本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域的一種金黃色葡萄球菌凍干制備用新型復(fù)合保護(hù)劑。

背景技術(shù)：

金黃色葡萄球菌是引起細(xì)菌性食物中毒的重要病原菌之一，廣泛分布于自然界，是一種可以引起人類(lèi)和動(dòng)物化膿感染的重要致病菌，也是造成人類(lèi)食物中毒的常見(jiàn)致病菌之一。目前在食品、化妝品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中已將金黃色葡萄球菌的檢驗(yàn)作為常規(guī)檢驗(yàn)項(xiàng)目。

金黃色葡萄球菌多以?xún)龈煞鄣男问焦?yīng)市場(chǎng)，國(guó)內(nèi)外廣泛采用的金黃色葡萄球菌凍干保護(hù)劑有可溶性淀粉、脫脂奶粉、海藻糖、乳糖、麥芽糊精、谷氨酸鈉、抗壞血酸鈉、維生素C等。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，以脫脂奶粉為單一保護(hù)劑，凍干后金黃色葡萄球菌存活率不足50%，而以可溶性淀粉、脫脂奶粉、海藻糖、麥芽糊精、谷氨酸鈉、抗壞血酸鈉、磷酸鹽緩沖液作為菌種復(fù)方冷凍干燥保護(hù)劑，凍干后金黃色葡萄球菌存活率也只有51.74%。這些保護(hù)劑的保護(hù)效果都不夠理想，而實(shí)際上，凍干保護(hù)劑的作用會(huì)隨保護(hù)劑的組成和配比表現(xiàn)出一定的差異性，因此，開(kāi)發(fā)性質(zhì)獨(dú)特、作用高效的金黃色葡萄球菌凍干保護(hù)劑具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在提供一種能有效提高金黃色葡萄球菌凍干制備過(guò)程存活率的新型復(fù)合保護(hù)劑。

本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種金黃色葡萄球菌凍干制備用新型復(fù)合保護(hù)劑，包括海藻糖、谷氨酸鈉、L-半胱氨酸鹽酸鹽和牛血清白蛋白。

一種金黃色葡萄球菌凍干制備用新型復(fù)合保護(hù)劑，以質(zhì)量體積百分比計(jì)，包括以下組分：

海藻糖2%-6%、谷氨酸鈉12%-18%、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5%-1.5%、牛血清白蛋白0.25%-0.75%。

所述的金黃色葡萄球菌凍干制備用新型復(fù)合保護(hù)劑，優(yōu)選，以質(zhì)量體積百分比計(jì)，包括以下組分：

海藻糖2%、谷氨酸鈉15%、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5%、牛血清白蛋白0.5%。

本發(fā)明中涉及到的百分號(hào)“%”，若未特別說(shuō)明，均指質(zhì)量體積百分比；溶液的百分比，除另有規(guī)定外，均指溶液100ml中含有溶質(zhì)若干克。

若未特別說(shuō)明，本發(fā)明中涉及到的溶液的溶劑均為水。

本發(fā)明的一種金黃色葡萄球菌凍干制備用新型復(fù)合保護(hù)劑的有益效果如下：

復(fù)合保護(hù)劑中加入海藻糖可以替代細(xì)胞中的水分子與細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)上的親水基團(tuán)形成水合鍵，保證了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定，同時(shí)海藻糖還可以提高菌懸液的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，使菌懸液形成玻璃態(tài)，使敏感性物質(zhì)嵌入到玻璃態(tài)中，從而保護(hù)細(xì)胞；谷氨酸鈉在凍干過(guò)程中可以與水作用使干粉保留微量的水分，以滿足微生物細(xì)胞維持生命的最低需求，此外谷氨酸鈉還具有抗氧化的作用，抑制三酰甘油的氧化和自由基的形成，防止對(duì)細(xì)胞膜造成不可逆的破壞；L-半胱氨酸是唯一具有活性巰基（-SH）的氨基酸，具有還原性，在凍干過(guò)程中，氨基酸的氨基團(tuán)與微生物細(xì)胞蛋白質(zhì)的羰基作用，可以使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；血清白蛋白是一種經(jīng)典、優(yōu)良的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑，可以使蛋白質(zhì)活性不受損失，對(duì)凍干過(guò)程中的大多數(shù)蛋白都具有保護(hù)作用。

綜上，本發(fā)明提供的金黃色葡萄球菌凍干制備用新型復(fù)合保護(hù)劑，結(jié)合糖類(lèi)、蛋白類(lèi)保護(hù)劑和抗氧化劑，使其達(dá)到增效、協(xié)同的作用，有效提高了金黃色葡萄球菌凍干粉的存活率，可以達(dá)到99.82%。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和實(shí)質(zhì)的前提下，凡是對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案進(jìn)行的修飾或者替換，均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范疇中。

實(shí)施例中涉及到的金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）標(biāo)準(zhǔn)菌株（CICC 21600）由中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供。

在實(shí)施例中，菌粉的制備及凍干存活率的計(jì)算采用如下方式：在常規(guī)的適宜條件下轉(zhuǎn)接復(fù)活菌株后搖瓶擴(kuò)增，將穩(wěn)定初期菌懸液6000rpm離心10min，棄上清，留菌泥用等量生理鹽水洗滌，6000rpm離心10min，棄上清，將得到的菌泥與保護(hù)劑混勻，取1ml按10倍遞增稀釋法稀釋?zhuān)x擇適宜稀釋度傾注法計(jì)數(shù)，其余菌液分裝西林瓶， -80℃預(yù)凍2-3h，然后真空冷凍干燥16-18h，壓蓋，下機(jī)，-20℃保藏。結(jié)束干燥后，隨機(jī)取3瓶立即復(fù)水，用1.1ml生理鹽水使其溶解完全，取1ml按前述方法計(jì)數(shù)，計(jì)算凍干前后的活菌數(shù)之比，即保護(hù)劑對(duì)于菌種的凍干存活率。

實(shí)施例1

本實(shí)施例的金黃色葡萄球菌凍干制備用新型復(fù)合保護(hù)劑的組成為：海藻糖2g、谷氨酸鈉12g、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5g、牛血清白蛋白0.25g、蒸餾水100ml。

其制備方法：

1）按量在蒸餾水中添加2g的海藻糖、12g的谷氨酸鈉，113℃滅菌15min，冷卻至室溫；

2）按量將0.5g的L-半胱氨酸鹽酸鹽、0.25g的牛血清白蛋溶解于蒸餾水中，然后用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌；

3）將步驟1）、2）所制備的溶液混合，并調(diào)整水的總質(zhì)量體積百分比為100%，得到金黃色葡萄球菌復(fù)合凍干保護(hù)劑。

將金黃色葡萄球菌活化培養(yǎng)、離心、洗滌后，收集菌泥，在凍干前與保護(hù)劑混合，分裝，于-80℃預(yù)凍3h，然后冷凍干燥18h，得到金黃色葡萄球菌菌粉。經(jīng)檢測(cè)金黃色葡萄球菌菌粉的凍干存活率為94.10%。

實(shí)施例2

本實(shí)施例的金黃色葡萄球菌凍干制備用新型復(fù)合保護(hù)劑的組成為：海藻糖4g、谷氨酸鈉12g、L-半胱氨酸鹽酸鹽1g、牛血清白蛋白0.75g、蒸餾水100ml。

其制備方法：

1）按量在蒸餾水中添加4g的海藻糖、12g的谷氨酸鈉，113℃滅菌15min，冷卻至室溫；

2）按量將1g的L-半胱氨酸鹽酸鹽、0.75g的牛血清白蛋溶解于蒸餾水中，然后用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌；

3）將步驟1）、2）所制備的溶液混合，并調(diào)整水的總質(zhì)量體積百分比為100%，得到金黃色葡萄球菌凍干保護(hù)劑。

將金黃色葡萄球菌活化培養(yǎng)、離心、清洗后，收集菌泥，在凍干前與保護(hù)劑混合，分裝，于-80℃預(yù)凍3h，然后冷凍干燥16h，得到金黃色葡萄球菌菌粉。經(jīng)檢測(cè)金黃色葡萄球菌菌粉的凍干存活率為71.40%。

實(shí)施例3

本實(shí)施例的金黃色葡萄球菌凍干制備用新型復(fù)合保護(hù)劑的組成為：海藻糖6g、谷氨酸鈉18g、L-半胱氨酸鹽酸鹽1g、牛血清白蛋白0.25g、蒸餾水100ml。

其制備方法：

1）按量在蒸餾水中添加6g的海藻糖、18g的谷氨酸鈉，113℃滅菌15min，冷卻至室溫；

2）按量將1g的L-半胱氨酸鹽酸鹽、0.25g的牛血清白蛋溶解于蒸餾水中，然后用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌；

3）將步驟1）、2）所制備的溶液混合，并調(diào)整水的總質(zhì)量體積百分比為100%，得到金黃色葡萄球菌凍干保護(hù)劑。

將金黃色葡萄球菌活化培養(yǎng)、離心、清洗后，收集菌泥，在凍干前與保護(hù)劑混合，分裝，于-80℃預(yù)凍3h，然后冷凍干燥17h，得到金黃色葡萄球菌菌粉。經(jīng)檢測(cè)金黃色葡萄球菌菌粉的凍干存活率為77.88%。

實(shí)施例4

本實(shí)施例的金黃色葡萄球菌凍干制備用新型復(fù)合保護(hù)劑的組成為：海藻糖2g、谷氨酸鈉15g、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5g、牛血清白蛋白0.5g、蒸餾水100ml。

其制備方法：

1）按量在蒸餾水中添加2g的海藻糖、15g的谷氨酸鈉，113℃滅菌15min，冷卻至室溫；

2）按量將0.5g的L-半胱氨酸鹽酸鹽、0.5g的牛血清白蛋溶解于蒸餾水中，然后用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌；

3）將步驟1）、2）所制備的溶液混合，并調(diào)整水的總質(zhì)量體積百分比為100%，得到金黃色葡萄球菌凍干保護(hù)劑。

將金黃色葡萄球菌活化培養(yǎng)、離心、清洗后，收集菌泥，在凍干前與保護(hù)劑混合，分裝，于-80℃預(yù)凍3h，然后冷凍干燥18h，得到金黃色葡萄球菌菌粉。經(jīng)檢測(cè)金黃色葡萄球菌菌粉的凍干存活率為99.82%。

實(shí)施例5

本實(shí)施例的金黃色葡萄球菌凍干制備用新型復(fù)合保護(hù)劑的組成為：海藻糖6g、谷氨酸鈉15g、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5g、牛血清白蛋白0.75g、蒸餾水100ml。

其制備方法：

1）按量在蒸餾水中添加6g的海藻糖、15g的谷氨酸鈉，113℃滅菌15min，冷卻至室溫；

2）按量將0.5g的L-半胱氨酸鹽酸鹽、0.75g的牛血清白蛋溶解于蒸餾水中，然后用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌；

3）將步驟1）、2）所制備的溶液混合，并調(diào)整水的總質(zhì)量體積百分比為100%，得到金黃色葡萄球菌凍干保護(hù)劑。

將金黃色葡萄球菌活化培養(yǎng)、離心、清洗后，收集菌泥，在凍干前與保護(hù)劑混合，分裝，于-80℃預(yù)凍3h，然后冷凍干燥18h，得到金黃色葡萄球菌菌粉。經(jīng)檢測(cè)金黃色葡萄球菌菌粉的凍干存活率為93.87%。