本發(fā)明涉及分子生物學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說，是一種基于illumina二代測序平臺的DNA文庫構(gòu)建試劑盒。
背景技術(shù)：
：Sanger法測序是一種利用利用DNA聚合酶來延伸結(jié)合在待定序列模板上的引物，通過摻入一種鏈終止核苷酸來完成測序。但由于其存在成本高、速度慢、通量低等不足，并不是最理想的測序方法。高通量測序技術(shù)(High-throughputSequencing)是對傳統(tǒng)Sanger測序(稱為一代測序技術(shù))革命性的改變，由于該種方法能夠一次同時對幾十萬到幾百萬核酸分子進(jìn)行序列測定，因此在有些文獻(xiàn)中稱其為二代測序技術(shù)(NextGenerationSequencing，NGS)。測序技術(shù)在生命科學(xué)研究中一直發(fā)揮著重要作用。隨著以于HiSeqX-10、MiSeq和Nextseq500為代表的第二代測序技術(shù)的快速發(fā)展，越來越多的生物學(xué)問題通過二代測序技術(shù)得以解決。如通過基因組重測序、Denovo測序、外顯子測序、轉(zhuǎn)錄組測序以及宏基因組測序等測序技術(shù)并結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)，使其在疾病檢測、分子育種、物種分析等方面發(fā)揮重要作用。本發(fā)明旨在提供一種操作簡單、快捷、使用成本低、序列覆蓋區(qū)域大，可高效制備用于illumina二代測序平臺的DNA文庫構(gòu)建試劑盒。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一個目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種基于illumina二代測序平臺的DNA文庫構(gòu)建試劑盒。本發(fā)明的第二個目的是，提供一種基于illumina二代測序平臺的超快速DNA文庫構(gòu)建方法。為實(shí)現(xiàn)上述第一個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：一種基于illumina二代測序平臺的DNA文庫構(gòu)建試劑盒，在打斷DNA樣品末端修復(fù)反應(yīng)中采用3-4酶的修飾酶系統(tǒng)進(jìn)行末端快速修復(fù)。進(jìn)一步，所述DNA樣品末端修復(fù)反應(yīng)結(jié)束后不經(jīng)過純化，直接加入鏈接buffer及T4DNA鏈接酶進(jìn)行接頭鏈接。進(jìn)一步，所述修飾酶為T4DNA聚合酶、T4多聚核苷酸激酶、TaqDNA聚合酶的組合；或者是T4DNA聚合酶、T4多聚核苷酸激酶、Klenow片段(3′→5′exo-)的組合；或者是T4DNA聚合酶、T4多聚核苷酸激酶、TaqDNA聚合酶、Klenow片段(3′→5′exo-)的組合。進(jìn)一步，所述修飾酶各組分濃度分別是2U-5UT4DNA聚合酶、5U-15UT4多聚核苷酸激酶、1U-5UTaqDNA聚合酶、1U-5UKlenow片段(3′→5′exo-)。進(jìn)一步，修飾溫度第一階段為20℃-25℃，第二階段為65℃-75℃。進(jìn)一步，修飾時間第一階段為5分鐘-40分鐘，第二階段為5分鐘-40分鐘。進(jìn)一步，所述DNA樣品末端修復(fù)反應(yīng)所用的修飾bufer含有2％-8％的PEG6000。進(jìn)一步，所述鏈接bufer含有2％-8％的PEG6000。為實(shí)現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：一種基于illumina二代測序平臺的超快速DNA文庫構(gòu)建方法，包括如下步驟：(1)采用Covaris超聲打斷系統(tǒng)將樣品基因組DNA打斷，樣本要求：1ng-1μg打斷的雙鏈DNA，溶于EB(10mMTris-HClpH8.0)或去離子水中；DNA純度要求：OD260/OD280＝1.8～2.0。(2)將步驟1打斷的DNA片段用多重DNA末端修復(fù)試劑進(jìn)行DNA末端修復(fù)；(3)向步驟2修復(fù)試劑的修復(fù)反應(yīng)液中加入文庫接頭及鏈接試劑進(jìn)行接頭鏈接；(4)DNA片段的選擇性回收：采用PCR產(chǎn)物分離和純化試劑，包括在PCR反應(yīng)液條件下AMPureXP磁珠與PCR產(chǎn)物的結(jié)合，分離出DNA產(chǎn)物，然后分別經(jīng)過80％乙醇漂洗、EB或去離子水洗脫得到純化的DNA片段；(5)PCR擴(kuò)增：采用多重PCR引物和多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)試劑進(jìn)行PCR擴(kuò)增。(6)PCR產(chǎn)物的純化：采用PCR產(chǎn)物分離和純化試劑，包括在PCR反應(yīng)液條件下AMPureXP磁珠與PCR產(chǎn)物的結(jié)合，而分離出DNA產(chǎn)物，然后分別經(jīng)過80％乙醇漂洗、EB或去離子水洗脫得到純化的DNA樣本；(7)文庫質(zhì)量檢測：通過Real-timePCR方法或使用熒光染料法對DNA文庫進(jìn)行定量。用瓊脂糖凝膠電泳或Agilent2100Bioanalyzer或FragmentAnalyzer全自動毛細(xì)管電泳系統(tǒng)檢測DNA文庫中的片段分布范圍。進(jìn)一步，所述步驟2中所用的修復(fù)試劑為：T4DNA聚合酶，T4多聚核苷酸激酶，TaqDNA聚合酶，Klenow片段(3′→5′exo-)，ATP，dATP，dCTP，dTTP，dGTP，Enhancer，10xT4DNA連接酶反應(yīng)緩沖液，修飾條件為22℃10分鐘，72度10分鐘；所述步驟3中文庫接頭Adapter濃度為15μM，若起始DNA樣本量少于100ng，Adapter濃度為1.5μM，所述鏈接試劑為ATP，Enhancer，10xT4DNA連接酶反應(yīng)緩沖液，鏈接溫度為20℃溫浴15min；所述步驟5中PCR擴(kuò)增反應(yīng)試劑為ExHiFiReactionBuffer，ExHiFiHotStartDNAPol，DMSO，Enhancer，dATP，dCTP，dTTP，dGTP；引物為Indexprimer，Univesialprimer。進(jìn)一步，所述的DNA片段回收是可選步驟，若起始樣本量低于50ng，不建議進(jìn)行DNA片段選擇性回收，可直接進(jìn)行DNA片段全純化。另外構(gòu)建不同大小片段的DNA文庫時，DNA片段選擇性回收的磁珠使用量不同。進(jìn)一步，所述PCR擴(kuò)增過程中，若樣本起始量為1μg時PCR循環(huán)數(shù)為6個循環(huán)，50ng時10個循環(huán)，5ng時14-15個循環(huán)，PCR循環(huán)數(shù)也可根據(jù)實(shí)驗需要進(jìn)行優(yōu)化。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明的試劑盒不但具有普通二代測序試劑盒的功能，而且末端補(bǔ)平，磷酸化，加dA尾一步完成，整個修飾過程只需要20分鐘完成，且不需要純化，直接加接頭。與一般建庫方法相比，該試劑盒操作簡單、方便，極大的縮短了文庫構(gòu)建時間。另外試劑盒所述的DNA片段分選法與一般建庫試劑盒相比，節(jié)約1/3的磁珠用量，減低了使用成本。再者所述PCR擴(kuò)增時，采用了高保真DNA聚合酶進(jìn)行文庫富集，無偏好的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)大了序列的覆蓋區(qū)域，可高效制備用于illumina二代測序平臺的DNA文庫。附圖說明附圖1是本發(fā)明的原理與操作簡示圖。附圖2是實(shí)施例1中AMPureXPbeads文庫分選純化反應(yīng)條件。附圖3是實(shí)施例1中文庫濃度換算方法。附圖4是實(shí)施例1中Agilent2100Bioanalyzer檢測DNA文庫中片段長度分布圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明記載的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。本發(fā)明技術(shù)方案的總體思路為：制備片段化DNA，片段化DNA的末端修復(fù)以及Adapter接頭的連接，連接Adapter后的DNA片段的選擇性回收，采用ExHiFi酶進(jìn)行快速擴(kuò)增DNA片段(15sec/1kb)，最大限度地保持?jǐn)U增質(zhì)量的保真性，縮短反應(yīng)時間。經(jīng)過多個PCR循環(huán)反應(yīng)后，回收DNA片段，用于文庫構(gòu)建測序(圖1)。實(shí)施例1一、試劑準(zhǔn)備1、EndPrepEnzymeMix的配制：試劑體積ulT4DNA聚合酶90T4多聚核苷酸激酶120TaqDNA聚合酶50Klenow片段(3′→5′exo-)40合計：300根據(jù)以上表格加入相應(yīng)試劑，混合后-20度保存?zhèn)溆谩?、5×EndRepairReactionBuffer的配制：試劑體積uldATP(100mM)2000dCTP(100mM)500dTTP(100mM)500dGTP(100mM)50010XT4DNA連接酶反應(yīng)緩沖液1300050％Enhancer7800ddH2O1700合計：26000根據(jù)以上表格加入相應(yīng)試劑，混合后-20度保存?zhèn)溆谩?、igaseBuffer的配制：根據(jù)以上表格加入相應(yīng)試劑，混合后-20度保存?zhèn)溆?0.55×篩選150bp插入片段)。4、2×ExHiFiPCRMasterMix的配制：試劑體積ulExHiFiReactionBuffer20000ExHiFiHotStartDNAPol1000ddH2O23800DMSO2000Enhancer2000dATP(100mM)300dCTP(100mM)300dTTP(100mM)300dGTP(100mM)300合計：50000根據(jù)以上表格加入相應(yīng)試劑，混合后-20度保存?zhèn)溆谩?、PCR引物及Adapter準(zhǔn)備：根據(jù)以上序列進(jìn)行合成序列，并配制Primer1/2的終濃度為12.5uM,IndexAdapter終濃度為25uM，混合后-20度保存?zhèn)溆谩６?、?shí)驗材料1)5ng-1μg打斷的雙鏈DNA；2)DNA純度要求：OD260/OD280＝1.8～2.0三、DNA末端修復(fù)、磷酸化并加dA尾反應(yīng)1)向PCR反應(yīng)管中依次加入以下試劑：2)用槍頭將上述溶液輕輕吹吸混勻，短暫離心,使所有組分收集到管底；3)將上述PCR管置于PCR儀中，熱蓋打開，反應(yīng)程序如下：22℃10min65℃10minholdon4℃在修飾bufer含有2％-8％的PEG6000。四、Adapter連接1)向上述已完成DNA修復(fù)的反應(yīng)液中直接加入以下試劑：LigaseBuffer14μlT4DNALigase2μlIndexAdapter2.5μl此時管中溶液總體積為83.5μl；2)用槍頭將上述試劑吹吸混勻混勻，短暫離心，使溶液收集到管底；3)20℃溫浴15min在鏈接bufer含有2％-8％的PEG6000。五、連接產(chǎn)物的純化A.片段長度不分選方案：1)漩渦震蕩混勻AMPureXPbeads；2)向連接反應(yīng)液中加入16.5μl去離子水，使連接反應(yīng)緩沖液體積至100μl；3)吸取100μl(1×)AMPureXPbeads至100μl連接產(chǎn)物中，使用移液器輕輕吹打10次充分混勻；4)室溫孵育5min；5)將反應(yīng)管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體。待溶液澄清(約5min)，小心移除上清，期間避免接觸已結(jié)合目標(biāo)DNA的磁珠；6)保持EP管始終處于磁力架中，加入200μl新鮮配制的80％乙醇漂洗磁珠(具體磁珠用量如附圖2所示)。室溫孵育30秒，小心移除上清：7)重復(fù)步驟6；8)保持EP管始終處于磁力架中，開蓋空氣干燥磁珠10min；9)將EP管從磁力架中取出，加入28μl滅菌超純水進(jìn)行DNA洗脫。漩渦震蕩或使用移液器輕輕吹打充分混勻。將反應(yīng)管短暫離心置于磁力架中分離磁珠和液體。待溶液澄清后(約5min)，小心吸取23μl上清至滅菌PCR管中；10)進(jìn)行文庫擴(kuò)增。B.片段大小分選1)渦旋震蕩混勻AMPureXPbeads；2)向連接反應(yīng)液中加入16.5μl雙蒸水，使連接反應(yīng)緩沖液體積至100μl；3)吸取55μl(0.55×)AMPureXPbeads至100μl連接產(chǎn)物中，使用移液器輕輕吹打10次充分混勻；4)室溫孵育5min；5)將反應(yīng)管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體。待溶液澄清后(大約5min)，小心轉(zhuǎn)移上清至干凈EP管中；6)吸取25μl(0.25×)AMPureXPbeads至上清中，使用移液器輕輕吹打10次充分混勻；7)室溫孵育5min；8)將反應(yīng)管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體。待溶液澄清后(大約5min)，小心移除上清；9)保持EP管始終處于磁力架中，加入200μl新鮮配制的80％乙醇漂洗磁珠。室溫孵育30秒，小心移除上清；10)重復(fù)步驟9；11)保持EP管始終處于磁力架中，開蓋空氣干燥磁珠10min；12)將EP管從磁力架中取出，加入28μl滅菌超純水進(jìn)行DNA洗脫。漩渦震蕩或使用移液器輕輕吹打充分混勻。將反應(yīng)管短暫離心置于磁力架中分離磁珠和液體。待溶液澄清后(約5min)，小心吸取23μl上清至滅菌PCR管中；13)進(jìn)行文庫擴(kuò)增。除此之外，接頭連接產(chǎn)物也可使用柱純化或膠回收試劑盒進(jìn)行純化，最終使用同樣體積的滅菌超純水或者洗脫緩沖液洗脫。六、PCR產(chǎn)物擴(kuò)增1)在PCR管中加入以下試劑并混勻2)PCR反應(yīng)條件注意：建議1μg樣本起始量時PCR循環(huán)數(shù)為6個循環(huán)，50ng時10個循環(huán)，5ng時15個循環(huán)，PCR循環(huán)數(shù)也可根據(jù)實(shí)驗需要進(jìn)行優(yōu)化。七、PCR產(chǎn)物的純化1)渦旋震蕩混勻AMPureXPbeads；2)吸取45μl(0.9×)AMPureXPbeads至PCR產(chǎn)物(50μl)中，使用移液器輕輕吹打混勻；3)室溫孵育5min；4)將反應(yīng)管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體。待溶液澄清(約5min)，小心移除上清，期間避免接觸已結(jié)合目標(biāo)DNA的磁珠；5)保持EP管始終處于磁力架中，加入200μl新鮮配制的80％乙醇漂洗磁珠。室溫孵育30秒，小心移除上清；6)重復(fù)步驟5；7)保持EP管始終處于磁力架中，開蓋空氣干燥磁珠10min；8)將EP管從磁力架中取出，加入30μl滅菌超純水進(jìn)行DNA洗脫。漩渦震蕩或使用移液器輕輕吹打充分混勻。將反應(yīng)管短暫離心置于磁力架中分離磁珠和液體。待溶液澄清后(約5min)，小心吸取25μl上清至滅菌PCR管中；9)將制備好的DNA文庫置于-20℃保持。除此之外，接頭連接產(chǎn)物也可使用柱純化或膠回收試劑盒進(jìn)行純化，最終使用同樣體積的滅菌超純水或者洗脫緩沖液洗脫。八、文庫濃度為了得到高質(zhì)量的測序結(jié)果，需要對DNA文庫進(jìn)行精確定量，首先推薦使用Real-timePCR方法對DNA文庫進(jìn)行絕對定量。此外，還可使用熒光染料法，如Qubit法，此處請勿使用基于吸光度測量的定量方法。最終可使用附圖3近似公式換算DNA文庫的摩爾濃度。九、文庫長度分布制備好的DNA文庫可用瓊脂糖凝膠電泳、Agilent2100Bioanalyzer或FragmentAnalyzer全自動毛細(xì)管電泳系統(tǒng)檢測DNA文庫中的片段長度分布范圍(圖4)。十、文庫結(jié)構(gòu)5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT[TargetSequence]TGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’NNNNNNNN：index,8bases以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3