本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，具體涉及一種發(fā)酵乳桿菌及其應(yīng)用。

發(fā)明背景

飼料中添加抗生素能夠抵抗疾病，促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)，加快集約化畜牧業(yè)的發(fā)展。但是隨著人們對(duì)綠色、安全和環(huán)保理念的不斷加強(qiáng)和對(duì)健康程度的不斷重視，抗生素添加劑在給人們帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)利益的同時(shí)其負(fù)面效應(yīng)也逐漸凸顯，最典型的特征就是抗生素引起的耐藥性、內(nèi)源性感染、二重感染以及藥物殘留，這些將對(duì)養(yǎng)殖業(yè)、飼料工業(yè)和動(dòng)物帶來(lái)嚴(yán)重威脅，進(jìn)而通過(guò)食物鏈危及人類健康。因此，限制乃至禁止飼料行業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)使用抗生素的呼聲越來(lái)越高，研究和開(kāi)發(fā)新的抗生素替代品刻不容緩。

近年來(lái)，益生菌因其安全、無(wú)毒、無(wú)殘留、不誘發(fā)耐藥性且對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)具有顯著作用而被作為抗生素替代品的首要選擇。乳酸桿菌是益生菌中的主要菌種，它是動(dòng)物消化道棲生微生物，在防治胃腸道感染、調(diào)節(jié)免疫功能和調(diào)節(jié)腸道的微生物菌群平衡中具有較好作用，是一種很有前途的益生素生產(chǎn)菌種。

目前，乳酸菌類產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)利用已成為我國(guó)飼料行業(yè)發(fā)展的一個(gè)新趨勢(shì)，但也存在一些亟待解決的問(wèn)題。如益生效果不佳、產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定、活菌數(shù)量不夠、抗逆性差等。因此，篩選益生性能好、耐受能力強(qiáng)、繁殖速度快、質(zhì)量穩(wěn)定的乳酸桿菌類產(chǎn)品，對(duì)提高產(chǎn)品的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力以及促進(jìn)畜牧業(yè)的發(fā)展都非常有意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種具有較強(qiáng)的耐酸和耐膽鹽能力，對(duì)大腸桿菌及金黃色葡萄球菌均有明顯抑菌效果的發(fā)酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)dj8a。

本發(fā)明的發(fā)酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)dj8a，其于2016年11月15日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心(gdmcc)，地址：中國(guó)廣州市先烈中路一百號(hào)省微生物所實(shí)驗(yàn)樓五樓，郵編：510070，保藏編號(hào)：gdmccno.60112。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供發(fā)酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)dj8a在制備抗菌藥物中的應(yīng)用。

所述的抗菌藥物是抗金黃色葡萄球菌或大腸桿菌的藥物。

本發(fā)明的發(fā)酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)dj8a具有較強(qiáng)的耐酸和耐膽鹽能力，對(duì)大腸桿菌及金黃色葡萄球菌均有明顯抑菌效果，因此能用于制備抗菌藥物，具有廣闊的市場(chǎng)前景。

本發(fā)明的發(fā)酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)dj8a，其于2016年11月15日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心(gdmcc)，地址：中國(guó)廣州市先烈中路一百號(hào)省微生物所實(shí)驗(yàn)樓五樓，郵編：510070，保藏編號(hào)：gdmccno.60112。

附圖說(shuō)明：

圖1為本發(fā)明的發(fā)酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)dj8a在mrs培養(yǎng)基上培養(yǎng)的菌落形態(tài)特征。

圖2為本發(fā)明的發(fā)酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)dj8a顯微形態(tài)特征。

圖3為本發(fā)明的發(fā)酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)dj8a的發(fā)酵上清液對(duì)大腸桿菌的抑菌能力，1：發(fā)酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)dj8a的發(fā)酵上清液；2：菌株dj9b的發(fā)酵上清液；②：ph4.45mrs空白培養(yǎng)基；③：ph6.60mrs空白培養(yǎng)基。

圖4為本發(fā)明的發(fā)酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)dj8a的發(fā)酵上清液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌能力，1：發(fā)酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)dj8a的發(fā)酵上清液；2：菌株dj9b的發(fā)酵上清液；②：ph4.45mrs空白培養(yǎng)基；③：ph6.60mrs空白培養(yǎng)基。

具體實(shí)施方式：

以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的簡(jiǎn)單改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

實(shí)施例1：菌株的分離純化

購(gòu)買廣州先烈中路菜市場(chǎng)所售發(fā)酵風(fēng)味食品(酸菜、酸豆角、梅菜)，加適當(dāng)?shù)纳睇}水進(jìn)行無(wú)菌研磨，用生理鹽水將研磨液稀釋至合適濃度，取3個(gè)適宜稀釋度的菌液涂布caco3-mrs(蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉4g，磷酸氫二鉀2g，檸檬酸三銨2g，乙酸鈉5g，葡萄糖20g，碳酸鈣20g，吐溫-801.08g，硫酸鎂0.2g，硫酸錳0.05g，三級(jí)水定容至1l，調(diào)ph至7.2，滅菌備用)平板，37℃厭氧培養(yǎng)48h。挑取溶鈣圈較大的菌落在mrs(配方如上，無(wú)碳酸鈣)平板上劃線分離，反復(fù)純化。將純化后的菌落進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢及h2o2接觸酶試驗(yàn)，挑出無(wú)芽孢、接觸酶陰性的革蘭氏陽(yáng)性菌株，置于10％的甘油管中，-80℃保存?zhèn)溆?。本試?yàn)共分離到81株溶鈣圈較大、接觸酶陰性、無(wú)芽孢的革蘭氏陽(yáng)性菌株。

用濃度為6mol/l的鹽酸調(diào)節(jié)mrs液體培養(yǎng)基(蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉4g，磷酸氫二鉀2g，檸檬酸三銨2g，乙酸鈉5g，葡萄糖20g，吐溫-801.08g，硫酸鎂0.2g，硫酸錳0.05g，三級(jí)水定容至1l，調(diào)ph至7.2，滅菌備用)ph至4.0、3.0、2.5。將初篩獲得的乳酸菌進(jìn)行活化并培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，按體積比2％的接種量分別接種至ph為4.0、3.0、2.5的mrs液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)24h，以未接種的培養(yǎng)基為對(duì)照，測(cè)各組菌液的od600nm值，選取耐酸性能較好的乳酸菌進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)48株乳酸菌可在ph4.0的mrs液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，10株乳酸菌能夠在ph3.0環(huán)境下生長(zhǎng)，其中菌株dj8a和dj10c在ph3.0環(huán)境下生長(zhǎng)良好。

上述試驗(yàn)純化所得的菌株均保存于廣東省微生物菌種保藏中心。

實(shí)施例2：菌株耐酸、耐膽鹽試驗(yàn)

選取可在ph3.0生長(zhǎng)的菌株，重新培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，按體積比2％接種量接種至含有0.1％、0.2％、0.3％膽鹽的mrs液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)24h，以相應(yīng)膽鹽含量的未接種培養(yǎng)基為對(duì)照，測(cè)各組菌液的od600nm值，選取耐膽鹽性能較好的乳酸菌進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，實(shí)施例1中所提到的10株可在ph3.0環(huán)境下生長(zhǎng)的菌株均能在0.1％的牛膽鹽中生長(zhǎng)，但均不能在0.2％及0.3％牛膽鹽中生長(zhǎng)，其中菌株dj8a在0.1％的牛膽鹽中生長(zhǎng)良好。

實(shí)施例3菌種鑒定

(1)形態(tài)學(xué)鑒定：將篩選獲得的菌株涂布分離于mrs平板上，37℃厭氧培養(yǎng)24h后觀察其菌落特征；取單菌落涂片，革蘭氏染色，顯微鏡下觀察其個(gè)體形態(tài)。

菌株dj8a在mrs平板上37℃培養(yǎng)48h后，菌落呈圓形、扁平、白色，表面光滑、濕潤(rùn)，邊緣整齊，直徑3-4mm(圖1)；菌株dj8a的顯微形態(tài)特征為短桿狀，單個(gè)、成對(duì)或成長(zhǎng)鏈，不產(chǎn)芽孢、革蘭氏陽(yáng)性(圖2)。

(2)16srrna分子鑒定：

采用ctab法提取待鑒定菌株dj8a的基因組dna，采用細(xì)菌16srrna通用引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增。將pcr產(chǎn)物送到上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果提交genbank進(jìn)行blast比對(duì)分析。

菌株dj8a的16srrna基因序列經(jīng)測(cè)序(其序列如seqidno.1所示)、分析，比對(duì)，結(jié)果與已報(bào)道的發(fā)酵乳桿菌lactobacillusfermentumcect562(t)的16srrna基因序列同源性達(dá)到99.65％，鑒定其為發(fā)酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)dj8a，其于2016年11月15日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心(gdmcc)，地址：中國(guó)廣州市先烈中路一百號(hào)省微生物所實(shí)驗(yàn)樓五樓，郵編：510070，保藏編號(hào)：gdmccno.60112。

實(shí)施例4發(fā)酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)dj8a產(chǎn)酸能力及抑菌能力考察

(1)產(chǎn)酸能力：將發(fā)酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)dj8a進(jìn)行活化培養(yǎng)48h，挑取單菌落分別接種至ph6.60和ph3.85的mrs液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)15h，4℃，10000rpm離心10min，取上清液并測(cè)定ph值，以未接種的mrs液體培養(yǎng)基做同等處理，作為空白對(duì)照。

培養(yǎng)15h后，發(fā)酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)dj8a可使ph6.60和ph3.85的mrs液體培養(yǎng)基ph分別降至4.49和3.34。

(2)抑菌能力：取發(fā)酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)dj8a的發(fā)酵上清液，以大腸桿菌及金黃色葡萄球菌作為指示菌，以調(diào)至相應(yīng)ph的mrs培養(yǎng)基為對(duì)照，以na作為培養(yǎng)基，使用牛津杯打孔法進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。按1％接種量重新轉(zhuǎn)接大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，28℃，180rpm振蕩培養(yǎng)17h，其菌體濃度約為10⁷cfu/ml，取培養(yǎng)好的大腸桿菌2ml或金黃色葡萄球菌2ml與200ml經(jīng)融化后保持在45℃左右的na培養(yǎng)基混勻，在無(wú)菌平板上放置4個(gè)滅過(guò)菌的牛津杯，用無(wú)菌移液管吸取20ml覆蓋平板。凝固后取出牛津杯，分別加入100ul的乳酸菌上清液樣品或調(diào)至相應(yīng)ph的mrs對(duì)照培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，菌株dj8a的發(fā)酵上清液(ph4.49)對(duì)大腸桿菌及金黃色葡萄球菌均有明顯抑菌效果(表1，圖3，圖4)。

表1發(fā)酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)dj8a發(fā)酵上清液的抑菌能力

實(shí)施例5發(fā)酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)dj8a耐酸和耐膽鹽考察

配制ph2.0無(wú)膽鹽的mrs液體培養(yǎng)基和ph6.6且含0.3％膽鹽的mrs液體培養(yǎng)基，將在37℃已厭氧培養(yǎng)15h的發(fā)酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)dj8a菌液，按體積比1％接種量分別轉(zhuǎn)接至ph2.0的mrs液體培養(yǎng)基和含0.3％膽鹽的mrs液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)3h和6h，取合適的稀釋倍數(shù)進(jìn)行涂布平板，每組重復(fù)三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，37℃培養(yǎng)48h后，選擇菌落數(shù)30-300范圍的平板進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

結(jié)果表明發(fā)酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)dj8a可在ph3.0或含0.1％膽鹽環(huán)境下生長(zhǎng)，在ph2.0或含0.3％膽鹽條件下處理3h，活菌數(shù)仍在10⁷cfu/ml以上，處理6h，活菌數(shù)仍在10⁶cfu/ml以上，說(shuō)明菌株dj8a具有較強(qiáng)的耐酸和耐膽鹽能力(表2)。

表2發(fā)酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)dj8a耐酸和耐膽鹽特性

序列表

<110>廣東省微生物研究所（廣東省微生物分析檢測(cè)中心）

<120>一種發(fā)酵乳桿菌及其應(yīng)用

<160>1

<210>1

<211>861

<212>dna

<213>發(fā)酵乳桿菌（lactobacillusfermentum）dj8a

<400>1

tgcagtcgaacgcgttggcccaattgattgatggtgcttgcacctgattgattttggtcg60

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