CL385319。

實(shí)施例7細(xì)胞毒性研究

采用細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)常用的XTT法。具體方法如下：

將MDCK細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100μl，細(xì)胞數(shù)為1×10⁴個/孔，待24h后長成完整單層，用DMEM將化合物稀釋成10個不同濃度，每孔加入100μl化合物，每孔總體積200μl，同時設(shè)正常細(xì)胞對照組置于37℃、5％CO₂溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)48h，加入含0.02μM PMS的0.5mg/ml的XTT 50μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h，酶標(biāo)儀于450nm處測定吸光度值，并進(jìn)一步計(jì)算半數(shù)細(xì)胞死亡濃度CC₅₀。

實(shí)施例8體外抗甲型流感活病毒的實(shí)驗(yàn)

本發(fā)明所述化合物針對多個亞型的流感病毒，包括H1N1、H3N2、H5N1、H7N9亞型的抗病毒效果進(jìn)行了測試。犬腎上皮細(xì)胞系MDCK的病毒感染效率高，增殖快，不易變異，是公認(rèn)的最適于甲，乙型流感病毒疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞系之一。具體方法如下：

在96孔板中MDCK細(xì)胞中，加入50μL不同濃度(40、20、10、5、2.5、1.25μM)的待測化合物，每孔加入50μL的流感病毒(MOI＝0.002)，在37℃,5％CO₂環(huán)境下培養(yǎng)1h后，洗去病毒和藥物，繼續(xù)加入含1μg/ml TPCK(除了H5N1毒株)的培養(yǎng)基100μL，繼續(xù)培養(yǎng)。24小時后，收集細(xì)胞上清液，并采用反轉(zhuǎn)錄-實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-quantitative PCR)技術(shù)測定病毒的低毒。實(shí)施例8本發(fā)明所述化合物神經(jīng)氨酸酶抑制實(shí)驗(yàn)

H5N1假病毒轉(zhuǎn)染的包膜蛋白包括血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)。為檢測樣品是否有神經(jīng)氨酸酶抑制劑作用，我們將采用碧云天公司的神經(jīng)氨酸酶抑制劑篩選試劑盒。對照藥物為扎那米韋。

1)在96孔熒光酶標(biāo)板內(nèi)每孔加入70μl神經(jīng)氨酸酶檢測緩沖液；

2)然后每孔加入10μl神經(jīng)氨酸酶，再每孔加入10μl待篩選的神經(jīng)氨酸酶抑制劑樣品，振動搖勻1min后與37℃孵育2min；

3)加入10μl的神經(jīng)氨酸酶熒光底物，再振動1min，37℃孵育20min進(jìn)行熒光測定。

實(shí)施例9微量熱泳動儀Microscale Thermophoresis(MST)

MST可以快速分析多種生物樣品的相互作用。該測量方法基于分子在溫度梯度場中的定向運(yùn)動，即“熱泳動”。熱泳動變化取決于分子的電荷、大小或者水化層的變化。我們檢測緩沖液固定的梯度試驗(yàn)中熒光分子的熱泳動。緩沖液保持固定的情況下，熱泳動的損耗或富集只與熒光分子的電荷、大小或者溶解熵的變化有關(guān)。梯度稀釋的非熒光分子結(jié)合到熒光標(biāo)記的分子上至少會引起電荷、大小和溶解熵三者之一的變化，這種變化會引起熱泳動變化，我們通過檢測熱泳動變化來定量結(jié)合。試驗(yàn)中，熒光分子濃度[A0]保持恒定，每次滴定時所使用的滴定劑濃度[T0]均有變化。測量中所得出的熒光信號值(方程1)直接與形成復(fù)合體的熒光分子部分相對應(yīng)，x＝[AT]/[A0]，該值可輕松與推導(dǎo)公式擬合，以得出Kd。在本報(bào)告的結(jié)果中，相對熒光分布值Fnorm以‰為單位，繪制成曲線圖。

在建立靶向血凝素蛋白的高通量篩選模型中，我們將熒光標(biāo)記(NT-647)共價結(jié)合到蛋白HA上(NHS結(jié)合)。MST試驗(yàn)中，保持NT-647標(biāo)記的蛋白HA濃度0.1μM不變，同時非標(biāo)記的化合物在200μM–0.39μM之間梯度稀釋。反應(yīng)溶液為PBS buffer(含有0.05％Tween-20；1％DMSO)。短時間的結(jié)合反應(yīng)后，將樣品裝載到MST NT115Premium毛細(xì)管中，通過Monolith NT115標(biāo)記型來測量。X軸的濃度單位為μM。

實(shí)施例10血凝抑制實(shí)驗(yàn)

流感病毒進(jìn)入靶細(xì)胞是由病毒包膜上的血凝素介導(dǎo)的。該蛋白由HA1和HA2兩個亞基組成，其中HA1亞基與靶細(xì)胞膜上的唾液酸受體結(jié)合，HA2則為跨膜亞基，介導(dǎo)病毒膜與胞內(nèi)體膜的融合。我們可以進(jìn)一步研究該化合物是否作用于血凝素蛋白HA1亞基，干擾其與靶細(xì)胞上的唾液酸受體結(jié)合?？刹捎醚种圃囼?yàn)。具體方法如下：

血凝實(shí)驗(yàn)(HA)：在96孔V型血凝板中1-11孔加入25μl PBS，第12孔加入50μl PBS，其次往第一孔加入25μl的H5抗原，然后再依次倍比稀釋至第11孔，最后每孔加入25μl的1％雞紅細(xì)胞，靜置30min左右，觀察雞紅細(xì)胞凝集情況，算出凝集單位。

血凝抑制實(shí)驗(yàn)(HI)：在96孔微量反應(yīng)板上，自左至右各孔加50μL不同稀釋度的待測化合物，然后加入4個血凝單位不同亞型的血凝素抗原(購自哈爾濱獸醫(yī)研究所)混勻后，每孔加入0.5％雞紅細(xì)胞懸液50μL，在振蕩器上振蕩，室溫下靜置10min后觀察結(jié)果，待對照孔紅細(xì)胞沉淀，即可進(jìn)行結(jié)果判定。紅細(xì)胞全部凝集，沉于孔底，平鋪呈網(wǎng)狀，即為100％凝集(++++)；不凝集者(-)紅細(xì)胞沉于孔底，呈點(diǎn)狀。該方法可以確定活性單體化合物是否作用于血凝素蛋白的HA1亞基受體結(jié)合區(qū)，抑制流感病毒與靶細(xì)胞的粘附。對照藥物為抗不同亞型血凝素的血清。

實(shí)施例11與血凝素蛋白HA2亞基結(jié)合

采用酶聯(lián)免疫吸附測定enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)實(shí)驗(yàn)。間接競爭ELISA分析方法將抗原物質(zhì)吸附在固相載體上，使待測小分子化合物與固相載體上的抗原競爭性的結(jié)合已知量的特異性抗體，檢測吸光度值。

具體方法為：

將2μg/mL His-HA2包被在96孔酶標(biāo)板上，每孔100μL，4℃吸附過夜；PBST洗滌后拍干；用含1％BSA的PBS封閉，每孔200μL，37℃孵育1h，PBST洗滌后拍干；將梯度稀釋的化合物J1和HA2的單克隆抗體IC9，每孔100μL加入到已封閉好的酶標(biāo)板中，37℃孵育1h，PBST洗滌后拍干。加入稀釋至工作濃度的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG和顯色底物，檢測吸光度值。不加藥物為陽性對照。

實(shí)施例12與血凝素蛋白HA2亞基結(jié)合作用機(jī)制的分子對接

為了闡明化合物與血凝素蛋白HA2亞基結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合模式，探討化合物阻止流感病毒進(jìn)入的機(jī)制，我們利用分子對接的方法進(jìn)行了研究。

發(fā)明人選取了H5N1HA晶體結(jié)構(gòu)PDB(2IBX)作為研究。因?yàn)镻DB(2IBX)是VN1194毒株的HA的晶體，我們將VN1194的HA蛋白序列與上述5種H5N1毒株的HA序列進(jìn)行比對，同源性高達(dá)95％，與A/Qinghai/59/2005的同源性更高達(dá)96.7％。

具體操作流程為：從Protein Data Bank上下載H5N1avian influenza A virus蛋白(PDB編號：2IBX，分辨率：)。采用USCF Chimera準(zhǔn)備蛋白和配體分子的結(jié)構(gòu)，去除溶劑分子，修補(bǔ)蛋白質(zhì)肽鏈。采用Dock Prep模塊添加氫原子，分別為蛋白和配體分子添加AMBERff4SB力場和AM1-BCC電荷。采用Chimera中的DMS工具以半徑為的探針生成蛋白的分子表面，使用sphgen模塊生成圍繞活性位點(diǎn)的球狀集合(Spheres)，使用Grid模塊生成Grid文件，該文件用于快速的基于Grid的能量打分評價。采用DOCK6程序進(jìn)行柔性對接(flxible docking)，生成1000個不同的構(gòu)象取向(orientation)以及獲得化合物與結(jié)合口袋中殘基間的靜電和范德華相互作用，并由此計(jì)算得到Grid打分。通過聚類分析(RMSD閾值為)，得到打分最佳的構(gòu)象。最后，通過Chimera分析計(jì)算結(jié)果，并采用PyMOL生成圖片。

試驗(yàn)結(jié)果本發(fā)明化合物具有抑制H5N1禽流感假病毒病毒進(jìn)入的活性

結(jié)果如圖1A所示，病毒原液2倍稀釋時化學(xué)發(fā)光值達(dá)到了10⁵，表明制備的H5N1假病毒具有很強(qiáng)的感染能力。通過檢查細(xì)胞裂解液的化學(xué)發(fā)光值，可以判定化合物的抑制活性。

從圖1B，可以知道本發(fā)明所述的化合物J1具有抑制H5N1禽流感病毒的效果，其選擇性指數(shù)見表1?；衔颙1對VSVG假病毒沒有抑制作用。由于這兩種假病毒的制備只是轉(zhuǎn)入的包膜蛋白質(zhì)粒不同，因此該化合物J1抗H5N1假病毒的靶點(diǎn)為血凝素蛋白或神經(jīng)氨酸酶。為判斷化合物J1抗H5N1禽流感假病毒的活性是否是由細(xì)胞毒性引起的，我們進(jìn)一步檢測該化合物J1的細(xì)胞毒性，如表1所示，用MTT實(shí)驗(yàn)檢測該化合物J1在抗流感活性濃度的情況下，對MDCK細(xì)胞沒有明顯的毒性作用。

隨后，測試了化合物J1對神經(jīng)氨酸酶活性的影響(數(shù)據(jù)未展示)。當(dāng)高濃度時，化合物J1對神經(jīng)氨酸酶活性沒有明顯的抑制作用，而陽性藥物組(扎那米韋)則對流感病毒神經(jīng)氨酸酶活性有明顯的抑制作用。這說明，該化合物J1抗甲型流感病毒活性的發(fā)揮不是通過此機(jī)制實(shí)現(xiàn)的。

表1.化合物J1抗H5N1禽流感假病毒感染的抑制活性

2本發(fā)明化合物體外抗甲型流感病毒的活性

研究表明，化合物J1對不同亞型甲型流感病毒有明顯的抑制作用，且存在明顯的量效關(guān)系，隨藥物濃度增加而抑制率升高。

表2化合物抗流感病毒活性

本發(fā)明化合物可與血凝素蛋白HA結(jié)合

為確證本發(fā)明所述化合物J1抗H5N1假病毒的靶點(diǎn)為血凝素蛋白，采用微量熱泳動儀MST進(jìn)行分析。如圖2所示吡唑并吡啶酮類化合物呈劑量依賴性的與血凝素蛋白發(fā)生相互作用，K_d值為0.54±0.181μΜ。表明該化合物可以和流感病毒的血凝素蛋白進(jìn)行結(jié)合，從而抑制流感病毒的進(jìn)入。

4本發(fā)明化合物不能作用于血凝素蛋白HA1亞基

流感病毒進(jìn)入靶細(xì)胞是由病毒包膜上的血凝素介導(dǎo)的。該蛋白由HA1和HA2兩個亞基組成，其中HA1亞基與靶細(xì)胞膜上的唾液酸受體結(jié)合，HA2則為跨膜亞基，介導(dǎo)病毒膜與胞內(nèi)體膜的融合。我們可以進(jìn)一步研究該化合物是否作用于血凝素蛋白HA1亞基，干擾其與靶細(xì)胞上的唾液酸受體結(jié)合。如圖3所示，該化合物的血凝抑制實(shí)驗(yàn)為陰性，表明化合物的作用位點(diǎn)不是HA1亞基上的唾液酸受體結(jié)合區(qū)域，因此其抑制流感病毒進(jìn)入的作用位點(diǎn)可能是HA2亞基。

5本發(fā)明化合物能作用于血凝素蛋白HA2亞基

如圖4所示，流感病毒血凝素蛋白HA2亞基能夠與化合物J1以特異性的方式結(jié)合。即HA2為化合物J1的靶點(diǎn)，化合物J1通過與HA2結(jié)合抑制了HA介導(dǎo)的流感病毒膜與宿主細(xì)胞膜的融合，從而抑制了流感病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞。

6本發(fā)明化合物靶向血凝素蛋白HA2亞基

根據(jù)H5N1的晶體結(jié)構(gòu)(2IBX)，莖部區(qū)域由G1₂、L2₂、K51₂、E105₂、R106₂、T107₂、L108₂、D109₂、F110₂、T22₁、M24₁、E25₁和R322₁氨基酸殘基組成。