本發(fā)明涉及廢水處理技術(shù)領(lǐng)域,尤其涉及一種耐高鹽耐高COD鹽水球菌處理廢水技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù):
鹽水球菌屬Salinicoccus的分類地位隸屬于細(xì)菌域真細(xì)菌界硬壁菌門芽孢桿菌綱芽孢桿菌目葡萄球菌科,是一類能夠耐受或嗜好輕度或中度鹽環(huán)境的微生物。根據(jù)LPSN(List of prokaryotic names with standing in nomenclature)數(shù)據(jù)庫的統(tǒng)計(jì)結(jié)果,目前Salinicoccus屬有15個(gè)種,分別是S.albus,S.alkaliphilus,S.amylolyticus,S.carnicancri,S.halitifaciens,S.halodurans,S.hispanicus,S.iranensis,S.jeotgali,S.kekensis,S.kunmingensis,S.luteus,S.qingdaonensis,S.roseus,S.salitudinis,S.salsiraiae,S.sesuvii,S.siamensis。鹽水球菌分布廣泛,目前已報(bào)道的樣品來源包括鹽場,鹽堿湖,鹽礦,沿海海水,海洋沉積物,荒漠土,鹽漬土,鹽巖層,柴達(dá)木盆地,海馬齒根際,發(fā)酵的海鮮,鹽冰場等。
鹽水球菌能產(chǎn)生多種耐高鹽的胞外水解酶,如蛋白酶,脂肪酶等,這些耐鹽的蛋白資源具有重要的應(yīng)用前景。Salinicoccus sp.strain QW6(后命名為S.iranensis),具有亞碲酸鹽耐受和降解能力,經(jīng)過優(yōu)化亞碲酸鹽(0.005-0.5mM)降解率達(dá)99%;從這株菌中分離到由三個(gè)亞基組成的亞碲酸鹽還原相關(guān)的酶系。亞碲酸降解菌及其還原酶系的分離鑒定,不僅為微生物消除毒性無機(jī)物提供了新的見解,而且在廢水治理方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。除此之外,Salinicoccus halodurans H3B36能夠在胞內(nèi)富集N(α)-acetyl-α-lysine,用以抵抗高鹽和高溫,這也是一種具有潛在應(yīng)用價(jià)值的相容性溶質(zhì)。
除提供重要的代謝產(chǎn)物、基因和蛋白資源外,鹽水球菌本身作為生產(chǎn)菌株,也具有廣闊的應(yīng)用前景。鹽水球菌能夠耐受高鹽環(huán)境,其作為生產(chǎn)菌株,不需經(jīng)過嚴(yán)格的滅菌消毒過程。Salinicoccus roseus W12能夠耐受高達(dá)20%的乳酸鹽,研究表明,交叉保護(hù)和能量代謝相關(guān)蛋白發(fā)揮重要功能;耐鹽耐有機(jī)酸的特性,使得鹽水球菌不僅在乳酸生產(chǎn)等微生物制造領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景,而且在高鹽高COD廢水處理領(lǐng)域也具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。目前尚無鹽水球菌具有致病性的報(bào)道,而且其革蘭氏染色呈陽性,細(xì)胞破裂后不會(huì)釋放出脂多糖等免疫抗原,不會(huì)引起人類免疫反應(yīng)。鹽水球菌的細(xì)胞是球形,具有更大的表面積體積比,也更利于物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。
目前應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的微生物,如不同大腸桿菌菌株的基因組大小為4.64M到5.5M之間,枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168的基因組大小為4.22M,Corynebacterium glutamicum ATCC 13032的基因組大小為3.31M;具有良好產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)PHB前景的耐鹽細(xì)菌Halomonas sp.TD01的基因組的大小是4.09M。基因組中存在著大量的假基因和在工業(yè)生產(chǎn)中非必需的基因,這些基因的擴(kuò)增需要大量的物質(zhì)和能量,而且有些基因的產(chǎn)物可能對菌體生長帶來負(fù)面影響,所以有很多科學(xué)家嘗試通過基因工程將基因組上非必需的基因缺失,或通過理性設(shè)計(jì)構(gòu)建最小基因組的菌株。目前有7株鹽水球菌菌株完成了基因組測序(來源NCBI數(shù)據(jù)庫),基因組大小2.55M-2.78M不等,而本發(fā)明提供的鹽水球菌菌株,基因組只有2.24M(數(shù)據(jù)尚未發(fā)表)。相比于其他常用的生產(chǎn)菌株,鹽水球菌的基因組普遍偏小,如果將天然具有較小基因組的鹽水球菌發(fā)展成為工業(yè)生產(chǎn)的底盤細(xì)胞,可能具有不可替代的優(yōu)勢。
但是,目前尚無鹽水球菌的遺傳工具和操作方法,極大地限制了其應(yīng)用潛力的開發(fā)。挖掘利用鹽水球菌的遺傳資源,并進(jìn)一步開發(fā)鹽水球菌的應(yīng)用潛力,具有重要的實(shí)際意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
鹽水球菌具有良好的耐高鹽高COD的特性,尤其是耐高鹽高濃度有機(jī)酸,使其在高鹽高COD廢水處理等領(lǐng)域具有潛在的產(chǎn)業(yè)價(jià)值?;?、制藥等生產(chǎn)過程會(huì)產(chǎn)生大量的高鹽高COD廢水,這類廢水的處理一直是水處理的重點(diǎn)和難點(diǎn)。纖維素醚的生產(chǎn)過程會(huì)排放大量的高鹽高有機(jī)酸廢水,而且纖維素醚應(yīng)用范圍很廣,在我國產(chǎn)能很大。物理化學(xué)等處理方法可以實(shí)現(xiàn)部分高鹽廢水的脫鹽和降COD,但是處理成本高,而且會(huì)產(chǎn)生較嚴(yán)重的二次污染。
為了解決上述問題,本發(fā)明人經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)和文獻(xiàn)研究:生物處理認(rèn)為是生態(tài)環(huán)保的處理方法。用耐高鹽高COD的微生物將COD降低、去除或轉(zhuǎn)化為有價(jià)值的產(chǎn)品,處理后的普通鹽水經(jīng)脫鹽可獲得無機(jī)鹽或無機(jī)鹽水直接循環(huán)利用。鹽水球菌系統(tǒng)的構(gòu)建就是為實(shí)現(xiàn)高鹽高COD廢水的廉價(jià)、環(huán)保處理。
本發(fā)明的目的之一是提供一株耐高鹽高COD的鹽水球菌菌株。一株耐高鹽高COD的鹽水球菌(Salinicoccus sp.)菌株408,保藏編號(hào)為CGMCC No.13032。
本發(fā)明提供的細(xì)菌分離自天津大港油田采油井附近儲(chǔ)油罐下方的土壤樣品,分離方法是經(jīng)額外添加5%乙酸鈉鹽度10%的液體完全培養(yǎng)基富集培養(yǎng)兩次后,在相同培養(yǎng)基固體平板上劃線獲得單克隆,其實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部編號(hào)為408。
經(jīng)測定,該細(xì)菌16S rDNA(序列1)與Salinicoccus salsiraiae RH-1,Salinicoccus jeotgali S2R53-5和Salinicoccus siamensis PN1-2的同源性都高達(dá)99%以上,由此確定其隸屬于鹽水球菌屬(Salinicoccus)。鹽水球菌(Salinicoccus sp.)菌株408已于2016年9月22日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)(地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)),保藏編號(hào)為CGMCC No.13032。
本發(fā)明提供鹽水球菌(Salinicoccus sp.)菌株408可以耐受中度鹽度和高濃度乙酸鹽,在完全培養(yǎng)基中耐受NaCl濃度的范圍2-15%(培養(yǎng)基成分為:酸水解酪素7.5克/升,酵母提取物10克/升,谷氨酸鈉1克/升,檸檬酸三鈉3克/升,氯化鈉20-150克/升,七水合硫酸鎂20克/升,氯化鉀2克/升,檸檬酸鐵銨0.008克/升,pH調(diào)節(jié)到7.0-7.2),能夠耐受高達(dá)5%的乙酸。
本發(fā)明的另一目的是提供一株鹽水球菌(Salinicoccus sp.)菌株P(guān)E及其來源的兩個(gè)內(nèi)源性質(zhì)粒。
鹽水球菌(Salinicoccus sp.)菌株P(guān)E已于2016年10月21日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)(地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)),保藏編號(hào)為CGMCC No.13135。
本發(fā)明提供的兩個(gè)內(nèi)源性質(zhì)粒分離提取自鹽水球菌(Salinicoccus sp.)菌株408中。兩個(gè)質(zhì)粒均為環(huán)形質(zhì)粒。
其中較小質(zhì)粒的大小為2191bp,命名為pS408-1(核苷酸序列見序列2);較大質(zhì)粒大小為3007bp,命名為pS408-2(核苷酸序列見序列3)。
序列表中序列2由2191個(gè)核苷酸組成。其中,序列2中的自5′端第715-1641位堿基為一個(gè)開放閱讀框架,其編碼具有序列表中序列4(由308個(gè)氨基酸殘基組成)的氨基酸殘基序列的質(zhì)粒復(fù)制所需的反式作用因子Rep1。
序列表中序列3由3007個(gè)核苷酸組成。其中,序列3中的自5′端第1067-2080位堿基為一個(gè)開放閱讀框架,其編碼具有序列表中序列5(由337個(gè)氨基酸殘基組成)的氨基酸殘基序列的質(zhì)粒復(fù)制所需的反式作用因子Rep2。
質(zhì)粒pS408-1的物理圖譜如圖1所示,其包括的常見限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)有BamHI,ClaI,PvuII酶切位點(diǎn)各一個(gè)。其中,序列2中的自5′端第1500-1505位堿基為BamHI酶切位點(diǎn);序列2中的自5′端第323-328位堿基為ClaI酶切位點(diǎn);序列2的自5′端第1019-1024位堿基為PvuII酶切位點(diǎn)。質(zhì)粒pS408-1不含ApaI,BglII,EcoRI,EcoRV,HindIII,KpnI,NcoI,NdeI,SacII,SalI,SmaI,SphI,XbaI等常見內(nèi)切酶位點(diǎn),因此這些內(nèi)切酶位點(diǎn)可作為pS408-1的衍生載體的多克隆位點(diǎn)。
質(zhì)粒pS408-2的物理圖譜如圖2所示,其包括的常見限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)有BamHI,ClaI,EcoRI,EcoRV酶切位點(diǎn)各一個(gè)。其中,序列3中的自5′端第1936-1941位堿基為BamHI酶切位點(diǎn);序列3中的自5′端第2689-2694位堿基為ClaI酶切位點(diǎn);序列3的自5′端第698-703位堿基為EcoRI酶切位點(diǎn);序列3的自5′端第2821-2826位堿基為EcoRV酶切位點(diǎn)。質(zhì)粒pS408-2不含ApaI,BglII,HindIII,KpnI,NcoI,NdeI,PvuII,SacII,SalI,SmaI,SphI,XbaI等常見內(nèi)切酶位點(diǎn),因此這些內(nèi)切酶位點(diǎn)可作為pS408-2的衍生載體的多克隆位點(diǎn)。
為了進(jìn)一步探討質(zhì)粒的應(yīng)用范圍,對其拷貝數(shù)進(jìn)行了測定。質(zhì)粒pS408-1在對數(shù)期的拷貝數(shù)是0.90±0.13個(gè),在穩(wěn)定期的拷貝數(shù)是1.12±0.07個(gè);質(zhì)粒pS408-2在對數(shù)期的拷貝數(shù)是0.97±0.07個(gè),在穩(wěn)定期的拷貝數(shù)是1.21±0.12個(gè)。質(zhì)粒pS408-1和pS408-2的拷貝數(shù)都在1-2個(gè)范圍內(nèi),均屬于低拷貝數(shù)的質(zhì)粒。
本發(fā)明的又一目的是提供pS408-1和pS408-2的衍生質(zhì)粒載體pTCS101和pTCS201。
由于質(zhì)粒pS408-1和pS408-2能夠在鹽水球菌中自主復(fù)制,在保證其提供的復(fù)制所需的元件完整的前提下,向其中引入性質(zhì)明確的其它功能DNA片段,或反過來將復(fù)制所需的元件完整的引入性質(zhì)明確的其他功能DNA序列,即可構(gòu)成可轉(zhuǎn)化鹽水球菌的衍生質(zhì)粒。
本發(fā)明提供的衍生質(zhì)粒是在pUCm-T的基礎(chǔ)上,首先連接入氯霉素抗性基因(方向?yàn)镋coRI到HindIII,質(zhì)粒命名為pTC),然后分別連接入質(zhì)粒pS408-1的自5′端第1至2191位堿基或pS408-2的自5′端第1至3007位堿基至XbaI和HindIII位置,分別命名為pTCS101和pTCS201,物理圖譜如圖3和4所示。
這兩個(gè)衍生質(zhì)粒pTCS101和pTCS201分別含有來自pS408-1和pS408-2完整的在鹽水球菌中復(fù)制所需的復(fù)制原點(diǎn),都含有在大腸桿菌中復(fù)制所需的復(fù)制原點(diǎn),和在大腸桿菌及在鹽水球菌中篩選轉(zhuǎn)化子的抗性選擇標(biāo)記基因AmpR和CmR,是大腸桿菌-鹽水球菌穿梭質(zhì)粒。
也對穿梭質(zhì)粒在鹽水球菌中的拷貝數(shù)分別進(jìn)行了測定。質(zhì)粒pTCS101在對數(shù)期的拷貝數(shù)是3.52±0.61個(gè),在穩(wěn)定期的拷貝數(shù)是8.57±0.88個(gè);質(zhì)粒pTCS201在對數(shù)期的拷貝數(shù)是2.23±0.20個(gè),在穩(wěn)定期的拷貝數(shù)是5.34±0.35個(gè)。
以穿梭質(zhì)粒pTCS101和pTCS201為基礎(chǔ),引入適當(dāng)?shù)牡鞍妆磉_(dá)元件和目的基因,轉(zhuǎn)化鹽水球菌,以合適的條件培養(yǎng)即可得到足夠量的目的蛋白。如在pTCS101中克隆金黃色葡萄球菌來源的乳酸脫氫酶編碼基因(Gene ID:3921373)和上下游功能序列,獲得的質(zhì)粒命名為pTCS101-LDH;經(jīng)電穿孔轉(zhuǎn)化至質(zhì)粒消除株Salinicoccus sp.PE獲得乳酸脫氫酶成功表達(dá)的菌株Salinicoccus sp.PE(pTCS101-LDH)。因此,基于質(zhì)粒pS408-1和pS408-2構(gòu)建而成各種表達(dá)載體均在本專利保護(hù)之列。
由本發(fā)明的鹽水球菌質(zhì)粒及其衍生質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化所得到的微生物也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明的鹽水球菌質(zhì)粒載體為鹽水球菌的研究和開發(fā)提供了遺傳工具系統(tǒng),將在鹽水球菌的研究和開發(fā)中發(fā)揮重要作用。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。應(yīng)理解,這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
附圖說明
圖1質(zhì)粒pS408-1的物理圖譜。
圖2質(zhì)粒pS408-2的物理圖譜。
圖3質(zhì)粒pTCS101的物理圖譜。
圖4質(zhì)粒pTCS201的物理圖譜。
具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中,如無特殊說明,均為常規(guī)方法。
下述實(shí)施例中的百分含量,如無特別說明,均為質(zhì)量百分含量。
下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等,如無特殊說明,均可從商業(yè)途徑得到。
實(shí)施例1
鹽水球菌菌株的分離、制備、培養(yǎng)
本發(fā)明提供的細(xì)菌分離自天津大港油田采油井附近儲(chǔ)油罐下方的土壤樣品,分離方法是經(jīng)額外添加5%乙酸鈉鹽度10%的液體完全培養(yǎng)基富集培養(yǎng)兩次后,在相同培養(yǎng)基固體平板上劃線獲得單克隆,其編號(hào)為408。
經(jīng)測定,該細(xì)菌16S rDNA(序列1)與Salinicoccus salsiraiae RH-1,Salinicoccus jeotgali S2R53-5和Salinicoccus siamensis PN1-2的同源性都高達(dá)99%以上,由此確定其隸屬于鹽水球菌屬(Salinicoccus)。菌株已于2016年9月22日保藏中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)(地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)),保藏編號(hào)為CGMCC No.13032。
本發(fā)明提供鹽水球菌(Salinicoccus sp.)菌株408可以耐受中度鹽度和高濃度乙酸鹽,在完全培養(yǎng)基中耐受NaCl濃度的范圍2-15%(培養(yǎng)基成分為:酸水解酪素7.5克/升,酵母提取物10克/升,谷氨酸鈉1克/升,檸檬酸三鈉3克/升,氯化鈉20-150克/升,七水合硫酸鎂20克/升,氯化鉀2克/升,檸檬酸鐵銨0.008克/升,pH調(diào)節(jié)到7.0-7.2),能夠耐受高達(dá)5%的乙酸。
實(shí)施例2
鹽水球菌質(zhì)粒pS408-1和pS408-2的提取、測序和特點(diǎn)
將鹽水球菌(Salinicoccus sp.)菌株408培養(yǎng)至穩(wěn)定期,離心收集菌體,采用提取低拷貝數(shù)質(zhì)粒的方法提取鹽水球菌質(zhì)粒。質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶Sau3AI不完全酶切的DNA片段,連接入經(jīng)BamHI(Sau3AI和BamHI是同尾酶)完全酶切的自連的pUCm-T載體,挑選有質(zhì)粒片段連接入的質(zhì)粒,測序;將獲得的序列拼接。以部分拼接的片段為模板,設(shè)計(jì)向外方向的測序引物,以提取的鹽水球菌質(zhì)粒為模板測序,并進(jìn)一步拼接質(zhì)粒;最終獲得兩個(gè)環(huán)形質(zhì)粒的DNA序列。
其中較小質(zhì)粒的大小為2191bp,命名為pS408-1(核苷酸序列見序列2);自5′端第715-1641位堿基為一個(gè)開放閱讀框架,其編碼具有序列表中序列4的氨基酸殘基序列的質(zhì)粒復(fù)制所需的反式作用因子Rep1,由308個(gè)氨基酸殘基組成。
質(zhì)粒pS408-1的物理圖譜如圖1所示,其包括的常見限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)有BamHI,ClaI,PvuII酶切位點(diǎn)各一個(gè)。其中,序列2中的自5′端第1500-1505位堿基為BamHI酶切位點(diǎn);序列2中的自5′端第323-328位堿基為ClaI酶切位點(diǎn);序列2的自5′端第1019-1024位堿基為PvuII酶切位點(diǎn)。質(zhì)粒pS408-1不含ApaI,BglII,EcoRI,EcoRV,HindIII,KpnI,NcoI,NdeI,SacII,SalI,SmaI,SphI,XbaI等常見內(nèi)切酶位點(diǎn),因此這些內(nèi)切酶位點(diǎn)可作為pS408-1的衍生載體的多克隆位點(diǎn)。
較大質(zhì)粒大小為3007bp,命名為pS408-2(核苷酸序列見序列3);自5′端第1067-2080位堿基為一個(gè)開放閱讀框架,其編碼具有序列表中序列5的氨基酸殘基序列的質(zhì)粒復(fù)制所需的反式作用因子Rep2,由337個(gè)氨基酸殘基組成。
質(zhì)粒pS408-2的物理圖譜如圖2所示,其包括的常見限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)有BamHI,ClaI,EcoRI,EcoRV酶切位點(diǎn)各一個(gè)。其中,序列3中的自5′端第1936-1941位堿基為BamHI酶切位點(diǎn);序列3中的自5′端第2689-2694位堿基為ClaI酶切位點(diǎn);序列3的自5′端第698-703位堿基為EcoRI酶切位點(diǎn);序列3的自5′端第2821-2826位堿基為EcoRV酶切位點(diǎn)。質(zhì)粒pS408-2不含ApaI,BglII,HindIII,KpnI,NcoI,NdeI,PvuII,SacII,SalI,SmaI,SphI,XbaI等常見內(nèi)切酶位點(diǎn),因此這些內(nèi)切酶位點(diǎn)可作為pS408-2的衍生載體的多克隆位點(diǎn)。
為了進(jìn)一步探討質(zhì)粒的應(yīng)用范圍,對其拷貝數(shù)進(jìn)行了測定。測定方法是采用Real-time PCR測定質(zhì)粒相對于染色體的拷貝數(shù)。在質(zhì)粒pS408-1上設(shè)計(jì)的一對引物為CPN-P1-F:AAAAGAGGAGCAGAAGG和CPN-P1-R:TTGCGTGATAAGTGGAT,在質(zhì)粒pS408-2上設(shè)計(jì)的一對引物為CPN-P2-F:TTCGTCAGTCTCGGTGGT和CPN-P2-R:TTCGGTTACTCTTCCTCAAT,在染色體上單拷貝基因RNA聚合酶beta亞基編碼基因設(shè)計(jì)的一對引物為CPN-C-F:GAGACGGGCGAGGTTA和CPN-C-R:TTTCGACAGTTGGTGGTT。質(zhì)粒pS408-1在對數(shù)期的拷貝數(shù)是0.90±0.13個(gè),在穩(wěn)定期的拷貝數(shù)是1.12±0.07個(gè);質(zhì)粒pS408-2在對數(shù)期的拷貝數(shù)是0.97±0.07個(gè),在穩(wěn)定期的拷貝數(shù)是1.21±0.12個(gè)。質(zhì)粒pS408-1和pS408-2的拷貝數(shù)在1-2個(gè)范圍內(nèi),均屬于低拷貝數(shù)的質(zhì)粒。
實(shí)施例3
大腸桿菌-鹽水球菌衍生質(zhì)粒pTCS101和pTCS201的構(gòu)建
用引物CmR-F:CAACTAAAGCACCCAT和CmR-R:TCGGCATTATCTCATA擴(kuò)增氯霉素抗性基因(J Bacteriol.1984,158(2):543-50),直接連接入pUCm-T載體,經(jīng)藍(lán)白斑篩選和測序,獲得的質(zhì)粒插入T載體的方向?yàn)镋coRI到HindIII,將其命名為pTC。
以鹽水球菌Salinicoccus sp.CGMCC No.13032的基因組為模板,用引物P1-F:GATCCATTTATGCCGAG和P1-R:TCCGATGATTATATGGC擴(kuò)增即可獲得pS408-1復(fù)制所需的完整的DNA序列;以鹽水球菌Salinicoccus sp.CGMCC No.13135的基因組為模板,用引物P2-F:GATCTGTTTATGCCGAG和P2-R:ACTACCGTTTTATTTTC擴(kuò)增即可獲得pS408-2復(fù)制所需的完整的DNA序列。
上述兩個(gè)鹽水球菌質(zhì)粒復(fù)制所需的完整的DNA序列通過分別在上下游引物的5’端添加酶切位點(diǎn),經(jīng)酶切連接入pTC質(zhì)粒;所選限制性內(nèi)切酶分別為XbaI和HindIII。由pS408-1復(fù)制所需的完整的DNA序列連接入pTC質(zhì)粒獲得衍生質(zhì)粒pTCS101(物理圖譜如圖3所示),由pS408-2復(fù)制所需的完整的DNA序列連接入pTC質(zhì)粒獲得衍生質(zhì)粒pTCS201(物理圖譜如圖4所示)。
這兩個(gè)衍生質(zhì)粒pTCS101和pTCS201分別含有來自pS408-1和pS408-2完整的在鹽水球菌中復(fù)制所需的復(fù)制原點(diǎn),都含有在大腸桿菌中復(fù)制所需的復(fù)制原點(diǎn),和在大腸桿菌及鹽水球菌中篩選轉(zhuǎn)化子的抗性選擇標(biāo)記基因AmpR和CmR,是大腸桿菌-鹽水球菌穿梭質(zhì)粒。
實(shí)施例4
質(zhì)粒消除菌株的獲得和穿梭質(zhì)粒pTCS101和pTCS201的拷貝數(shù)
野生型鹽水球菌(Salinicoccus sp.)菌株408含有內(nèi)源性質(zhì)粒pS408-1和pS408-2,需將其消除掉。
首先將質(zhì)粒pTCS101電穿孔法(參考FEMS Microbiol Lett.1992,73(1-2):133-138中金黃色葡萄球菌轉(zhuǎn)化方法)轉(zhuǎn)化到鹽水球菌(Salinicoccus sp.)菌株408中,在含有10μg/ml氯霉素的完全培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)兩次,基于質(zhì)粒不相容性原理將pS408-1消除掉;然后再在無氯霉素的完全培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)兩次,通過影印平板法篩選獲得無氯霉素抗性的菌株,即獲得質(zhì)粒pS408-1被消除的菌株。同理,在此基礎(chǔ)上再次消除掉質(zhì)粒pS408-2,獲得質(zhì)粒都被消除掉的菌株,即鹽水球菌(Salinicoccus sp.)菌株P(guān)E。
將穿梭質(zhì)粒pTCS101和pTCS201分別轉(zhuǎn)化到質(zhì)粒消除的菌株Salinicoccus sp.PE中,測定穿梭質(zhì)粒在鹽水球菌中的拷貝數(shù)。質(zhì)粒pTCS101在對數(shù)期的拷貝數(shù)是3.52±0.61個(gè),在穩(wěn)定期的拷貝數(shù)是8.57±0.88個(gè);質(zhì)粒pTCS201在對數(shù)期的拷貝數(shù)是2.23±0.20個(gè),在穩(wěn)定期的拷貝數(shù)是5.34±0.35個(gè)。
實(shí)施例5
金黃色葡萄球菌來源的乳酸脫氫酶基因在鹽水球菌中的表達(dá)
以金黃色葡萄球菌的基因組為模板,用引物L(fēng)DH-SA-F:TGATTGGCTAGTTTGTA和LDH-SA-R:AGTTATTCCTCGTTGTC擴(kuò)增即可獲得乳酸脫氫酶編碼基因和上下游功能序列。
上述乳酸脫氫酶編碼基因和上下游功能序列通過在上下游引物的5’端添加酶切位點(diǎn),經(jīng)酶切連接入pTCS101質(zhì)粒;所選限制性內(nèi)切酶分別為PstI和EcoRI。由乳酸脫氫酶編碼基因和上下游功能序列連接入pTCS101質(zhì)粒獲得表達(dá)質(zhì)粒pTCS101-LDH。
分別將空質(zhì)粒pTCS101和乳酸脫氫酶表達(dá)質(zhì)粒pTCS101-LDH分別轉(zhuǎn)入質(zhì)粒消除鹽水球菌(Salinicoccus sp.)菌株P(guān)E,得到鹽水球菌(Salinicoccus sp.)菌株P(guān)E(pTCS101)和鹽水球菌(Salinicoccus sp.)菌株P(guān)E(pTCS101-LDH)。
在相同條件下培養(yǎng)菌體并制作蛋白粗提液。在有10μg/ml氯霉素鹽度5%的完全培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)至穩(wěn)定期,收集10ml培養(yǎng)液的菌體,用緩沖液(50mM Tris Cl,150mM NaCl,pH7.5)洗滌兩次,最終重懸于1ml的緩沖液中。添加終濃度約為12U/ml溶葡球菌酶(購自生工生物工程上海(股份)有限公司)在37℃孵育1h,然后在低溫以200W功率按工作3s間隔6s的方式超聲破碎細(xì)胞,總超聲時(shí)間為10min,最后在低溫條件下12000rpm離心2min,上清轉(zhuǎn)移至新EP管,作為蛋白粗提液。
測定并比較鹽水球菌(Salinicoccus sp.)菌株P(guān)E(pTCS101)和鹽水球菌(Salinicoccus sp.)菌株P(guān)E(pTCS101-LDH)的細(xì)胞粗提液中乳酸脫氫酶的比活力。
總蛋白質(zhì)濃度采用北京普利萊基因技術(shù)有限公司生產(chǎn)的BCA蛋白定量試劑盒測定,測定結(jié)果為鹽水球菌(Salinicoccus sp.)菌株P(guān)E(pTCS101)的蛋白粗提液的總蛋白質(zhì)濃度為3.65±0.01mg/ml,鹽水球菌(Salinicoccus sp.)菌株P(guān)E(pTCS101-LDH)的蛋白粗提液的總蛋白質(zhì)濃度為3.71±0.01mg/ml,二者蛋白濃度相當(dāng)。
測定乳酸脫氫酶的方法為:首先配制底物混合液(1mM丙酮酸,0.75mM NADH,pH7.0~7.5);上述重懸菌體的緩沖液350μl,底物混合液130μl,蛋白粗提液或其稀釋液20μl。
通過測定340nm吸光值的降低速率,代表底物NADH的消耗速率,計(jì)算比活力。測定結(jié)果為鹽水球菌(Salinicoccus sp.)菌株P(guān)E(pTCS101)的蛋白粗提液中乳酸脫氫酶的比活力為0.42±0.10U/mg,鹽水球菌(Salinicoccus sp.)菌株P(guān)E(pTCS101-LDH)的蛋白粗提液中乳酸脫氫酶的比活力為34.34±3.71U/mg,后者樣品中乳酸脫氫酶的比活力提高了近80倍,表明乳酸脫氫酶得到成功表達(dá)。
序列表
<110> 中國科學(xué)院微生物研究所
<120> 一株耐高鹽耐高COD鹽水球菌菌株和來源該菌株的內(nèi)源質(zhì)粒
<160> 7
<210> 1
<211> 1436
<212> DNA
<213> 鹽水球菌菌株Salinicoccus sp.
<400> 1
cagtcgaacg cgcagccccg gagcttgctc cgggttctgc gagtggcgga cgggtgagta 60
acacgtaggc aacctaccca tcagactggg ataaccgcgg gaaaccgtgg ctaataccgg 120
atgatcctga tccccgcagg gggatgagtt gaaaggcggt ctttgactgc cactgatgga 180
tgggcctgcg gcgcattagc tagttggtgg ggtaagggcc caccaaggcg acgatgcgta 240
gccgacctga gagggtgatc ggccacactg ggactgagac acggcccaga ctcctacggg 300
aggcagcagt agggaatctt ccgcaatgga cgcaagtctg acggagcaac gccgcgtgag 360
tgaagaaggg tttcggctcg taaaactctg ttgtcaggga agaacgccgg tgggagtaac 420
tgtccatcgg gtgacggtac ctgaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc 480
ggtaatacgt aggtggcaag cgttatccgg aattattggg cgtaaagcgc gcgtaggcgg 540
ttcgttaagt ctgatgtgaa agcccccggc tcaaccgggg agggtcattg gaaactggcg 600
aacttgagtg cagaagagga gagtggaatt ccatgtgtag cggtgaaatg cgcagagata 660
tggaggaaca ccagtggcga aggcggctct ctggtctgca actgacgctg atgtgcgaaa 720
gcgtggggat caaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgagtgcta 780
agtgttaggg ggtttccgcc ccttagtgct gcagcaaacg cattaagcac tccgcctggg 840
gagtacggcc gcaaggctga aactcaaagg aattgacggg gacccgcaca agcggtggag 900
catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccaa atcttgacat cctctgaccg 960
ccatggagac atggcttccc ttcggggcag agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc 1020
tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttatc attagttgcc 1080
agcattcagt tgggcactct agtgagactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg 1140
acgtcaaatc atcatgcccc ttatgatttg ggctacacac gtgctacaat ggacaggtta 1200
caaagggcag ctacgccgcg aggccaagcg aatcccataa aactgttctc agttcggatt 1260
ggagtctgca actcgactcc atgaagctgg aatcgctagt aatcgtggat cagaatgcca 1320
cggtgaatac gttcccgggt cttgtacaca ccgcccgtca caccacggaa gtcggtaaca 1380
cctgaagccg gtgggccaac ctttatggag gcagccgtcg aaggtgggac cgatga 1436
<210> 2
<211> 2191
<212> DNA
<213> 鹽水球菌菌株Salinicoccus sp.
<400> 2
gatccattta tgccgagaaa acttttggtg ggaaaagcaa ccctgaataa actaaaaagc 60
cggtaggcag ataccgtgag gtatcaaaaa tgcctaccga cagcttttgg gtttttaggg 120
ttgccgttgg ttcacaccaa aaggaaattg gaataaatat taatttactg tatcttctta 180
attaaaagga ggagattaca ttaataatag tttaaattta tttcttattg tttctttttt 240
ctttttgctt tacttaatat tttctgaagg aaattttgcc ttttttatat tattagcgtt 300
tgttcttttt gtatttttct taatcgataa tggtgaaaag gaaaatgttg atgataaaag 360
gtattatgta ttacgtttat atattactgg tattgtaata ttctttttca ttactgattt 420
tatatatggg tggagtaatt cttttgttta tataatggct atgataccaa ttatgtatgt 480
aacagtaaaa aacaataaaa cgggtttctt cttatcttga tactatacgt cataatttct 540
atcgggggca atatgccttg agccgttggt atgactgctt taaacacaaa aaaacttgca 600
tgtttccgtc tactagttta gtgttttagg tgacgaagcc aaaaacataa aacctagggg 660
aaagtgcaag tttttttgta tgcacctttc ttggtagaaa ggatttattc acttatggag 720
aagtataccc agaaaaagcg aaaaaatcaa ctgttacaga cactcatcag taagcatgtc 780
agcaaaaaga cactggaacg ggtaaaggac tgtaatacat tcttatttat ggtggctgat 840
attacgatgg aaaaaaccaa actacaccgt tccaataact gcgagcatcg gttctgtcca 900
gtctgtgcat ggaagaaagc ccgtaagaac gccatgaaga ttagtattct gatggaatac 960
ctcaaaaaag aggagcagaa ggagtttctc tttctgactt tgacggcacc aaatgtgcca 1020
gctggggaac taaacgatga aattaagcat tataataact cgttcaaacg tatgatgcag 1080
cgaaaggaag taaagacggc tgtaaaaggc tatgtgcgga aattggaagt cacctacaac 1140
aaagatcgag acgactatca tccgcatttt cacgtaatct tagccgctga taaacactat 1200
tttaataata aaagacaata tattaaacgc gatagatggc tcgaactctg gcaacaatca 1260
acaaaaaatc cacttatcac gcaagtggac atcagacgcg taaaacacac cgacaacaaa 1320
aaagaagtct ccgaaattgc caaatacagc gccaaagaca gcgactatct ccaagacgaa 1380
accgtatttg acacattcta taaaacactt tccggtaagc gccttattgt atattccgga 1440
ctctttaaag acgccagcac actctatgaa accaaagcac tcgaccacta taaagacatg 1500
gatccaacct actacatcta ccaaattttt tatcactggg gtaaaactga ctacatcgaa 1560
accgaacgca aactcatgaa tcaagacatg ctaaaagaaa tcaatcagac cctattagac 1620
gaaacagaca tcgaagaata accgttacac ctgcacccat tgttacactt tccattcccc 1680
ctttaacctt gacccctgta tcacgacacg cagtgatgca ggggtcaagg tttgagatta 1740
gtaacttgtt gcttatcgaa tgggggaaga tgccaggtat atcaatgggt gcgggtgtat 1800
acgaccattc caaataaaaa aatgggtcat accccccatt taccccccca tttaccctac 1860
catttggaat agtcatggaa tctttatgga aagtgtattt agtatgttat ttagaatcat 1920
attgggattt atttaattgt ttttttgttc tcactcttga agcgaatcat cccagtctaa 1980
cgctcgggaa ttttggtaaa aatggacgtg cgtgtaactg ggcagtacct gcgtactgat 2040
tttaaactta actttgattt agacaccatt tcagagtcca aataagagta tatgagcgtc 2100
caaattgttt ttagggtact tttctatgac ttaagtcctt agaaacgctt tgagggctct 2160
ttctgacgtt ttgagccata taatcatcgg a 2191
<210> 3
<211> 3007
<212> DNA
<213> 鹽水球菌菌株Salinicoccus sp.
<400> 3
gatctgttta tgccgagaaa acttttggtg ggaataggga aacggaaaga tactaaaaag 60
ccgaatggct ggataccgtt aggtatcaat tttgccattc gacagctttt ttattttttg 120
tttccctgtt ggttcacacc aaaaggaaat tggaataaaa atataaagag agttggtaca 180
tttttgatta atatttttag gataattatg tttataggtg cagggatttt attatttaat 240
gtgattgcaa gaccagataa tgcattttta tttatgacat taggtgttct gctagttatg 300
ggcggaggag ttatgatact aagacagaat aaaggaaaag aataaaagga gaaaaactat 360
atagaactca ttattaaaaa tgctattaaa ggtattagta atttagtttt catcggtaga 420
ctccttcgta agatgtttta taaataagta tggagcgatt ataaacattc ccatttgtat 480
gaaagtgtta ggtaaaaatt taagtttttc catcatttca ttttcagtga atgctataaa 540
aggaaataga attatgcaga aagcaaaata aattgttaat aatagatatg gaaattcaaa 600
tatgtttcca gtagtaaaat tgtttatgac atagatatag aatgcaaaaa tagctacacc 660
aattatgaat gctaagaatc tgaaaaaaat gttgctagaa ttcattaaac taatactcct 720
ttgttattat gatataaacg aatggaacac agactatatg agtaggataa aaaagcaagt 780
ttctaaaaag acaataagca gatacttatt gtctttttag aacttgcttt tgaacttaga 840
aatgagcgtt tttgagcgag tttcttttat cttgatacta agggtcatat tttcgatttg 900
ggtaaatatg accctatccc ttgatacagt tgacttaaac acaaaaaaac ttgcattttc 960
cagggtagta gtttaatgtt ctaggtgact aagccaacaa cataaattac taggggaaag 1020
tgcaagtttt tttgtacctt tcgcagatga aaggattatt caattcatgg agaagtatac 1080
agagaaaaag ttgaaaaatc aactgttaca gacactcata ggcaaacatg ttactgattc 1140
cacactatta agaataaagg agtgcaacac atttatgtta tttcttgctg ataagacgct 1200
tgaaaagacg aagttgcatg gtgcgaatag ttgcaagcat agattttgtc cagtgtgttc 1260
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agaagaaaat aaagaatttg ttttcttaac gcttactgca ccaaacgtga ctgctgatga 1380
attgaatgat gagattcaac attataacaa atcttttaaa cggttgatgg aacgtaaaga 1440
agtgaaagca gcagtcaaag gttatgttag aaaattagaa gtgacctatg acggtaaaga 1500
atctattacg aaaagtatgt ataaacatcg aacgaattat tataaaaaac gtggcttaaa 1560
tatcggcgat aaaaatccaa actatgatac ttatcatcca cattttcatg tggtgctggc 1620
agttaataaa acctatttta ataaaccgaa tgtttatatt cgtcagtctc ggtggttgga 1680
attgtggcaa caatctacaa aaaatccaat gattacgcag gtcgatgtca gacgagtgaa 1740
acatacagat aacaaaaaag aagtttcaga gattgcgaaa tacagtgcga aggattctga 1800
ttatctacaa aatgaaaaag tttttgatac attttttaat tcattgtcag gcaaacgatt 1860
gattgtgtat tcaggattgt ttaaagaagc cagcaagatg tatgacaata aagaattaga 1920
aaagtataaa gaaatggatc cgactcaata tatattttta ttgttttatc attggggaca 1980
aacagaatat attcaaacgg aacaaaaatt aatgtcggaa gatatgcaaa aagaagttaa 2040
taatcaaatg ctagatgatg aaaatattga ggaagagtaa ccgaaaggtt gctctttttt 2100
tgatttcacc cttgaggcgg atttccccag gggaatgctc gttttttcgt tagaaaaata 2160
cgtgcgtgta actgggcagt atttaaaata ctgaaatctg attctgttat tttgctattt 2220
aacataaatg ttaatatgtt atttaaataa aatgttatca agataatgaa tcatttaatt 2280
aatattttat ttaattaaat tgttaacatc gttcaaatgc caaataagcg attctgagcg 2340
tttctattta attttaggta gttcagttca tttttgatta ttgaatgtcc tcagaactga 2400
tttatggctt atatatgcgg attcaaaata atttatggga ctgttttata tattttcata 2460
ttcccgtaag ggtgcactta tacgttattc tgacggggtg cacaaaatct ttctcgcctg 2520
cgctcgaaaa aacggtaaag aataggagtt gatagttatc aaaaatattt tttattttct 2580
tttattaatt atcatatttg aagttatttt ttatatattt tttgatacta gacctagtga 2640
attaatttta ttgattggag gattatgtat tatttattta gcagttcaat cgattaaaaa 2700
aattgttaat aattcaagtg aaagaaaata aagaaagggg aatcaaaagt agaatttttt 2760
taaaaaaagt gagaatgagt gaaaatcaaa aataaattat aaagagcata aggggtttat 2820
gatatcaaac gcttatcgct tacgctctaa acgttgatat ggtcggcagt gccgacctta 2880
accttatgcc atcacaataa ttatataaaa cacactaaaa acacaaagat gagtcgtgtg 2940
tttttagtgt gttatttttc ggtattgaga aaacagttgc aaaggtatta gaaaataaaa 3000
cggtagt 3007
<210> 4
<211> 308
<212> PRT
<213> 鹽水球菌菌株Salinicoccus sp.
<400> 4
Met Glu Lys Tyr Thr Gln Lys Lys Arg Lys Asn Gln Leu Leu Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ile Ser Lys His Val Ser Lys Lys Thr Leu Glu Arg Val
20 25 30
Lys Asp Cys Asn Thr Phe Leu Phe Met Val Ala Asp Ile Thr Met
35 40 45
Glu Lys Thr Lys Leu His Arg Ser Asn Asn Cys Glu His Arg Phe
50 55 60
Cys Pro Val Cys Ala Trp Lys Lys Ala Arg Lys Asn Ala Met Lys
65 70 75
Ile Ser Ile Leu Met Glu Tyr Leu Lys Lys Glu Glu Gln Lys Glu
80 85 90
Phe Leu Phe Leu Thr Leu Thr Ala Pro Asn Val Pro Ala Gly Glu
95 100 105
Leu Asn Asp Glu Ile Lys His Tyr Asn Asn Ser Phe Lys Arg Met
110 115 120
Met Gln Arg Lys Glu Val Lys Thr Ala Val Lys Gly Tyr Val Arg
125 130 135
Lys Leu Glu Val Thr Tyr Asn Lys Asp Arg Asp Asp Tyr His Pro
140 145 150
His Phe His Val Ile Leu Ala Ala Asp Lys His Tyr Phe Asn Asn
155 160 165
Lys Arg Gln Tyr Ile Lys Arg Asp Arg Trp Leu Glu Leu Trp Gln
170 175 180
Gln Ser Thr Lys Asn Pro Leu Ile Thr Gln Val Asp Ile Arg Arg
185 190 195
Val Lys His Thr Asp Asn Lys Lys Glu Val Ser Glu Ile Ala Lys
200 205 210
Tyr Ser Ala Lys Asp Ser Asp Tyr Leu Gln Asp Glu Thr Val Phe
215 220 225
Asp Thr Phe Tyr Lys Thr Leu Ser Gly Lys Arg Leu Ile Val Tyr
230 235 240
Ser Gly Leu Phe Lys Asp Ala Ser Thr Leu Tyr Glu Thr Lys Ala
245 250 255
Leu Asp His Tyr Lys Asp Met Asp Pro Thr Tyr Tyr Ile Tyr Gln
260 265 270
Ile Phe Tyr His Trp Gly Lys Thr Asp Tyr Ile Glu Thr Glu Arg
275 280 285
Lys Leu Met Asn Gln Asp Met Leu Lys Glu Ile Asn Gln Thr Leu
290 295 300
Leu Asp Glu Thr Asp Ile Glu Glu
305
<210> 5
<211> 337
<212> PRT
<213> 鹽水球菌菌株Salinicoccus sp.
<400> 5
Met Glu Lys Tyr Thr Glu Lys Lys Leu Lys Asn Gln Leu Leu Gln
5 10 15
Thr Leu Ile Gly Lys His Val Thr Asp Ser Thr Leu Leu Arg Ile
20 25 30
Lys Glu Cys Asn Thr Phe Met Leu Phe Leu Ala Asp Lys Thr Leu
35 40 45
Glu Lys Thr Lys Leu His Gly Ala Asn Ser Cys Lys His Arg Phe
50 55 60
Cys Pro Val Cys Ser Trp Arg Lys Ser Arg Lys Asn Ala Leu Lys
65 70 75
Ile Ser Ile Leu Met Gln Tyr Leu Arg Glu Glu Glu Asn Lys Glu
80 85 90
Phe Val Phe Leu Thr Leu Thr Ala Pro Asn Val Thr Ala Asp Glu
95 100 105
Leu Asn Asp Glu Ile Gln His Tyr Asn Lys Ser Phe Lys Arg Leu
110 115 120
Met Glu Arg Lys Glu Val Lys Ala Ala Val Lys Gly Tyr Val Arg
125 130 135
Lys Leu Glu Val Thr Tyr Asp Gly Lys Glu Ser Ile Thr Lys Ser
140 145 150
Met Tyr Lys His Arg Thr Asn Tyr Tyr Lys Lys Arg Gly Leu Asn
155 160 165
Ile Gly Asp Lys Asn Pro Asn Tyr Asp Thr Tyr His Pro His Phe
170 175 180
His Val Val Leu Ala Val Asn Lys Thr Tyr Phe Asn Lys Pro Asn
185 190 195
Val Tyr Ile Arg Gln Ser Arg Trp Leu Glu Leu Trp Gln Gln Ser
200 205 210
Thr Lys Asn Pro Met Ile Thr Gln Val Asp Val Arg Arg Val Lys
215 220 225
His Thr Asp Asn Lys Lys Glu Val Ser Glu Ile Ala Lys Tyr Ser
230 235 240
Ala Lys Asp Ser Asp Tyr Leu Gln Asn Glu Lys Val Phe Asp Thr
245 250 255
Phe Phe Asn Ser Leu Ser Gly Lys Arg Leu Ile Val Tyr Ser Gly
260 265 270
Leu Phe Lys Glu Ala Ser Lys Met Tyr Asp Asn Lys Glu Leu Glu
275 280 285
Lys Tyr Lys Glu Met Asp Pro Thr Gln Tyr Ile Phe Leu Leu Phe
290 295 300
Tyr His Trp Gly Gln Thr Glu Tyr Ile Gln Thr Glu Gln Lys Leu
305 310 315
Met Ser Glu Asp Met Gln Lys Glu Val Asn Asn Gln Met Leu Asp
320 325 330
Asp Glu Asn Ile Glu Glu Glu
335
<210> 6
<211> 5779
<212> DNA
<213> 鹽水球菌菌株Salinicoccus sp.
<400> 6
ctgcaggcgg ccgcccatgg gatatcatcg atcatatgtc gccctatagt gagtcgtatt 60
acggtaccga gctcgaattc actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg ggaaaaccct 120
ggcgttaccc aacttaatcg ccttgcagca catccccctt tcgccagctg gcgtaatagc 180
gaagaggccc gcaccgatcg cccttcccaa cagttgcgca gcctgaatgg cgaatggcgc 240
ctgatgcggt attttctcct tacgcatctg tgcggtattt cacaccgcat atggtgcact 300
ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag ttaagccagc cccgacaccc gccaacaccc 360
gctgacgcgc cctgacgggc ttgtctgctc ccggcatccg cttacagaca agctgtgacc 420
gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat caccgaaacg cgcgagacga 480
aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca tgataataat ggtttcttag 540
acgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa 600
atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatat 660
tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg 720
gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa 780
gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt 840
gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt 900
ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg catacactat 960
tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg 1020
acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc ggccaactta 1080
cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat 1140
catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag 1200
cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa 1260
ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga taaagttgca 1320
ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa atctggagcc 1380
ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt 1440
atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc 1500
gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt ttactcatat 1560
atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt 1620
tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac 1680
cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc 1740
ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca 1800
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