本發(fā)明涉及斑馬魚，尤其是涉及卵母細胞表達mCherry蛋白斑馬魚家系構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

斑馬魚具有易于養(yǎng)殖、體外受精、胚胎透明、生活史短等優(yōu)點，是研究脊椎動物早期發(fā)育的模型動物。在基礎(chǔ)科學研究中，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，讓熒光蛋白特異地表達在組織器官中，已成為一種重要的研究手段。很多實驗中，用使用熒光蛋白來標記在不同性別斑馬魚中差異表達的基因的方法來研究斑馬魚的生殖生物學的方法已經(jīng)被廣泛使用。

本發(fā)明應用了Tol2轉(zhuǎn)座子體系，來構(gòu)建卵母細胞特異表達mCherry熒光蛋白的斑馬魚家系，以期為斑馬魚生殖生物學的研究提供實用的工具。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供卵母細胞表達mCherry蛋白斑馬魚家系構(gòu)建方法。

本發(fā)明包括以下步驟：

1)zpc啟動子的克隆，具體方法如下：

取20mg新鮮斑馬魚肌肉，按海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒的方法提取基因組DNA；根據(jù)NCBI上已報道的斑馬魚zpc啟動子基因序列，設(shè)計一對引入酶切位點的特異引物：

Zpc0.5：RFP-fw2：5’-GTGGCTAAGCAAAATCCCCATGACATGCTGC-3’(下劃線部分為BlpI酶切位點)；

Zpc0.5：RFP-rv1：5’-GCGGGATCCATTGCCTGCTGACTAATTAAACC-3’(下劃線部分為BamHI酶切位點)；

以斑馬魚基因組DNA為模板，進行PCR擴增，擴增片段經(jīng)切膠回收后進行TA克隆連入pMD19T(Simple)質(zhì)粒，氨芐青霉素篩選，得到pMD19T-zpc單克隆，搖菌，提取質(zhì)粒，測序鑒定；

在步驟1)中，所述PCR擴增的反應條件可為：94℃預變性3min，每個循環(huán)包括94℃變性30s，57℃復性30s，72℃延伸1min，共34個循環(huán)，最后1個循環(huán)結(jié)束后再72℃延伸10min。

2)pminiTol2-zpc-mCherry表達載體的構(gòu)建，具體方法如下：

用限制性內(nèi)切酶BlpI/BamHI雙酶切pMD19T-zpc，切膠回收帶有酶切位點的zpc啟動子片段；用限制性內(nèi)切酶HindIII/BamHI雙酶切pminiTol2-Mlc2f-mCherry質(zhì)粒，切膠回收pminiTol2-mCherry骨架，再將zpc啟動子片段連接到pminiTol2-mCherry骨架、測序鑒定得到pminiTol2-zpc-mCherry質(zhì)粒；

3)體外合成Tol2轉(zhuǎn)座酶加帽mRNA，具體方法如下：

用限制性內(nèi)切酶BamHI酶切pT3TS-Tol2質(zhì)粒，切膠回收得到線性片段，然后使用mMESSAGE T3試劑盒進行體外轉(zhuǎn)錄得到Tol2轉(zhuǎn)座酶加帽mRNA，Nanodrop2000測定濃度；

4)mCherry轉(zhuǎn)基因斑馬魚家系的建立，具體方法如下：

產(chǎn)卵前一天性成熟雌雄魚以1∶(1～2)比例配對，放在同一繁殖缸中并用隔板隔開，第二天08：00拿掉隔板進行配對產(chǎn)卵；收集發(fā)育到1～2細胞期的胚胎后，將含有質(zhì)粒pminiTol2-zpc-mCherry和Tol2轉(zhuǎn)座酶加帽mRNA的液體注射到受精卵中，注射后的受精卵放在E3培養(yǎng)液中培養(yǎng)；孵化后轉(zhuǎn)至魚房繼續(xù)培養(yǎng)，在注射后于熒光顯微鏡下觀察篩選具有mCherry熒光信號的胚胎個體，作為zpc-mCherry轉(zhuǎn)基因魚F0代進行孵化培養(yǎng)，F(xiàn)0代魚性成熟后與野生型斑馬魚配對，從而篩選出可傳代F1代雜合個體，并將其培養(yǎng)至性成熟后再進行同質(zhì)配對，最終獲得卵母細胞穩(wěn)定表達mCherry熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因斑馬魚家系。

在步驟4)中，所述質(zhì)粒pminiTol2-zpc-mCherry可采用濃度為50ng/μL的質(zhì)粒pminiTol2-zpc-mCherry；所述Tol2轉(zhuǎn)座酶加帽mRNA可采用濃度為50ng/μL的Tol2轉(zhuǎn)座酶加帽mRNA；所述質(zhì)粒pminiTol2-zpc-mCherry和Tol2轉(zhuǎn)座酶加帽mRNA的液體總體積可為2nL；所述E3培養(yǎng)液的組成可為：5mmol/L NaCl，0.17mmol/L KCl，0.33mmol/L CaCl₂，0.33mmol/L MgSO₄；所述培養(yǎng)可置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；所述繼續(xù)培養(yǎng)可孵化后轉(zhuǎn)至28℃魚房繼續(xù)培養(yǎng)；所述于熒光顯微鏡下觀察可在注射后28天左右于熒光顯微鏡下觀察。

本發(fā)明首先采用PCR的方法，從斑馬魚基因組中得到了zpc基因(Zona Pellucida，zpc)的啟動區(qū)序列，再利用pminiTol2-Mlc2f-mCherry載體，進而構(gòu)建pminiTol2-zpc-mCherry轉(zhuǎn)基因表達載體。最后通過對斑馬魚胚胎進行顯微注射的方法，構(gòu)建了一個卵母細胞特異表達mCherry熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因斑馬魚家系。

附圖說明

圖1為pminiTol2-Mlc2f-mCherry表達載體的構(gòu)建流程圖。

圖2為各個時期的zpc-mCherry轉(zhuǎn)基因斑馬魚家系。在圖2中，A、B為28日齡雌性幼魚腹部；C、D為3月齡成魚卵巢組織。

具體實施方式

1.1 材料

1.1.1 菌種與載體

Escherichia.coli DH5α菌株購自Takara公司(貨號9057)、pminiTol2-Mlc2f-mCherry質(zhì)粒均來自本實驗室，pMD19T(Simple)質(zhì)粒購自Takara公司，Tol2轉(zhuǎn)座子體系質(zhì)粒pminiTol2、pT3TS-Tol2購自Addgene公司。

1.1.2 酶與化學試劑

海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒購自TIANGEN公司，限制性內(nèi)切酶、T4連接酶購自NEB公司，mMESSAGE T3(AM1348)試劑盒購自Ambion公司；

1.1.3 實驗動物

試驗用斑馬魚屬于Tuebingen家系，在本實驗長年繁育。

1.1.4 主要儀器設(shè)備

PCR儀(Mastercycler nexus，eppendorf公司)，離心機(Centrifuge 5424，eppendorf公司)，熒光體式顯微鏡(M165FC，Leica公司)，氣動皮升泵(PV830，WPI公司)，顯微注射儀(M-152，Narishige公司)，立體解剖顯微鏡(S6D，Leica公司)，Nanodrop 2000(Thermo scientific公司)。

1.2 方法

1.2.1 zpc啟動子的克隆

取20mg新鮮斑馬魚肌肉，按海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒的方法提取基因組DNA；根據(jù)NCBI上已報道的斑馬魚zpc啟動子基因序列，設(shè)計一對引入酶切位點的特異引物：

Zpc0.5：RFP-fw2：5’-GTGGCTAAGCAAAATCCCCATGACATGCTGC-3’(下劃線部分為BlpI酶切位點)；

Zpc0.5：RFP-rv1：5’-GCGGGATCCATTGCCTGCTGACTAATTAAACC-3’(下劃線部分為BamHI酶切位點)。

以斑馬魚基因組DNA為模板，進行PCR擴增，反應條件如下：94℃預變性3min，每個循環(huán)包括94℃變性30s，57℃復性30s，72℃延伸1min，共34個循環(huán)，最后1個循環(huán)結(jié)束后再72℃延伸10min。擴增片段經(jīng)切膠回收后進行TA克隆連入pMD19T(Simple)質(zhì)粒，氨芐青霉素篩選，得到pMD19T-zpc單克隆，搖菌，提取質(zhì)粒，測序鑒定。

1.2.2 pminiTol2-zpc-mCherry表達載體的構(gòu)建

用限制性內(nèi)切酶BlpI/BamHI雙酶切pMD19T-zpc，切膠回收帶有酶切位點的zpc啟動子片段。用限制性內(nèi)切酶HindIII/BamHI雙酶切pminiTol2-Mlc2f-mCherry質(zhì)粒，切膠回收pminiTol2-mCherry骨架。再將zpc啟動子片段連接到pminiTol2-mCherry骨架、測序鑒定得到pminiTol2-zpc-mCherry質(zhì)粒。

1.2.3 體外合成Tol2轉(zhuǎn)座酶加帽mRNA

用限制性內(nèi)切酶BamHI酶切pT3TS-Tol2質(zhì)粒，切膠回收得到線性片段，然后使用mMESSAGE T3試劑盒進行體外轉(zhuǎn)錄得到Tol2轉(zhuǎn)座酶加帽mRNA，Nanodrop2000測定濃度。

1.2.4 mCherry轉(zhuǎn)基因斑馬魚家系的建立

產(chǎn)卵前一天性成熟雌雄魚以1∶(1～2)比例配對，放在同一繁殖缸中并用隔板隔開，第二天早上燈亮后(08：00)拿掉隔板進行配對產(chǎn)卵；收集發(fā)育到1～2細胞期的胚胎后，將含有質(zhì)粒pminiTol2-zpc-mCherry(50ng/μL)和Tol2轉(zhuǎn)座酶加帽mRNA(50ng/μL)的液體(總體積為2nL)注射到受精卵中。注射后的受精卵放在E3培養(yǎng)液(5mmol/L NaCl，0.17mmol/L KCl，0.33mmol/L CaCl₂，0.33mmol/L MgSO₄)，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。孵化后轉(zhuǎn)至28℃魚房繼續(xù)培養(yǎng)。在注射后28天左右于熒光顯微鏡下觀察篩選具有mCherry熒光信號的胚胎個體，作為zpc-mCherry轉(zhuǎn)基因魚F0代進行孵化培養(yǎng)。F0代魚性成熟后與野生型斑馬魚配對，從而篩選出可傳代F1代雜合個體，并將其培養(yǎng)至性成熟后再進行同質(zhì)配對，最終獲得卵母細胞穩(wěn)定表達mCherry熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因斑馬魚家系。

1、pminiTol2-zpc-mCherry質(zhì)粒：

以斑馬魚基因組DNA為模板，進行PCR擴增zpc啟動子片段，所得片段經(jīng)切膠回收后進行TA克隆連入pMD19T(Simple)質(zhì)粒，氨芐青霉素篩選，得到pMD19T-zpc質(zhì)粒。用限制性內(nèi)切酶BlpI/BamHI雙酶切pMD19T-zpc和pminiTol2-Mlc2f-mCherry質(zhì)粒，切膠回收帶有酶切位點的zpc啟動子片段以及pminiTol2-mCherry骨架。再將zpc啟動子片段連接到pminiTol2-mCherry骨架、從而得到pminiTol2-zpc-mCherry質(zhì)粒。

經(jīng)測序，pminiTol2-zpc-mCherry質(zhì)粒的核苷酸序列如下：

注：單下劃線為斑馬魚zpc基因的啟動區(qū)序列，雙下劃線為編碼mCherry熒光蛋白的基因序列

2、zpc-mCherry轉(zhuǎn)基因斑馬魚家系的建立

收集發(fā)育到1～2細胞期的斑馬魚胚胎，將含有質(zhì)粒pminiTol2-zpc-mCherry(50ng/μL)和Tol2轉(zhuǎn)座酶加帽mRNA(50ng/μL)的液體(總體積為2nL)注射到受精卵中。注射后的受精卵放在E3培養(yǎng)液(5mmol/LNaCl，0.17mmol/L KCl，0.33mmol/L CaCl₂，0.33mmol/L MgSO₄)，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，孵化后在28℃魚房培養(yǎng)。在注射后28天后于熒光顯微鏡下觀察篩選具有mCherry熒光信號的胚胎個體，作為zpc-mCherry轉(zhuǎn)基因魚F0代進行培養(yǎng)。F0代魚性成熟后與野生型斑馬魚配對，從而篩選出可傳代的F1代雜合個體，并將其培養(yǎng)至性成熟后再進行內(nèi)交配對，最終獲得卵母細胞穩(wěn)定表達mCherry熒光蛋白的斑馬魚純合轉(zhuǎn)基因家系。

該家系基因組中含有zpc-mCherry核苷酸片段，具體核苷酸序列如下：

注：單下劃線為斑馬魚zpc基因的啟動區(qū)序列，雙下劃線為編碼mCherry熒光蛋白的基因序列。