本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種具有免疫調(diào)節(jié)功能的脾臟間充質(zhì)干細胞及其制備方法與應用。
背景技術(shù)：
：間充質(zhì)干細胞(mesenchymalstemcells,MSC)是一種具有多向分化潛能和高度自我更新能力的干細胞。MSC最早由Friedenstein等在骨髓中發(fā)現(xiàn)，隨后研究人員陸續(xù)在骨、臍帶、脂肪等多種組織中分離成功。MSC在適宜的條件下可以大量擴增，并且分化為成骨細胞、脂肪細胞、內(nèi)皮細胞、神經(jīng)細胞等多種組織類型的細胞，是目前組織工程領(lǐng)域最常用的種子細胞之一。此外，MSC還具有造血支持能力，能夠調(diào)節(jié)造血干細胞分化為多種譜系的造血細胞，是造血微環(huán)境的重要組成部分。更有意義的是，MSC還能夠調(diào)節(jié)多種免疫細胞的發(fā)育和功能，有助于維持機體免疫反應和免疫穩(wěn)態(tài)。脾臟是人和動物體內(nèi)最大的外周免疫器官。脾臟內(nèi)含有多種免疫細胞如巨噬細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞、樹突狀細胞和中性粒細胞等，是免疫細胞發(fā)育和成熟的重要器官之一，更是機體的體液免疫中心和細胞免疫中心。其中，樹突狀細胞能夠攝取機體內(nèi)的腫瘤抗原或者外源入侵的抗原，加工遞呈給相應的T淋巴細胞，促進相關(guān)的T淋巴細胞亞群增殖分化，并啟動B淋巴細胞為主的體液免疫，實現(xiàn)腫瘤清除和病原清除。脾臟內(nèi)免疫細胞的發(fā)育功能要受到脾臟微環(huán)境的調(diào)控。多種基質(zhì)細胞混合組成的脾臟基質(zhì)組織既為免疫細胞發(fā)育提供了空間依托，又表達多種活性分子調(diào)節(jié)免疫細胞功能，是脾臟微環(huán)境的重要組成部分。因此，脾臟基質(zhì)組織內(nèi)細胞對于免疫細胞發(fā)育和功能的調(diào)控一直是免疫學研究的熱點之一。但是，以往的研究多關(guān)注于脾臟內(nèi)皮源性基質(zhì)細胞和成纖維細胞等成體細胞的作用，對于處于發(fā)育源頭的脾臟間充質(zhì)干細胞(spleenmesenchymalstemcells,Sp-MSCs)是否參與免疫調(diào)控國內(nèi)外文獻報道不多。因此，建立一種高效可靠的Sp-MSCs分離培養(yǎng)方法成為當務之急。傳統(tǒng)的MSCs培養(yǎng)策略多為將組織消化為單細胞，然后培養(yǎng)單細胞并獲得MSC。但是，該策略應用到Sp-MSCs培養(yǎng)時卻遇到了難題，原因就是脾臟中富含有大量的造血細胞如巨噬細胞等，它們有較強的貼附于培養(yǎng)瓶皿的能力，難以通過傳代培養(yǎng)去除。摻雜在Sp-MSCs中的造血細胞常常會引起免疫反應，嚴重影響了相關(guān)的科學研究和應用。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的一個目的是提供一種脾臟間充質(zhì)干細胞的制備方法。本發(fā)明提供的脾臟間充質(zhì)干細胞的制備方法包括如下步驟：(1)碾磨離體的脾臟，去除造血細胞，得到脾臟基質(zhì)組織；(2)用膠原酶液將所述脾臟基質(zhì)組織進行消化處理，并在消化處理后去除所述脾臟基質(zhì)組織中的造血細胞，得到消化處理后脾臟基質(zhì)組織；(3)培養(yǎng)所述消化處理后脾臟基質(zhì)組織，即可得到脾臟間充質(zhì)干細胞。上述方法中，所述碾磨為用注射器柄碾磨；所述碾磨后還包括沖洗的步驟；所述沖洗的目的是去除碾磨后脾臟內(nèi)的造血細胞，具體方法為用PBS沖洗碾磨后脾臟；所述沖洗的次數(shù)為3-5次。上述方法中，所述用膠原酶液將所述脾臟基質(zhì)組織進行消化處理為將脾臟基質(zhì)組織浸泡于膠原酶液中；所述膠原酶液中膠原酶的質(zhì)量分數(shù)為0.1-0.15％。上述方法中，所述膠原酶為I型膠原酶、II型膠原酶或IV型膠原酶。上述方法中，所述膠原酶具體為II型膠原酶。上述方法中，所述膠原酶液由II型膠原酶、胎牛血清和α-MEM培養(yǎng)基混勻得到的培養(yǎng)基；所述胎牛血清在所述膠原酶液中的體積分數(shù)為15-20％。上述方法中，所述II型膠原酶在所述膠原酶液中的質(zhì)量分數(shù)具體為0.1％，所述胎牛血清在所述膠原酶液中的體積分數(shù)具體為15％。上述方法中，步驟(2)中，所述去除的方法為用吸管吸取消化后的所述脾臟基質(zhì)組織中的膠原酶液和消化釋放出來的造血細胞。上述方法中，所述消化處理的條件為35-38℃，5％CO2條件下消化0.5-4h。上述方法中，所述培養(yǎng)所用的培養(yǎng)液為將谷氨酰胺、胎牛血清和α-MEM培養(yǎng)基混勻后得到的溶液，所述谷氨酰胺在所述培養(yǎng)液中的濃度為1-2mmol/L，所述胎牛血清在所述培養(yǎng)液中的體積分數(shù)為10-15％。所述谷氨酰胺在所述培養(yǎng)液中的濃度具體為1mmol/L，所述胎牛血清在所述培養(yǎng)液中的體積分數(shù)具體為10％。本發(fā)明的另一個目的是提供上述方法制備得到的脾臟間充質(zhì)干細胞。本發(fā)明的最后一個目的是提供上述方法或上述脾臟間充質(zhì)干細胞的新用途。本發(fā)明提供了上述方法或上述脾臟間充質(zhì)干細胞在如下1)-3)中任一種中的應用：1)抑制T淋巴細胞增殖；2)抑制T淋巴細胞活化；3)抑制T淋巴細胞分泌炎性因子。上述應用中，所述炎性因子為IFN-γ和/或TNF-α和/或IL-17A。上述應用中，所述T淋巴細胞為同種異基因抗原誘導的T淋巴細胞或非特異性抗原誘導的T淋巴細胞。上述方法或上述應用中，所述脾臟為來源于小鼠、大鼠、兔、狗、豚鼠、羊、猴子等常用動物品系的離體的脾臟；所述動物的周齡可以是2～20周。本發(fā)明所具有的優(yōu)點和有益效果：(1)本發(fā)明方法操作簡單，方便實用；(2)本發(fā)明所獲得的Sp-MSCs純凈度高，造血污染少，有利于開展免疫學相關(guān)研究和體內(nèi)研究；(3)本發(fā)明方法所獲得的Sp-MSCs免疫調(diào)節(jié)能力強，可以抑制非特異抗原和同種異體抗原引起的T淋巴細胞增殖、活化和炎性細胞因子釋放。本發(fā)明首先采用研磨技術(shù)去除大部分的脾臟內(nèi)造血細胞，減少造血細胞貼壁造成的污染；其次，膠原酶可以特異地降解脾臟基質(zhì)組織中的膠原，松解組織結(jié)構(gòu)幫助Sp-MSCs遷移到培養(yǎng)瓶中；再次，膠原酶消化后，脾臟基質(zhì)組織表面殘留的造血細胞釋放出來，將這些造血細胞全部丟棄，僅僅培養(yǎng)消化后的脾臟基質(zhì)組織，可以顯著提高Sp-MSCs的純度。本發(fā)明以上述發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)，探索了去除造血細胞-消化基質(zhì)組織-傳代純化的策略，建立了一種從脾臟分離培養(yǎng)MSCs的方法，并分離獲得了大量細胞純凈度較高的Sp-MSCs，進一步發(fā)現(xiàn)該群Sp-MSCs具有強大的免疫調(diào)節(jié)能力，能夠抑制非特異抗原和同種異體抗原活化的T淋巴細胞增殖和活化，并抑制T淋巴細胞分泌炎性細胞因子。附圖說明圖1為分離消化脾臟基質(zhì)組織。圖1A為未消化的脾臟基質(zhì)組織，圖2B為膠原酶消化后的脾臟基質(zhì)組織。圖2為原代培養(yǎng)脾臟間充質(zhì)干細胞。圖2A為間充質(zhì)干細胞從脾臟基質(zhì)組織塊中爬出；圖2B為增殖良好的脾臟間充質(zhì)干細胞。圖3為脾臟間充質(zhì)干細胞的流式免疫表型。其中，縱坐標代表細胞數(shù)量，橫軸代表陽性率。圖4為脾臟間充質(zhì)干細胞多向分化。圖4A為脾臟間充質(zhì)干細胞成骨分化后堿性磷酸酶染色；圖4B為脾臟間充質(zhì)干細胞成脂肪分化后油紅O染色。圖5為Sp-MSCs抑制T淋巴細胞增殖。圖5A為Sp-MSCs抑制LTT實驗；圖5B為Sp-MSCs抑制MLR反應。其中，橫坐標代表熒光強度，縱坐標代表細胞數(shù)量，黑色峰代表的是未增殖的T淋巴細胞，藍色峰代表的是加入了ConA或者異基因抗原的刺激后，顯著增殖的T淋巴細胞，紅色峰代表的是Sp-MSCs抑制相應的T淋巴細胞增殖。圖6為Sp-MSCs抑制非特異抗原誘導的T淋巴細胞活化。圖6A為ConA刺激引發(fā)T淋巴細胞活化；圖6B為Sp-MSCs抑制CoA誘導的T淋巴細胞活化，(標尺等于200微米)。圖7為Sp-MSCs抑制同種異基因抗原誘導的T淋巴細胞活化。圖7A為同種異基因的抗原刺激引發(fā)T淋巴細胞活化；圖7B為Sp-MSCs抑制同種異基因抗原誘導的T淋巴細胞活化，(標尺等于200微米)。圖8為Sp-MSCs抑制非特異抗原活化的T淋巴細胞表達炎性細胞因子。圖9為Sp-MSCs抑制同種異基因抗原活化的T淋巴細胞表達炎性細胞因子。具體實施方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復實驗，結(jié)果取平均值。下述實施例中的PBS的配方為：NaCl(BeijingChemicalWorks,cat.no.XK-13-201-0001-218)8.0g，Na2HPO4.12H2O(BeijingChemicalWorks,cat.no.10020392)2.9g，KCl(BeijingChemicalWorks,cat.no.XK-13-201-0024-217)0.2g，KH2PO4(BeijingChemicalWorks,cat.no.XK-13-201-0024-113)0.24g，溶解于1升水。下述實施例中的所用抗體及其購買處和貨號為：PE-labeledanti-CD11b(eBioscience,cat.no.12-0112)；PE-labeledanti-CD29(eBioscience,cat.no.12-0291)；FITC-labeledanti-CD34(eBioscience,cat.no.11-0341)；PE-labeledanti-CD44(eBioscience,cat.no.12-0441)；FITC-labeledanti-CD45(eBioscience,cat.no.11-0451)；PE-labeledanti-CD105(eBioscience,cat.no.12-1051)；PE-labeledanti-stemcellantigen-1(Sca-1)(eBioscience,cat.no.12-5981)；PE-labeledanti-Ia(eBioscience,cat.no.12-5321)；FITC-labeledratIgG2bisotypecontrol(eBioscience,cat.no.11-4031)；PE-labeledratIgG2bisotypecontrol(eBioscience,cat.no.12-4031)；PE-labeledArmenianHamsterIgGisotypecontrol(eBioscience,cat.no.12-4888)；FITC-labeledratIgG2aisotypecontrol(eBioscience,cat.no.11-4321)；PE-labeledratIgG2aisotypecontrol(eBioscience,cat.no.12-4321)。下述實施例中的染色劑及其購買處和貨號為：油紅O粉劑(Sigma-Aldrich,cat.no.O0625-25G)；異丙醇(Sigma-Aldrich,cat.no.I9516)。下述實施例中的同種異基因的BALB/cl小鼠和C57BL/6小鼠均為北京維通利華公司的產(chǎn)品，SCXK(京)2012-0001。實施例1、一種分離培養(yǎng)Sp-MSCs的方法一、Sp-MSCs的分離與培養(yǎng)1、脾臟的分離取6～8周齡健康雌性C57小鼠，脫頸處死，75％酒精浸泡3-5分鐘后，無菌條件下分離脾臟，以剪刀和鑷子去凈表面組織，以鑷子取出完整的脾臟。2、去除脾臟內(nèi)造血細胞在超凈臺內(nèi)以注射器柄將其在培養(yǎng)皿中充分碾磨5分鐘，用PBS沖3-5遍，去除大部分的脾臟內(nèi)造血細胞，獲得脾臟基質(zhì)組織(圖1A)。3、膠原酶消化脾臟基質(zhì)組織和原代培養(yǎng)將步驟2中分離獲得的脾臟基質(zhì)組織置于膠原酶液中進行消化(一毫升膠原酶液放3-5只小鼠的脾臟基質(zhì)組織)，37℃消化0.5小時后，得到消化后的脾臟基質(zhì)組織(圖1B)，用吸管吸取消化后的脾臟基質(zhì)組織中的膠原酶液以及消化釋放出來的造血細胞，丟棄，并將消化后剩下的脾臟基質(zhì)組織種于培養(yǎng)液中進行原代培養(yǎng)。上述膠原酶液是將II型膠原酶(GIBCO,cat.no.17101015)、胎牛血清(GIBCO,cat.no.12664-025)和α-MEM培養(yǎng)基(Hyclone,cat.no.SH30265.01B)混勻后得到的溶液，其中，II型膠原酶在膠原酶液中的質(zhì)量分數(shù)為0.1％，胎牛血清在膠原酶液中的體積分數(shù)為15％。上述培養(yǎng)液為將谷氨酰胺(GIBCO,cat.no.35050-038)、胎牛血清和α-MEM培養(yǎng)基混勻后得到的溶液，其中，谷氨酰胺在培養(yǎng)液中的濃度為1mmol/L、胎牛血清在培養(yǎng)液中的體積分數(shù)為10％。4、擴增脾臟來源的MSCs(Sp-MSCs)將步驟3中消化后的脾臟基質(zhì)組織在35～38℃、5％CO2條件下培養(yǎng)72小時后用培養(yǎng)液首次全量換液，去除脾臟基質(zhì)組織，保留從脾臟基質(zhì)組織中遷移出的Sp-MSCs，即獲得Sp-MSCs。然后每隔兩天用培養(yǎng)液半量換液。當Sp-MSCs長滿70～80％培養(yǎng)瓶面積后消化傳代，連續(xù)傳代，取第4代Sp-MSCs進一步用于下述實驗研究。二、Sp-MSCs的形態(tài)學檢測將步驟一獲得的第4代Sp-MSCs在培養(yǎng)液中靜置培養(yǎng)3-5天左右，在倒置顯微鏡下觀察到有細胞從組織塊中爬出(圖2A)。這些細胞為梭形貼壁生長，經(jīng)過傳遞培養(yǎng)后，生長迅速，并可呈旋渦狀或者紡錘狀密集生長，符合經(jīng)典的MSC形態(tài)和生長特點(圖2B)。三、Sp-MSCs的免疫表型檢測將步驟一獲得的第4代Sp-MSCs進行表面標記檢測，分別檢測第4代Sp-MSCs的CD11b，CD29，CD34，CD44，CD45，CD105、Sca-1和Ia的表達情況。流式檢測的具體步驟如下：1、準備細胞用胰酶(GIBCO,cat.no.27250-018)消化步驟一獲得的第4代Sp-MSCs，制備成單細胞懸液，調(diào)整細胞數(shù)量至1×106細胞/流式管，洗凈后重懸至100μLPBS/流式管。2、抗體標記按照說明書要求，分別向流式管中加入如下熒光標記的抗體及對應同型對照：CD11b、CD45、Sca-1、CD29、CD31、CD34、CD44、CD86、CD105、Ia。4℃避光孵育30分鐘。MSCs免疫表型分析相關(guān)抗體及其使用濃度與對應同型對照抗體如表1所示。表1、MSCs免疫表型分析相關(guān)抗體及應用抗原熒光應用濃度對應同型對照CD11bPE0.5μg/millioncells.mL-1PE-RatIgG2bCD29PE1μg/millioncells.mL-1PE-ArmenianHamsterIgGCD34FITC1μg/millioncells.mL-1FITC-RatIgG2aCD44PE0.125μg/millioncells.mL-1PE-RatIgG2bCD45FITC0.25μg/millioncells.mL-1FITC-RatIgG2bCD105PE0.5μg/millioncells.mL-1PE-RatIgG2aSca-1PE0.5μg/millioncells.mL-1FITC-RatIgG2aIaPE0.02μg/millioncells.mL-1PE-RatIgG2bRatIgG2aisotypeantibodyPE1μg/millioncells.mL-1RatIgG2aisotypeantibodyFITC0.5μg/millioncells.mL-1RatIgG2bisotypeantibodyPE0.125μg/millioncells.mL-1RatIgG2bisotypeantibodyFITC0.5μg/millioncells.mL-13、流式分析加入熒光標記的抗體后用PBS洗細胞兩遍后，4℃，300g離心8分鐘，棄上清，取沉淀，上機分析。結(jié)果如圖3所示。從圖中可以看出，Sp-MSCs低表達造血細胞的標記CD11b，CD34，CD45，低表達共刺激分子Ia，高表達間質(zhì)組織標記CD29和CD44，高表達干細胞標記CD105和Sca-1。說明步驟一分離獲得的Sp-MSCs是一群間質(zhì)來源的非造血干細胞，且具有較低的免疫原性，符合經(jīng)典的MSC免疫表型特征。四、Sp-MSCs的多向分化能力檢測1、成骨分化將步驟一獲得的Sp-MSCs進行成骨分化，成骨分化后用堿性磷酸酶染色，顯微鏡下照相，觀察結(jié)果。具體步驟如下：(1)成骨誘導收獲步驟一獲得的第4代Sp-MSCs，按照1×104/孔種于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，分別在對照培養(yǎng)基和成骨誘導培養(yǎng)基中進行誘導培養(yǎng)，每2-3天換液。對照組培養(yǎng)基為將FBS與α-MEM培養(yǎng)基混勻得到的培養(yǎng)基，其中，F(xiàn)BS在對照組培養(yǎng)基中的體積分數(shù)為10％；成骨誘導培養(yǎng)基為將地塞米松(Sigma-Aldrich,cat.no.D2915)、β-磷酸甘油(Sigma-Aldrich,cat.no.G6251)、維生素C磷酸鹽(Sigma-Aldrich,cat.no.A8960)和α-MEM培養(yǎng)基混勻得到的培養(yǎng)基，其中，地塞米松在成骨誘導培養(yǎng)基中的濃度為10-7mol/L、β-磷酸甘油在成骨誘導培養(yǎng)基中的濃度為10mM，維生素C磷酸鹽在成骨誘導培養(yǎng)基中的濃度為50μM。(2)堿性磷酸酶染色誘導培養(yǎng)的第14天，去除培養(yǎng)基；采用商品化的堿性磷酸酶染色試劑盒(AlkalinePhosphataseKit，Sigma-Aldrich,cat.no.85L3R)染色：向培養(yǎng)板內(nèi)加入試劑盒自帶的固定液(檸檬酸40μL+去離子水2mL+丙酮3mL)固定30秒；再向培養(yǎng)板內(nèi)加入試劑盒自帶的染色液(堅牢蘭RR62.5μL+去離子水3mL+As-Mx125μL)；避光反應30分鐘；倒掉染液，加少量PBS，顯微鏡下照相。2、成脂分化收獲步驟一獲得的第4代Sp-MSCs進行成脂誘導分化，成脂誘導分化后用油紅O(Oil-red-O)染色，顯微鏡下照相，觀察結(jié)果。(1)成脂誘導分化收獲步驟一獲得的第4代Sp-MSCs，按照2×104/孔種于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，分別在對照培養(yǎng)基和成脂肪誘導培養(yǎng)基中誘導培養(yǎng)，每2-3天換液。對照組培養(yǎng)基為將FBS與α-MEM培養(yǎng)基混勻得到的培養(yǎng)基，其中，F(xiàn)BS在對照組培養(yǎng)體系中的體積分數(shù)為10％；成脂肪誘導培養(yǎng)基為將地塞米松(Sigma-AldrichcatnoD2915)、IBMX(Sigma-Aldrich,cat.no.I5879)，胰島素(Sigma-Aldrich,cat.no.I6634)和α-MEM培養(yǎng)基混勻得到的培養(yǎng)基，其中，地塞米松在成脂肪誘導培養(yǎng)基中的濃度為10-6mol/L、IBMX在成脂肪誘導培養(yǎng)基中的濃度為0.5μM，胰島素在成脂肪誘導培養(yǎng)基中的濃度為10ng/mL。(2)油紅O染色誘導培養(yǎng)的第14天，去除培養(yǎng)基；向培養(yǎng)板內(nèi)加入染色液(油紅O粉劑0.5g+異丙醇100mL)；避光反應15分鐘；倒掉染液，加少量PBS，顯微鏡下照相。結(jié)果如圖4A所示，在成骨誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)的小鼠Sp-MSCs堿性磷酸酶染色陽性，該結(jié)果表明本發(fā)明制備的Sp-MSCs具有成骨分化潛能。油紅O具有較好的脂肪結(jié)合能力。小鼠Sp-MSCs成脂肪誘導7天后，即可見細胞中逐漸出現(xiàn)大量脂肪滴，加入油紅O染色液之后，可觀察到脂肪滴被染為紅色，該結(jié)果表明小鼠脾臟MSC具有良好的成脂肪分化能力(圖4B)。五、Sp-MSCs的免疫調(diào)節(jié)能力檢測為了檢測本發(fā)明制備的Sp-MSCs是否具有免疫調(diào)節(jié)功能，將分離獲得T淋巴細胞與步驟一獲得的第4代Sp-MSCs共培養(yǎng)，并觀察培養(yǎng)后的T淋巴細胞增殖、活化以及分泌炎性細胞因子的情況。1、淋巴母細胞轉(zhuǎn)化實驗(lymphocytetransformationtest，LTT)(1)小鼠T淋巴細胞的分離無菌條件下以注射器柄碾磨鼠脾臟(來源于C57BL/6小鼠)，將獲得的粗制細胞懸液過200目鋼篩去除團塊，然后用Ficoll分離液(天津灝洋生物，20120218)以800g離心20min，棄上清，得到脾臟免疫細胞；再以PBS洗凈，將脾臟免疫細胞過填充有尼龍毛的50ml注射器，得到不貼附的細胞即為T淋巴細胞，流式檢測CD3細胞比例高于80％后用于下一步實驗。(2)CSFE法標記T淋巴細胞的制備CFSE是一種可以摻入細胞的熒光染料，隨著細胞增殖分裂，細胞所攜帶的熒光強度逐漸降低。細胞增殖的速度越快，其熒光強度衰減地越快。用熒光染料CFSE標記步驟1分離獲得的T淋巴細胞。具體步驟如下：將小鼠T淋巴細胞以含有體積分數(shù)為2％胎牛血清的PBS調(diào)整細胞密度為1×107個/ml，然后加入CFSE(Sigma，產(chǎn)品目錄號為21888-25MG-F)，使其濃度為10μm，避光染色20分鐘，以大量含有體積分數(shù)為2％胎牛血清的PBS重懸，洗滌，終止染色，得到CFSE標記的T淋巴細胞，用于后繼實驗。(3)ConA刺激T淋巴細胞以含有體積分數(shù)為2％胎牛血清的PBS調(diào)整CFSE標記的T淋巴細胞的密度為1×106個/ml，然后加入ConA(Sigma，產(chǎn)品目錄號為c2010-25MG)，使其濃度為2μg/ml，得到T淋巴細胞培養(yǎng)體系(T淋巴細胞的密度為1×106個/2mL)。(4)T淋巴細胞的培養(yǎng)按照是否向步驟(3)獲得的T淋巴細胞培養(yǎng)體系添加步驟一獲得的第4代Sp-MSCs分成如下兩組：1)LTT實驗組：向步驟(3)獲得的T淋巴細胞培養(yǎng)體系添加步驟一獲得的第4代Sp-MSCs，使Sp-MSCs細胞的密度為1×105個/2mL，共培養(yǎng)48h；2)LTT對照組：不添加Sp-MSCs，培養(yǎng)T淋巴細胞培養(yǎng)體系48h。收集上述實驗組和對照組的培養(yǎng)體系中懸浮的T淋巴細胞，用于下述實驗分析。(5)結(jié)果分析1)抑制T淋巴細胞增殖采用Beckman流式儀對步驟(4)獲得的LTT實驗組和LTT對照組的培養(yǎng)體系中懸浮的T淋巴細胞進行流式分析，每管收集50000個細胞。在LTT對照組中，T淋巴細胞受到ConA刺激之后，增殖迅速，熒光強度衰減明顯，而LTT實驗組中Sp-MSCs存在時，T淋巴細胞衰減的速度明顯減慢，表明T淋巴細胞增殖受到了抑制(圖5A)。2)Sp-MSCs抑制非特異性抗原誘導的T淋巴細胞活化采用倒置相差顯微鏡(Nikon，21560)對步驟(4)獲得的LTT實驗組和LTT對照組的培養(yǎng)體系中懸浮的T淋巴細胞進行觀察。ConA是一種非特異抗原，具有強大的活化T淋巴細胞能力。如圖6A所示，LTT對照組中，ConA刺激后，T淋巴細胞顯著活化，聚集成巨大的細胞團塊，而LTT實驗組中有Sp-MSCs存在時，這種活化作用受到顯著抑制，大多數(shù)T淋巴細胞為松散的單個細胞或者小細胞團(圖6B)。以上結(jié)果表明小鼠Sp-MSC可抑制非特異性抗原誘導的T淋巴細胞活化。3)抑制非特異抗原活化的T淋巴細胞分泌炎性因子為進一步觀察Sp-MSCs對T淋巴細胞的免疫功能影響，用定量PCR檢測了步驟(4)中各組T淋巴細胞表達的炎性細胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-17A的水平。引物序列為：小鼠干擾素γ(IFN-γ)：上游序列-5'-CTCATGGCTGTTTCTGGCTGTTA-3'，下游序列5'-GACGCTTATGTTGTTGCTGATGG-3'；小鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)：上游序列5′-CACTTGGTGGTTTGCTACGA-3，下游序列5′-GCCTCCCTCTCATCAGTTCTA-3′；小鼠白細胞介素17A(IL-17A)：上游序列5'-TCCAGAAGGCCCTCAGACTA-3'，下游序列5'-AGCATCTTCTCGACCCTGAA-3'；內(nèi)參GADPH上游序列5'-AAACCCATCACCATCTTCCA-3'，下游序列5'-GTGGTTCACACCCATCACAA-3'。上述引物均由上海生工生物合成。結(jié)果如圖8所示，和不加Sp-MSCs相比，加入Sp-MSCs后可明顯抑制LLT實驗組中T淋巴細胞內(nèi)IFN-γ、TNF-α和IL-17A的表達。2、混合淋巴細胞反應(mixedlymphocytesreaction，MLR)(1)混合淋巴細胞培養(yǎng)體系的制備按照步驟1中的方法，從同種異基因的BALB/cl小鼠中分離得到T淋巴細胞；將輻照過的(10Gy劑量的鈷-60照射)同種異基因的BALB/cl小鼠的T淋巴細胞、未照射過的C57BL/6小鼠的T淋巴細胞和2mL的培養(yǎng)基(含有體積分數(shù)為10％的FBS的α-MEM培養(yǎng)基)混勻，其中，同種異基因的BALB/cl小鼠的T淋巴細胞和C57BL/6小鼠的T淋巴細胞的細胞個數(shù)比為1:10，得到混合培養(yǎng)體系；(2)混合淋巴細胞培養(yǎng)體系的培養(yǎng)按照是否向混合培養(yǎng)體系添加步驟一獲得的第4代Sp-MSCs分成如下兩組：1)MLR實驗組：向混合培養(yǎng)體系中添加步驟一獲得的第4代Sp-MSCs，同種異基因的BALB/cl小鼠T淋巴細胞、C57BL/6小鼠的T淋巴細胞與Sp-MSCs細胞的個數(shù)比為1:10:1，共培養(yǎng)48h；2)MLR對照組：不添加Sp-MSCs，培養(yǎng)混合培養(yǎng)體系48h。收集上述實驗組和對照組的培養(yǎng)體系中懸浮的T淋巴細胞，用于下述實驗分析。(3)結(jié)果分析1)抑制T淋巴細胞增殖采用Beckman流式儀對步驟(2)獲得的MLR實驗組和MLR對照組的培養(yǎng)體系中懸浮的T淋巴細胞進行流式分析，每管收集50000個細胞。在MLR對照組中，同種異基因抗原也促使T淋巴細胞顯著增殖，與LLT結(jié)果相似，MLR實驗組中Sp-MSCs表現(xiàn)出了抑制T淋巴細胞增殖能力(圖5B)。2)Sp-MSCs抑制同種異基因抗原誘導的T淋巴細胞活化采用倒置相差顯微鏡(Nikon，21560)對步驟(2)獲得的MLR實驗組和MLR對照組的培養(yǎng)體系中懸浮的T淋巴細胞進行觀察。除了非特異性抗原之外，同種異基因抗原同樣可以活化T淋巴細胞。如圖7A所示，MLR對照組中，同種異基因的T淋巴細胞混合在一起之后，T淋巴細胞顯著活化，培養(yǎng)皿中可見多個巨大的細胞團塊，而MLR實驗組中，Sp-MSCs則可以顯著抑制這種活化作用。培養(yǎng)皿中的T淋巴細胞無法聚合為大細胞團塊，更多地變現(xiàn)為松散小細胞團(圖7B)。以上結(jié)果表明小鼠Sp-MSCs可抑制同種異基因抗原誘導的T淋巴細胞活化。3)抑制同種異基因抗原活化的T淋巴細胞分泌炎性因子為進一步觀察Sp-MSCs對T淋巴細胞的免疫功能影響，用定量PCR檢測了步驟(2)中各組T淋巴細胞表達的炎性細胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-17A的水平。引物序列同上。結(jié)果如圖9所示，和不加Sp-MSCs相比，加入Sp-MSCs后可明顯抑制MLR實驗組中T淋巴細胞內(nèi)IFN-γ、TNF-α和IL-17A的表達。當前第1頁1 2 3