本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鱘魚軟骨提取物的提取方法。

背景技術(shù)：

鱘魚是世界上唯一生活在水中的活化石，是所有魚類中營養(yǎng)價值最高的一種魚類。中國是鱘魚養(yǎng)殖最多、分布最廣、產(chǎn)量最高的國家，鱘魚全身遍布軟骨，鱘魚頭、脊索及鰭中含有的軟骨約占體重10%。軟骨又稱明骨、魚腦，是軟骨魚類鱘魚特有的組織，除供食用外，還具有獨特的保健藥用功效。本草拾遺記載：鯊魚翅、鱘魚骨，食之明目壯陽，延年益壽。軟骨組織中含豐富的硫酸軟骨素，是一種酸性粘多糖（糖胺多糖），鱘魚軟骨含量可達30%。經(jīng)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明，它有降血脂、抗動脈硬化、消炎鎮(zhèn)痛、恢復(fù)關(guān)節(jié)活動能力、增強人體軟骨彈性，抗衰老、耐疲勞等功能，因此軟骨提取物是一種很好的藥用來源。

創(chuàng)面是正常皮膚（組織）在外界致傷因子如外科手術(shù)、外力、熱、電流、化學(xué)物質(zhì)、低溫以及機體內(nèi)在因素如局部血液供應(yīng)障礙等作用下所導(dǎo)致的損害。常伴有皮膚完整性的破壞以及一定量正常組織的丟失，同時，皮膚的正常功能受損。每年全國受交通事故、意外跌落、動物咬傷、外科手術(shù)、戰(zhàn)爭等因素導(dǎo)致的創(chuàng)傷人群多達數(shù)百萬人，創(chuàng)傷成為不可忽視的疾病，因此促進創(chuàng)面愈合就成為疾病防治的重要手段。目前用于創(chuàng)面愈合的藥物主要有維生素類：維生素C注射液、維生素B12、維生素B2、維生素B6、泛酸等；微量元素類：鋅制劑類；中藥等有效成分：七葉皂苷鈉、殼聚糖等。然而上述產(chǎn)品獲得過程復(fù)雜，需要不斷地提取和純化，成本高，費用高，人員多。本研究轉(zhuǎn)向從飼養(yǎng)史氏鱘魚（主要產(chǎn)物魚子醬）副產(chǎn)物軟骨提取物具有消炎鎮(zhèn)痛的功效角度出發(fā)，利用鱘魚軟骨提取物研究了其促創(chuàng)面愈合的功效，對于進一步開拓鱘魚軟骨素市場及進一步研究利用其生理功能具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種促創(chuàng)面愈合的鱘魚軟骨提取物的提取方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

鱘魚軟骨提取物提取方法：

a、將鱘魚加水煮熟，剔除鱘魚上的魚肉等雜質(zhì)，烘干，將軟骨進行粉碎，粉碎后軟骨粉末轉(zhuǎn)至燒杯中，加入95%乙醇浸泡24h，去乙醇，軟骨重復(fù)用95%乙醇浸泡一次；50℃鼓風(fēng)干燥脫脂后的鱘魚軟骨，備用；

b、將上述鱘魚軟骨進行堿解，堿解溫度為40℃，堿解時間為3h，堿解溶液用量為鱘魚軟骨重量的6倍，堿解后將溶液調(diào)pH至中性，冷卻離心，獲得堿解液；

c、接著對堿解液進行鹽解，鹽解時間20min，鹽解溫度90℃，鹽解后將其冷卻離心；

d、接著離心后的鹽解液進行酶解，酶解pH8.5-8.9，酶解時間2.5h，酶解溫度40±2℃，酶解后，將酶解溫度調(diào)至80℃，加熱15min，使酶失活，冷卻離心，獲得酶解溶液；

e、將酶解溶液加入95％乙醇，體積比為酶解溶液：95%乙醇=1:3，邊加入邊攪拌；然后靜置沉淀1h，去除上清液，加入3wt.%NaCl至沉淀溶解，再按溶液：乙醇=1:3的體積比加入95％乙醇，邊加邊攪拌；然后靜置沉淀1h，去除上清液，所得沉淀物置于50℃減壓干燥箱干燥，粉碎，得到鱘魚軟骨提取物。

所述的步驟b、c、d中所用離心條件為3000rpm，10min。

所述的步驟b中所用堿種類為NaOH，堿濃度為5wt.％。

所述的步驟c中所用鹽種類為NaCl，加入NaCl使溶液中的鹽濃度為4 wt.％。

所述的步驟d中所用酶為胰蛋白酶，酶活力為200U，加入胰蛋白酶粉使溶液中的胰蛋白酶濃度為0.4 wt.%。

所述的方法制備獲得的鱘魚軟骨提取物。

所述的鱘魚軟骨提取物在制備促創(chuàng)面愈合藥物中的應(yīng)用。

采用本發(fā)明后可達到以下的效果：本發(fā)明將堿解、鹽解與酶解工藝結(jié)合，促進軟骨組織中蛋白質(zhì)分解，產(chǎn)品顏色為乳白色，粗產(chǎn)品得率為21％左右，其中葡萄糖醛酸的最高含量達34.28％。

本發(fā)明的優(yōu)點在于：

1、提供鱘魚軟骨提取物提取方法，將酶解、鹽解與堿解工藝相結(jié)合，優(yōu)化鱘魚軟骨提取物的提取工藝，提高鱘魚軟骨提取物的提取得率及質(zhì)量，促進其經(jīng)濟效益的提升。

2、提供鱘魚軟骨提取物促創(chuàng)面愈合的研究，用鱘魚軟骨提取物水溶液涂抹的小鼠創(chuàng)口比用生理鹽水涂抹愈合得早，生成的疤痕不明顯，再生皮膚光滑如常，創(chuàng)口的皮膚有毛發(fā)新生。

3、提供一種養(yǎng)殖鱘魚副產(chǎn)物—軟骨新的利用可能性，對于進一步開拓鱘魚軟骨素市場及進一步研究利用其生理功能具有重要意義。

附圖說明

圖1. 鱘魚軟骨提取物，其中硫酸軟骨素含量約為57%。

圖2. 左側(cè)創(chuàng)面：第5天涂抹紅霉素眼膏+生理鹽水。

圖3. 右側(cè)創(chuàng)面：第5天涂抹紅霉素眼膏+軟骨提取物。

圖4. 左側(cè)創(chuàng)面：第10天涂抹紅霉素眼膏+生理鹽水。

圖5. 右側(cè)創(chuàng)面：第10天涂抹紅霉素眼膏+軟骨提取物。

圖6. 左側(cè)創(chuàng)面：第15天涂抹紅霉素眼膏+生理鹽水。

圖7. 右側(cè)創(chuàng)面：第15天涂抹紅霉素眼膏+軟骨提取物。

圖8. 左側(cè)創(chuàng)面：第20天涂抹紅霉素眼膏+生理鹽水。

圖9. 右側(cè)創(chuàng)面：第20天涂抹紅霉素眼膏+軟骨提取物。

具體實施方式

實施例1

將清洗后的鱘魚軟骨進行堿解，堿種類為Na0H，堿濃度為5％，堿解時間3h，堿解溫度40℃，堿液用量約為鱘魚軟骨重量的6倍；堿解后將溶液調(diào)pH至中性，冷卻離心。將調(diào)至中性的堿解液用NaCl進行鹽解，加入NaCl使溶液中的鹽濃度為4％，鹽解溫度90℃，鹽解時間20min，鹽解后冷卻離心。取上清液加入 胰蛋白酶進行酶解，酶活力為200U，加入胰蛋白酶粉使溶液中的胰蛋白酶濃度為0.4%，酶解溫度40±2℃，酶解pH為8.5，酶解時間2.5h，酶解后，將酶解溫度調(diào)至80℃，加熱15min，使酶失活，冷卻離心。將酶解后的溶液按1:3(v/v)加入95％乙醇，邊加入邊用玻棒攪拌；然后靜置沉淀1h，去除上清液，加入3%NaCl至沉淀溶解，再按1:3的體積比加入95％乙醇，邊加入邊用玻棒攪拌；然后靜置沉淀1h，去除上清液，所得沉淀物置于50℃減壓干燥箱干燥，粉碎，得到白色鱘魚軟骨提取物粗品。粗產(chǎn)品得率為34.28％，其中氨基已糖的含量為34.28％。

實施例2

將清洗后的鱘魚軟骨進行堿解，堿種類為Na0H，堿濃度為6％，堿解時間4h，堿解溫度40℃，堿液用量約為鱘魚軟骨重量的7倍；堿解后將溶液調(diào)pH至中性，冷卻離心。將調(diào)至中性的堿解液用NaCl進行鹽解，加入NaCl使溶液中的鹽濃度為5％，鹽解溫度90℃，鹽解時間20min，鹽解后冷卻離心。取上清液加入 胰蛋白酶進行酶解，酶活力為200U，加入胰蛋白酶粉使溶液中的胰蛋白酶濃度為0.5%，酶解溫度50±2℃，酶解pH為8.9，酶解時間3h，酶解后，將酶解溫度調(diào)至80℃，加熱15min，使酶失活，冷卻離心。將酶解后的溶液按1:4(v/v)加入95％乙醇，邊加入邊用玻棒攪拌；然后靜置沉淀1h，去除上清液，加入4%NaCl至沉淀溶解，再按1:4的體積比加入95％乙醇，邊加入邊用玻棒攪拌；然后靜置沉淀1h，去除上清液，所得沉淀物置于50℃減壓干燥箱干燥，粉碎，得到白色鱘魚軟骨提取物粗品。粗產(chǎn)品得率為28.75％，其中氨基已糖的含量為24.83％。

實施例3

將清洗后的鱘魚軟骨進行堿解，堿種類為Na0H，堿濃度為7％，堿解時間5h，堿解溫度40℃，堿液用量約為鱘魚軟骨重量的6倍；堿解后將溶液調(diào)pH至中性，冷卻離心。將調(diào)至中性的堿解液用NaCl進行鹽解，加入NaCl使溶液中的鹽濃度為6％，鹽解溫度90℃，鹽解時間20min，鹽解后冷卻離心。取上清液加入 胰蛋白酶進行酶解，酶活力為200U，加入胰蛋白酶粉使溶液中的胰蛋白酶濃度為0.6%，酶解溫度60±2℃，酶解pH為8.6，酶解時間3.5h，酶解后，將酶解溫度調(diào)至80℃，加熱15min，使酶失活，冷卻離心。將酶解后的溶液按1:5(v/v)加入95％乙醇，邊加入邊用玻棒攪拌；然后靜置沉淀1h，去除上清液，加入5%NaCl至沉淀溶解，再按1:5的體積比加入95％乙醇，邊加入邊用玻棒攪拌；然后靜置沉淀1h，去除上清液，所得沉淀物置于50℃減壓干燥箱干燥，粉碎，得到白色鱘魚軟骨提取物粗品。粗產(chǎn)品得率為24.51％，其中氨基已糖的含量為19.56％。

實施例4

1.鱘魚軟骨提取物促創(chuàng)面愈合：

a、實驗藥物 鱘魚軟骨提取物（自制），用雙蒸餾水溶解，分別配制成40mg/ml、80mg/ml、120mg/m的水溶液?？瞻讓φ战M選擇生理鹽水。

b、實驗動物 昆明小鼠，SPF級，10只，雄雌各半，體重（20±2）g。將小鼠隨機分為3組，鱘魚軟骨提取物低劑量組（3只），鱘魚軟骨提取物中劑量組（3只），鱘魚軟骨提取物高中劑量組（3只）。

c、創(chuàng)傷模型實驗 各組小鼠用1％戊巴比妥鈉以80mg/kg（0.16ml）的劑量腹腔麻醉，剪毛處理，碘伏消毒，在小鼠頸背部中央制造4個縱行長lcm皮膚全層切口，左側(cè)2個創(chuàng)口，右側(cè)2個創(chuàng)口，單只分籠飼養(yǎng)。

d、創(chuàng)面處理 損傷模型建立后，用無菌紗布清理創(chuàng)口血污，然后各組小鼠右側(cè)創(chuàng)口分別用鱘魚軟骨提取物溶液(高中低溶液)，按0.1ml/只的劑量涂抹于相應(yīng)組小鼠的創(chuàng)口（外延至2-3mm，厚度約0.5mm)，左側(cè)創(chuàng)口涂藥，然后均勻涂抹紅霉素軟膏。一天涂兩次，共給藥21d。

e、常規(guī)觀察 術(shù)后第1、2、3 周觀察記錄創(chuàng)口的出血量及局部情況，創(chuàng)口愈合時間及愈合創(chuàng)面的特征。

在小鼠背部皮膚缺損修復(fù)處取材，所取皮膚包含2 mm 寬的正常皮膚邊緣。所取材料用10%中性福爾馬林固定，常規(guī)染色，石蠟脫片，切5μm厚切片，常規(guī)HE染色，顯微鏡下觀察新生肉芽組織中成纖維細(xì)胞的分布、膠原纖維的形態(tài)和排列疏密以及再上皮化狀況。給藥21天后，用鱘魚軟骨提取物水溶液涂抹的小鼠創(chuàng)口比用生理鹽水涂抹愈合得早，生成的疤痕不明顯，再生皮膚光滑如常，給藥21天后創(chuàng)口的皮膚有毛發(fā)新生。給予生理鹽水涂抹的創(chuàng)口愈合較晚，再生皮膚較粗糙，無毛發(fā)生長。

實驗藥物為步驟a的鱘魚軟骨提取物水溶液，而不是含鱘魚軟骨提取物的復(fù)方膜劑。

本實驗采用自身對照法，小鼠左右兩側(cè)的創(chuàng)口分別涂抹藥物和生理鹽水。

采用本發(fā)明后可達到以下的效果：用鱘魚軟骨提取物水溶液涂抹的小鼠創(chuàng)口比用生理鹽水涂抹愈合得早，生成的疤痕不明顯，再生皮膚光滑如常，給藥21天后創(chuàng)口的皮膚有毛發(fā)新生。給予生理鹽水涂抹的創(chuàng)口愈合較晚，再生皮膚較粗糙，無毛發(fā)生長。

小鼠創(chuàng)面愈合情況觀察（創(chuàng)面長度：mm)

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。