本發(fā)明屬于天然藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種N-甲基-2，3，7，8-四羥基苯并菲啶季銨鹽的在制備抑制多巴脫羧酶藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

多巴脫羧酶(Dopa decarboxylase，DDC)又稱芳香氨基酸脫羧酶，可通過催化L-3，4-二羥基苯丙氨酸(L-DOPA)和L-5-羥色氨酸脫羧合成具有重要生理活性的神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺和5-羥色胺(Moore B M，et.al.J Biol.Chem，1996，271：23954-23959.)；同時(shí)還可催化部分芳香氨基酸脫羧生成對(duì)應(yīng)的生物胺。腦內(nèi)5-羥色胺含量降低將導(dǎo)致抑郁、焦慮等常見心境障礙；黑質(zhì)和紋狀體病變致使多巴胺合成減少還可導(dǎo)致帕金森癥發(fā)生(陳茹.中國康復(fù)理論與實(shí)踐，2007，13(7)：637-639.)。由于血腦屏障的存在，血液中的5-羥色胺和多巴胺很難進(jìn)入大腦(張?jiān)聭?zhàn).疑難病雜志，2013，12(5)：401-403.)。由于DDC在神經(jīng)系統(tǒng)和腎臟中活性較高，外周DDC抑制劑如卡比多巴能夠有效降低色氨酸、L-多巴在外周組織中脫羧降解率，臨床上目前被用于治療帕金森癥和緩解外周生物胺含量較高導(dǎo)致的不良癥狀(Burkhard P，Donminici P，et.al.Nature Structure Biology，2001，8(11)：963-967.)。此外，動(dòng)物腸道微生物分泌的色氨酸脫羧酶通過催化色氨酸在動(dòng)物腸道中代謝，影響色氨酸等限制性氨基酸吸收(印遇龍.豬氨基酸營養(yǎng)與代謝[M].北京：科學(xué)出版社，2008.)。有效抑制色氨酸脫羧酶能夠提高色氨酸等芳香氨基酸在腸道中的吸收率，促進(jìn)動(dòng)物生長。因此，進(jìn)一步研究多巴脫羧酶抑制劑在抗帕金森綜合癥和動(dòng)物生長促進(jìn)劑方面都有重要研究價(jià)值。文獻(xiàn)表明，目前已證實(shí)的DDC抑制劑主要有DDC底物類似物如卡比多巴、芐絲肼；表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯(Bertoldi M，Gonsalvi M，et.al.2001，284(1)：90-93.)；季胺類苯并菲啶類生物堿如血根堿等(Drata J，Ulrichova J，Walterova D.Journal of Enzyme Inhibition，1996，10(4)：231-237.)。其中，卡比多巴和芐絲肼對(duì)DDC的抑制機(jī)制已基本探明，是由抑制劑結(jié)構(gòu)中的肼基與DDC的輔酶磷酸吡哆醛之間形成腙鍵而與酶結(jié)合到一起，其鄰苯二酚結(jié)構(gòu)單元嵌入活性位點(diǎn)的裂縫并穿透到輔酶環(huán)平面的后方從而與DDC發(fā)生作用(Vassiliou A，F(xiàn)ragoulis E G，Vassilacopoulou D.Neurochemical Research，2009，34(6)：1089-1100.)。兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯等化合物對(duì)DDC的抑制機(jī)制尚無文獻(xiàn)進(jìn)行詳盡報(bào)道，但研究者根據(jù)被兒茶素沒食子酸酯鈍化后的DDC的特性做出推斷，抑制作用應(yīng)該歸因于DDC活性位點(diǎn)中不明殘基的共價(jià)修飾。由于血根堿具有與其他DDC抑制劑完全不同的結(jié)構(gòu)，血根堿對(duì)DDC抑制作用很存在新的機(jī)制：血根堿季銨正離子中心的C＝N雙鍵可接受DDC活性位點(diǎn)半胱氨酸殘基上的巰基(-SH)親核加成形成共價(jià)復(fù)合物影響DDC的催化活性，(Cheng P，Zhou J，Qing Z.et.al.Bioorg.Med.Chem.Lett.2014，24，2712-2716)。

雖然目前已有文獻(xiàn)報(bào)道了血根堿具有DDC抑制活性，但其抑制效果有限。血根堿在偏堿性條件下或在生物體內(nèi)容易轉(zhuǎn)化為6-羥基血根堿，還可以與巰基化合物共價(jià)復(fù)合，這些是血根堿的主要代謝失活方式。上述因素限制了血根堿在DDC抑制劑中的深入應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決血根堿的DDC抑制活性不理想，容易被巰基化合物例如二硫蘇糖醇鍵合失活等技術(shù)問題，本發(fā)明公開了一種N-甲基-2，3，7，8-四羥基苯并菲啶類化合物的DDC抑制劑，旨在提升DDC抑制活性。

另外，本發(fā)明還包括N-甲基-2，3，7，8-四羥基苯并菲啶類化合物及其制備方法。

一種N-甲基-2，3，7，8-四羥基苯并菲啶類化合物的應(yīng)用，用作多巴脫羧酶的抑制劑；所述的N-甲基-2，3，7，8-四羥基苯并菲啶類化合物具有式1結(jié)構(gòu)：

式1中，X^-為藥理上可接受的陰離子。

本發(fā)明中，苯并[C]菲啶母核上的多鄰酚羥基結(jié)構(gòu)配合所述的季銨正離子中心，有助于協(xié)同提升DDC的抑制活性，可應(yīng)用于制備多巴脫羧酶抑制劑類藥物等研究領(lǐng)域。

作為優(yōu)選，所述的應(yīng)用中，式1中，X^-為草酸根、醋酸根、苯磺酸根、甲磺酸根、硫酸氫根離子、鹵化物離子中的至少一種；進(jìn)一步優(yōu)選為硫酸氫根負(fù)離子。

本發(fā)明中，通過將所述的式1化合物(N-甲基-2，3，7，8-四羥基苯并菲啶季銨鹽)對(duì)人重組的多巴脫羧酶(DDC)的體外抑制活性來評(píng)價(jià)所述的式1化合物的DDC抑制性能。所述式1化合物對(duì)DDC的抑制活性評(píng)價(jià)步驟例如為：

依次在離心管中加入磷酸吡哆醛(PLP)、磷酸緩沖液、不同濃度式1化合物及人重組多巴脫羧酶(human recombinized DDC)溶液，密封37℃恒溫振蕩10min，加入左旋多巴(L-Dopa)溶液，密封37℃恒溫振蕩35min，取出立即沸水浴2min，冰浴2min，移入超濾離心管離心15min，取濾液液相檢測，依據(jù)液相色譜檢測結(jié)果確定L-Dopa脫羧轉(zhuǎn)化率，獲得抑制率-抑制劑濃度曲線，計(jì)算IC₅₀。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明所述的式1化合物的DDC的抑制活性較血根堿提高一個(gè)數(shù)量級(jí)。

此外，本發(fā)明還探索了所述的式1化合物在巰基化合物條件下的DDC抑制活性；步驟例如為：

依次在離心管中加入PLP、磷酸緩沖液、一定濃度式1化合物(也稱為化合物I)和不同濃度二硫蘇糖醇(DTT)的磷酸緩沖溶液，密封37℃恒溫振蕩10min，隨后加入人重組DDC溶液，密封37℃恒溫振蕩10min，再加入L-Dopa溶液，密封37℃恒溫振蕩35min，取出立即沸水浴2min，冰浴2min，移入超濾離心管離心15min，取濾液液相檢測。依據(jù)L-dopa脫羧轉(zhuǎn)化率獲得抑制率-DTT濃度曲線，研究DTT濃度對(duì)化合物I的抑制活性的影響。

通過所述的研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的DTT處理后的所述的化合物I仍具有較好的DDC抑制活性，具有良好的抗巰基化合物鍵合失活優(yōu)勢；可能是因?yàn)槭?化合物具有多個(gè)新的活性位點(diǎn)，通過各活性位點(diǎn)協(xié)同提升DDC的抑制效果的緣故。

本發(fā)明所述的式1化合物可有效抑制色氨酸、L-多巴在外周組織中脫羧降解率，可應(yīng)用于治療帕金森癥和緩解外周生物胺含量較高導(dǎo)致的不良癥狀等藥物的制備領(lǐng)域。例如，將所述的式1化合物或其藥學(xué)可接受的鹽和藥用載體和/或賦形劑應(yīng)用于制備多巴脫羧酶抑制劑類藥物。

所述的應(yīng)用中，作為優(yōu)選，將所述的式1化合物用于制備抗帕金森癥的藥物。

所述的優(yōu)選的應(yīng)用中，將式1化合物和/或藥用載體、藥用賦形劑制備抗帕金森癥的藥物。例如，將所述的式1化合物和/或藥用賦形劑應(yīng)用于制備抗帕金森癥的注射液、無菌粉針劑、片劑、口服液或膠囊。

所述的應(yīng)用中，作為優(yōu)選，將所述的式1化合物用于制備抗抑郁、焦慮藥物。

所優(yōu)選的應(yīng)用中，將所述的式1化合物和/或藥用載體、藥用賦形劑制備抗抑郁、焦慮藥物。例如，將所述的式1化合物和/或藥用賦形劑應(yīng)用于制備抗抑郁、焦慮的注射液、無菌粉針劑、片劑、口服液或膠囊。

本發(fā)明中，還提供了所述式1化合物的制備方法：由血根堿在酸液下水解而得；反應(yīng)方程式為方程式1：

其中，水解反應(yīng)過程的溫度為85～95℃；優(yōu)選為95℃。

本發(fā)明中，采用色譜法對(duì)反應(yīng)得到的粗產(chǎn)品進(jìn)行純化；純化過程中，采用AB-8樹脂，洗脫液為體積百分比為40～50％的甲酸水溶液，洗脫液流速為1～3BV/h。

作為優(yōu)選，所述的酸液為濃度為50～70wt％的硫酸水溶液；優(yōu)選為60wt％的硫酸水溶液。

作為優(yōu)選，水解反應(yīng)過程中還投加有間苯三酚，其中，血根堿、間苯三酚的投料摩爾比為1∶1～1.2。作為優(yōu)選，血根堿、間苯三酚的投料摩爾比1∶1。

本發(fā)明中，一種優(yōu)選的制備方法，包括以下步驟：

步驟(1)：水解：

以血根堿為起始原料，與一倍當(dāng)量的間苯三酚在70wt％的硫酸水溶液中95℃下水解反應(yīng)90分鐘；將水解反應(yīng)液傾入超純水中析晶，隨后再離心、超純水洗滌得式I的粗產(chǎn)物；

步驟(2)：純化：

將步驟(1)的粗產(chǎn)物用44％甲酸超聲溶解，隨后在AB-8大孔樹脂中進(jìn)行色譜分離，色譜分離采用的洗脫液為44vol％甲酸的水溶液，洗脫液流速為2BV/h。

有益效果

本發(fā)明所述的N-甲基-2，3，7，8-四羥基苯并菲啶類化合物具有優(yōu)良的抑制DDC作用，其對(duì)DDC抑制作用相較于血根堿提升了一個(gè)數(shù)量級(jí)；在巰基化合物二硫蘇糖醇的作用下DDC抑制活性仍然得到了保留。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1的血根堿水解反應(yīng)中控的HPLC--QTOF曲線圖；

圖2為實(shí)施例3的血根堿和化合物1的DDC抑制活性曲線圖；其中，(a)部分為血根堿的DDC抑制活性曲線及擬合曲線圖；(b)部分為化合物1的DDC抑制活性曲線及擬合曲線圖；

圖3為實(shí)施例4的不同濃度DTT處理下血根堿和化合物I對(duì)DDC的抑制率；其中，(a)部分為DTT處理下血根堿的DDC抑制活性曲線及擬合曲線圖；(b)部分為DTT處理下化合物I的DDC抑制活性曲線及擬合曲線圖。

具體實(shí)施方式

通過以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。

實(shí)施例1

N-甲基-2，3，7，8-四羥基苯并菲啶季銨鹽(I)制備(見方程式2)：

準(zhǔn)確稱取1g氯化血根堿及當(dāng)量間苯三酚(phloroglucinol)，加入30ml的60％濃硫酸，95℃下攪拌，分別在5、10、15、20、25、30、38、46、54、70min取少量反應(yīng)液滴入裝有少量超純水小瓶中，離心取沉淀和上清液進(jìn)行HPLC--QTOF檢測。由于血根堿具有兩個(gè)亞甲二氧基，脫去一個(gè)亞甲基將得到兩個(gè)酚羥基衍生物(II)，反應(yīng)時(shí)間延長，目標(biāo)產(chǎn)物I的轉(zhuǎn)化率逐步升高。根據(jù)不同反應(yīng)時(shí)間產(chǎn)物中氯化血根堿、化合物I的硫酸氫鹽和化合物II的硫酸氫鹽濃度與時(shí)間作圖，獲得化合物I轉(zhuǎn)化率-反應(yīng)時(shí)間曲線，如圖1所示，反應(yīng)時(shí)間為70min時(shí)，具有良好的選擇性。

實(shí)施例2

N-甲基-2，3，7，8-四羥基苯并菲啶季銨鹽(I)分離純化

將實(shí)施例1反應(yīng)產(chǎn)物加入200mL超純水中離心，棄去上清液，取沉淀反復(fù)用超純水洗滌3次，除去硫酸。沉淀用44％甲酸超聲溶解制成上樣液，備用。將預(yù)處理后的AB-8樹脂裝柱，所裝樹脂為內(nèi)徑4cm，樹脂高度為54cm，柱體積1BV＝678mL，樹脂上方用脫脂棉保護(hù)，使用1BV44％甲酸以3BV/h流速預(yù)淋洗樹脂柱，待樹脂柱上方液面距離脫脂棉5cm時(shí)準(zhǔn)備上樣，上樣流速控制為2BV/h，上樣完成后使用44％甲酸(水溶液)持續(xù)沖柱，流出液每100ml接一瓶，使用液相色譜進(jìn)行檢測，液相色譜檢測條件為：色譜柱(Unitary C18)；流動(dòng)相為0.1％甲酸-水(A)與乙腈(B)，洗脫程序?yàn)?-30min，10％B-90％B，流速為1mL/min；柱溫30℃，進(jìn)樣量5μL；檢測波長為270nm。根據(jù)檢測結(jié)果，將化合物I濃度為95％以上洗脫液合并，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮得到純品棕紅色粉末即為化合物I硫酸氫鹽。

性狀：棕紅色無定型粉末

分子式：C₁₈H₁₄NO₄⁺

理論分子量：308.0917，HPLC-QTOF-HRMS實(shí)測分子量：308.0915

¹H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：9.86(s，1H)，8.52(d，J＝8.8Hz，1H)，8.44(d，J＝8.8Hz，1H)，8.13(d，J＝8.8Hz，1H)，8.10(s，1H)，8.09(d，J＝8.8Hz，1H)，7.46(s，1H)，4.90(s，3H，NCH₃).¹³C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ：151.9，150.5，151.0，150.1，147.3，134.0，133.1，132.0，128.9，127.4，126.5，121.5，121.4，120.6，119.5，106.8，105.0，52.8，

實(shí)施例3

血根堿和化合物I(根據(jù)實(shí)施例2純化而得)對(duì)DDC的抑制活性研究

根據(jù)DDC抑制活性預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果將血根堿配制為2.29×10^-6mol/ml，化合物I濃度為3.044×10^-7mol/ml的溶液。酶促反應(yīng)體系使用的其余組分分別為：磷酸緩沖溶液為Na₂HPO₄-KH₂PO₄(0.02M，pH6.8)，人重組多巴脫羧酶(human recombinized DDC)磷酸緩沖溶液濃度為10μg/mL，PLP的磷酸緩沖溶液濃度為5×10^-6mol/mL，L-Dopa磷酸緩沖溶液為2.5×10^-6mol/ml。在確保反應(yīng)體系總體積為2mL和DDC濃度為40ng/uL的前提下，依次在離心管中加入15μL PLP溶液、磷酸緩沖液、不同濃度梯度的血根堿或化合物(I)的磷酸緩沖溶液以及DDC磷酸緩沖溶液，密封37℃恒溫振蕩10min，加入60μL左旋多巴(L-Dopa)磷酸緩沖溶液，密封37℃恒溫振蕩35min，取出立即沸水浴2min，冰浴2min，移入超濾離心管離心15min，取濾液液相檢測，依據(jù)液相色譜檢測結(jié)果確定L-Dopa脫羧轉(zhuǎn)化率，獲得抑制率-抑制劑濃度曲線如圖2所示。圖2很清晰的顯示出血根堿和化合物I均對(duì)AAD(也稱為DDC)表現(xiàn)出較明顯的抑制作用，抑制率隨抑制劑在體系中濃度增加呈非線性上升趨勢，根據(jù)Origin8.5分別對(duì)抑制曲線使用非線性擬合，根據(jù)得到的擬合方程進(jìn)行計(jì)算得出血根堿化合物I的IC₅₀分別為0.274mM和0.019mM?；衔颕的抑制活性較血根堿提高一個(gè)數(shù)量級(jí)。

實(shí)施例4

N-甲基-2，3，7，8-四羥基苯并菲啶季銨鹽I(實(shí)施例2純化得到的化合物I)對(duì)DDC雙重抑制機(jī)理研充

血根堿等季銨類苯并菲啶生物堿抑制DDC的機(jī)理可能為生物堿中烯胺正離子中心接受

DDC半胱氨酸殘基游離巰基(-SH)親核加成后形成生物堿-S-DDC共價(jià)復(fù)合物，從而影響酶的催化活性。二硫蘇糖醇(DTT)的巰基能夠與血根堿形成共價(jià)化合物，從而使血根堿失去DDC抑制活性，本發(fā)明中，可通過對(duì)比觀察血根堿與化合物I的在不同濃度DTT處理下對(duì)DDC的抑制活性差異來探充其抑制機(jī)制。

控制DTT處理的酶促反應(yīng)溶液總體積為2mL，DDC濃度為40ng/uL。在確保酶促反應(yīng)體系中的血根堿和化合物I濃度分別為0.922mmol/L和0.0323mmol/L的前提下，向離心管中加入不同濃度DTT溶液、15μL PLP溶液、磷酸緩沖液以37℃恒溫振蕩10分鐘。隨后向離心管中加入DDC的磷酸緩沖溶液，密封37℃恒溫振蕩10min，再加入60μL左旋多巴(L-Dopa)磷酸緩沖溶液，密封37℃恒溫振蕩35min，取出立即沸水浴2min，冰浴2min，移入超濾離心管離心15min，取濾液液相檢測，依據(jù)液相色譜檢測結(jié)果確定L-Dopa脫羧轉(zhuǎn)化率，獲得抑制率-抑制劑濃度曲線如圖3所示。當(dāng)反應(yīng)體系中DTT濃度為血根堿三倍時(shí)(2.5mmol/L)，血根堿對(duì)DDC的抑制活性消失。就化合物I而言，即使DTT在反應(yīng)體系中的濃度達(dá)到0.08mmol/L(超過化合物I濃度20倍)，化合物I對(duì)DDC仍然保持55％以上的抑制率，對(duì)DTT具有良好的耐受性。DTT處理實(shí)驗(yàn)可發(fā)現(xiàn)，化合物I對(duì)DDC的抑制活性可能具有新的機(jī)制，例如為：(1)化合物I的正離子中心能夠接受DDC活性位點(diǎn)殘基巰基的親核加成生成共價(jià)復(fù)合物，降低DDC催化活性；(2)化合物I的多酚羥基結(jié)構(gòu)能夠促進(jìn)其與DDC活性位點(diǎn)結(jié)合。

實(shí)施例5

含有式I的N-甲基-2，3，7，8-四羥基苯并菲啶季銨鹽及可藥用載體和/或賦形劑及其在多巴脫羧酶抑制劑類藥物中的應(yīng)用：

按實(shí)施例1和實(shí)施例2的方法先制得N-甲基-2，3，7，8-四羥基苯并菲啶季銨鹽，制成注射液、無菌熔封得粉針劑、制成粉劑、加入賦形劑制粒壓片、按常規(guī)口服液制法制成口服液、加入賦形劑制成膠囊或加入賦形劑制成膠囊。

本發(fā)明的化合物、用途和方法已經(jīng)通過具體的實(shí)施例進(jìn)行了描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本發(fā)明的內(nèi)容適當(dāng)改變?cè)?、工藝條件等環(huán)節(jié)來實(shí)現(xiàn)相應(yīng)的其它目的，其相關(guān)改變都沒有脫離本發(fā)明的內(nèi)容，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，都被視為包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。