本發(fā)明涉及基因工程及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說，涉及參與調(diào)控西瓜苦味素合成的轉(zhuǎn)錄因子及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：西瓜的苦味是由一類稱為葫蘆素E的三萜化合物導(dǎo)致的。西瓜果實中積累葫蘆素E會嚴(yán)重影響西瓜的口感及品質(zhì)。最近利用比較基因組學(xué)和生物化學(xué)、分子生物學(xué)方法，研究發(fā)現(xiàn)一個由10個基因組成的基因簇參與西瓜苦味的合成。盡管已經(jīng)基本確定了西瓜中苦味合成的分子機制，但調(diào)控苦味形成的分子機制目前還不清楚，相關(guān)基因也未被克隆。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供參與調(diào)控西瓜苦味素合成的轉(zhuǎn)錄因子ClBr和ClBt及其應(yīng)用。為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的參與調(diào)控西瓜苦味素合成的轉(zhuǎn)錄因子ClBr，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。所述轉(zhuǎn)錄因子ClBr基因的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。本發(fā)明的參與調(diào)控西瓜苦味素合成的轉(zhuǎn)錄因子ClBt，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。所述轉(zhuǎn)錄因子ClBt基因的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。本發(fā)明還提供含有所述轉(zhuǎn)錄因子ClBr和/或ClBt基因的載體、工程菌、宿主細胞及轉(zhuǎn)基因細胞系。本發(fā)明還提供所述轉(zhuǎn)錄因子ClBr在調(diào)控西瓜苦味合成中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供所述轉(zhuǎn)錄因子ClBr在無苦味西瓜分子育種中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供所述轉(zhuǎn)錄因子ClBt在調(diào)控西瓜苦味合成中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供所述轉(zhuǎn)錄因子ClBt在無苦味西瓜分子育種中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供用于鑒定無苦味西瓜的SNP分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記的核苷酸序列如SEQIDNO:5所示，SNP位點位于該序列的第382位堿基，此處堿基為T，則鑒定為無苦味西瓜品種。本發(fā)明還提供所述SNP分子標(biāo)記在西瓜分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供一種在植物中瞬時表達目的基因的方法，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，將攜帶有所述轉(zhuǎn)錄因子ClBr和/或ClBt基因的表達載體轉(zhuǎn)入植物中，獲得目的基因大量表達的轉(zhuǎn)基因植株。其中，所述植物包括西瓜、煙草等。在本發(fā)明的一個具體實施方式中，將所述轉(zhuǎn)錄因子ClBr或ClBt基因構(gòu)建到雙元表達載體pBIN-Plus上，利用化學(xué)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入農(nóng)桿菌EA105中。用含有目的基因的農(nóng)桿菌侵染植物組織，培養(yǎng)得到轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明還提供用于PCR擴增所述轉(zhuǎn)錄因子ClBr基因的引物對：ClBr上游引物：5′-TGAATTTCCATTCCCATTTGATCAAGCAGA-3′ClBr下游引物5′-GGTCAATTTATGTTGGAGTTCCGACACATCG-3′本發(fā)明還提供用于PCR擴增所述轉(zhuǎn)錄因子ClBt基因的引物對：ClBt上游引物5′-TGGAATTCAATGTTGAGTCCCCCTT-3′ClBt下游引物5′-GAAACATCAATGCTTGGATAGCAGCC-3′在前期黃瓜苦味素合成與調(diào)控的研究中，通過突變體測序發(fā)現(xiàn)了調(diào)控黃瓜葉片苦味合成的轉(zhuǎn)錄因子Bl，并且還通過遺傳定位，轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)了一個控制黃瓜果實合成的轉(zhuǎn)錄因子Bt，而此基因的啟動子區(qū)域的兩個突變：SV(structurevariation)和SNP，導(dǎo)致了黃瓜苦味表型發(fā)生了變化，SV變化使得黃瓜果實由野生的極苦表型變成了苦的表型，而SNP的變異使得黃瓜苦味徹底消失，Bt基因位于馴化區(qū)域內(nèi)，故Bt基因為馴化基因。在黃瓜基因組中，Bl、Csa5G157220和Bt基因組成一個基因簇。我們通過比較基因組學(xué)方法，在西瓜基因組(http://www.icugi.org/cgi-bin/ICuGI/genome/index.cgi？organism＝cucumber)中也發(fā)現(xiàn)了一個由五個basichelix-loop-helix(bHLH)型轉(zhuǎn)錄因子組成的基因簇。其中轉(zhuǎn)錄因子Cla011510(ClBr)在西瓜的根部特異表達，Cla011508(ClBt)在野生果實中特異表達，這兩個轉(zhuǎn)錄因子與苦味素合成基因呈現(xiàn)共表達模式，因此，我們推測Cla011510(ClBr)調(diào)控西瓜根中苦味素的合成，而Cla011508(ClBt)調(diào)控野生果實中苦味素的合成。為了進一步驗證，進行了酵母單雜交和凝膠阻滯實驗，證明轉(zhuǎn)錄因子ClBr和ClBt的確能夠結(jié)合到苦味素合成基因的啟動子區(qū)域。此外，還將苦味合成基因的啟動子連上報告基因(LUC)，在煙草中檢測轉(zhuǎn)錄因子對啟動子區(qū)域的激活作用，發(fā)現(xiàn)這兩個轉(zhuǎn)錄因子可以激活報告基因的表達。由于穩(wěn)定的西瓜轉(zhuǎn)基因體系還不成熟，因此，本發(fā)明建立了西瓜子葉瞬時表達系統(tǒng)，利用農(nóng)桿菌將ClBr和ClBt兩個轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入無苦味素的西瓜子葉中，一周后檢測子葉，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子和合成基因大量表達，從而導(dǎo)致子葉由不苦變成苦。綜合上述研究結(jié)果，本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了在西瓜根中和野生果實中調(diào)控苦味素合成的轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)控合成基因的表達從而進一步調(diào)控根部和野生果實中苦味的形成。在前期黃瓜苦味素的合成與調(diào)控、馴化研究中發(fā)現(xiàn)，控制黃瓜果實苦味的轉(zhuǎn)錄因子Bt是馴化基因，那么在西瓜中控制果實苦味的基因ClBt基因是否也是馴化基因，其突變位點的具體位置等。為了解決這個問題，我們對栽培和野生西瓜基因組中的變異位點做了核酸多樣性分析，發(fā)現(xiàn)ClBt基因確實位于馴化區(qū)域內(nèi)，由此推測葫蘆科植物中存在協(xié)同馴化的現(xiàn)象。并且通過比較分析7份野生西瓜材料和13份栽培材料中ClBt基因的序列，發(fā)現(xiàn)了一個關(guān)鍵SNP位點，該位點的突變使得蛋白翻譯提前終止。本發(fā)明進一步揭示了西瓜苦味形成的分子機制，為無苦味西瓜育種提供了理論依據(jù)和分子輔助育種目標(biāo)。附圖說明圖1為本發(fā)明實施例1中涉及黃瓜苦味素葫蘆素C和西瓜苦味素葫蘆素E的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。圖2為本發(fā)明實施例1中用比較基因組學(xué)方法來分析調(diào)控西瓜苦味素合成的轉(zhuǎn)錄因子。圖3為本發(fā)明實施例1中用實時熒光定量PCR，來分析候選轉(zhuǎn)錄因子在各個組織中的表達量情況。圖4顯示出本發(fā)明實施例1中兩個轉(zhuǎn)錄因子ClBr和ClBt能夠直接激活葫蘆素E合成基因的表達。圖5為本發(fā)明實施例1中用酵母單雜交系統(tǒng)和煙草瞬時表達系統(tǒng)證明ClBr和ClBt可以結(jié)合到葫蘆素E合成基因的啟動子上(a)，并激活下游報告基因轉(zhuǎn)錄(b)。圖6為本發(fā)明實施例1中用凝膠阻滯系統(tǒng)證明ClBr和ClBt可以結(jié)合到葫蘆素E合成基因的啟動子上；其中，a:Cl160(Cla007077),b:Cl170(Cla007078),c:Cl180(Cla007079),d:ClBi(Cla007080),e:ClACT(Cla007081),f:Cl710(Cla007082),g:Cl490(Cla017252),h:Cl890A(Cla008355),i:Cl890B(Cla008354),j:Cl510(Cla016164),k:Cl560B(Cla016162)。圖7為本發(fā)明實施例1中野生苦的西瓜中ClBt基因與栽培不苦西瓜中ClBtdel基因比對，發(fā)現(xiàn)一個關(guān)鍵SNP位點，突變后使得栽培不苦西瓜中ClBtdel基因翻譯提前終止。圖8為本發(fā)明實施例1中用酵母單雜交系統(tǒng)(a)、煙草瞬時表達系統(tǒng)(b)和凝膠阻滯系統(tǒng)(c)證明栽培西瓜ClBtdel不能激活苦味合成基因的表達。圖9為本發(fā)明實施例2中用西瓜子葉瞬時表達系統(tǒng)來驗證ClBr和ClBt的生物學(xué)功能，當(dāng)ClBr或ClBt表達后導(dǎo)致苦味合成基因表達升高，最終使苦味物質(zhì)葫蘆素E的含量升高，而ClBtdel表達后不能激活苦味合成基因的表達量。圖10為本發(fā)明實施例3中通過對野生和栽培西瓜材料核酸多樣性分析，發(fā)現(xiàn)西瓜的ClBt基因也位于馴化區(qū)域內(nèi)；其中，上圖代表黃瓜；下圖代表西瓜。具體實施方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例均按照常規(guī)實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊(SambrookJ&RussellDW,MolecularCloning:aLaboratoryManual,2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。實施例1調(diào)控西瓜葫蘆素E合成的轉(zhuǎn)錄因子挖掘與獲得1、候補基因的挖掘通過比較發(fā)現(xiàn)西瓜中，苦味素葫蘆素E和黃瓜中苦味素葫蘆素C結(jié)構(gòu)非常相似(圖1)，故推測其合成機制應(yīng)該比較相似，因此我們利用比較基因組學(xué)，在西瓜基因組上發(fā)現(xiàn)了存在一個類似于調(diào)控黃瓜苦味合成的基因簇(圖2)，該基因簇由5個bHLH型轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)成，通過熒光定量PCR，進行基因表達量分析，發(fā)現(xiàn)基因ClBr在根中特異表達，ClBt基因在野生果實中特異表達，并且兩個基因的表達趨勢與西瓜各個組織中的苦味素含量保持一致(圖3)，我們根據(jù)黃瓜苦味調(diào)控的經(jīng)驗，推測ClBr基因應(yīng)該控制著西瓜根部苦味素的合成，ClBt控制著果實中苦味素的合成，為了進一步研究ClBt基因的差異，我們比較了13份栽培無苦味西瓜和7份野生苦味西瓜中此基因的序列，通過序列比對發(fā)現(xiàn)，栽培西瓜中一個關(guān)鍵SNP位點的變異使得其蛋白翻譯提前終止。這進一步驗證了我們的推測。2、野生苦味西瓜ClBr和ClBt基因的功能驗證首先制備西瓜根和果實的cDNA文庫，然后利用正向引物和反向引物(表1)進行PCR擴增。表1引物序列(5′-3′)ClBr-TVector-FTGAATTTCCATTCCCATTTGATCAAGCAGAClBr-TVector-RGGTCAATTTATGTTGGAGTTCCGACACATCGClBt-TVector-FTGGAATTCAATGTTGAGTCCCCCTTClBt-TVector-RGAAACATCAATGCTTGGATAGCAGCCPCR反應(yīng)體系以20μL計為：10-20ng/μL模板1μL，10pmol/μL正向、反向引物各1μL，10mmol/LdNTPmix0.4μL，0.5U/μL高保真TaqDNA聚合酶1μL，10×PCR反應(yīng)緩沖液2μL，余量為水。PCR反應(yīng)條件為：94℃5分鐘；94℃20秒，55℃20秒，72℃1分，35個循環(huán)；72℃10分鐘。將擴增得到的片段與T-載體(TAKARA)連接，測序確認(rèn)沒有突變。ClBr基因的核苷酸序列SEQIDNo.3所示，其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，ClBt基因的核苷酸序列SEQIDNo.4所示，其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。圖4表明兩個轉(zhuǎn)錄因子ClBr和ClBt能夠直接激活葫蘆素E合成基因的表達。采用酵母單雜交證明ClBr、ClBt能夠結(jié)合到苦味合成基因Cl160(Cla007077)、Cl170(Cla007078)、Cl180(Cla007079)、ClBi(Cla007080)、ClACT(Cla007081)、Cl710(Cla007082)、Cl490(Cla017252)、Cl890A(Cla008355)、Cl890B(Cla008354)、Cl510(Cla016164)和Cl560B(Cla016162)的啟動子區(qū)域(圖5a)。此外，還將苦味合成基因的啟動子連上報告基因(LUC)，在煙草中檢測轉(zhuǎn)錄因子對啟動子區(qū)域的激活作用，發(fā)現(xiàn)它可以激活報告基因的表達(圖5b)。隨后，通過凝膠阻滯實驗也證明了ClBr、ClBt與合成基因啟動子的互作(圖6)。3、栽培無苦味西瓜ClBtdel基因的功能驗證栽培無苦味西瓜ClBtdel基因序列如SEQIDNo.5所示(第382位堿基為T)。圖7為野生苦的西瓜中ClBt基因與栽培不苦西瓜中ClBtdel基因比對，發(fā)現(xiàn)一個關(guān)鍵SNP位點，突變后使得栽培不苦西瓜中ClBtdel基因翻譯提前終止。利用相同的實驗體系，證明了栽培西瓜ClBtdel基因不能夠與苦味合成基因啟動子互作(圖8)。實施例2利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時表達方法驗證控制西瓜苦味合成轉(zhuǎn)錄因子的功能由于穩(wěn)定的西瓜轉(zhuǎn)基因體系還不成熟，因此在本實施例中建立了西瓜子葉瞬時表達系統(tǒng)，進一步驗證ClBr和ClBt的功能。將ClBr、ClBt和ClBtdel基因構(gòu)建到雙元表達載體pBIN-Plus上。利用化學(xué)轉(zhuǎn)化分別導(dǎo)入農(nóng)桿菌EA105中。將含有目的基因的農(nóng)桿菌培養(yǎng)至OD600約1.0，然后用注射緩沖液稀釋到OD600約0.4左右，用不帶針頭的注射器將農(nóng)桿菌注入10天左右的西瓜幼苗子葉。一周后收集葉片，用甲醇提取葉片中的化合物，然后進行UPLC-Q-TOF(Agilent)檢測及相關(guān)表達量分析。結(jié)果如圖9所示，ClBr、ClBt基因在子葉中的表達導(dǎo)致ClBi的基因的表達，從而促使葫蘆素E的合成，而ClBtdel不能促進ClBi基因的表達。實施例3西瓜ClBt基因?qū)儆隈Z化基因在前期黃瓜苦味素的合成與調(diào)控、馴化研究中發(fā)現(xiàn)，控制黃瓜果實苦味的轉(zhuǎn)錄因子Bt是馴化基因。通過對野生和栽培西瓜材料核酸多樣性分析，發(fā)現(xiàn)西瓜的ClBt基因位于馴化區(qū)域內(nèi)，故在葫蘆科植物中苦味存在協(xié)同馴化現(xiàn)象(圖10)。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。序列表<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所<120>參與調(diào)控西瓜苦味素合成的轉(zhuǎn)錄因子及其應(yīng)用<130>KHP161118603.5Q<160>9<170>PatentInversion3.3<210>1<211>247<212>PRT<213>西瓜<400>1MetGluLeuGluCysIleGluPheProPheProPheAspGlnAlaAsp151015GluLeuPheProLeuProSerLeuThrProIleAspLeuSerValSer202530GlnProProLeuIleCysSerLysAsnLysAsnAspLysAsnAlaSer354045GluLysProLysAsnAsnArgArgArgLysSerProAsnThrSerAsp505560AspIleGluAspGluAsnProAsnGluHisLysLysLysLysIleIle65707580HisArgAspValGluArgGlnArgArgGlnGluMetSerThrLeuTyr859095SerThrLeuArgSerLeuLeuProLeuGluTyrLeuLysGlyLysArg100105110SerIleCysAspHisMetHisGluThrValLysTyrIleGlnHisMet115120125GlnSerLysIleGlnLysLeuThrAsnLysArgAspGluLeuLysLys130135140AspIleGluAspAspSerAsnIleSerThrIleGluThrLeuAsnSer145150155160SerLysArgAspCysValValValLysProArgSerGlyGlyPheGln165170175IleLeuLeuAspThrAlaThrGlnHisArgLeuProLeuSerAsnLeu180185190LeuLysPheLeuLeuThrGluArgLeuGluIleIleSerCysHisSer195200205ThrLysIleAsnAspArgPheLeuHisThrIleGluSerGluAlaIle210215220AspIleGlyThrIleAspValSerGluLeuGlnHisLysLeuThrAsn225230235240LeuGluTyrPheProLeuAsp245<210>2<211>249<212>PRT<213>西瓜<400>2MetGluPheAsnValGluSerProPheSerPheAspLeuGlyAspAsp151015LeuPheAsnLeuProSerLeuProSerSerSerIleSerProProPhe202530AspAsnGlyAsnLeuValValSerLysLysGlnLysAsnGlyArgArg354045ArgLysLysThrAlaProProAspThrHisAsnAsnGluAsnGlySer505560GluValLeuAspGluGlnLysLysLysLysLeuIleHisArgAspVal65707580GluArgGlnArgArgGlnGluMetSerSerLeuTyrThrThrLeuArg859095SerLeuLeuProLeuGluTyrLeuLysAspLysArgSerIleSerAsp100105110HisIleHisGluThrValAsnTyrIleGlnHisIleGlnLysArgIle115120125GlnGlnLeuSerAspLysArgAspGluLeuArgLysLeuSerAspGly130135140AsnMetAspAlaIleSerMetAlaLysThrLeuAsnSerSerHisArg145150155160AspPheValValValArgAlaLysLysGlyLeuGlyIleGlnValVal165170175IleAsnThrAlaThrLysHisLysLeuProValSerAsnPheLeuGln180185190AlaLeuAlaAlaGluGlyLeuGluIleLeuSerCysAsnSerThrLys195200205LeuAsnGluArgPheValHisThrIleGluCysGlnProIleValAsn210215220AspGlyCysTyrProSerIleAspValSerGluLeuGlnHisLysLeu225230235240ThrAsnLeuGluTyrPheProLeuAsp245<210>3<211>744<212>DNA<213>西瓜<400>3atggaattagaatgtattgaatttccattcccatttgatcaagcagatgaattatttcca60cttccttcccttacccctatagacctctctgtttctcagcctccattgatctgttccaag120aacaagaatgacaaaaatgcctccgaaaagcccaaaaataatcgtcggcgaaagtctccg180aacacttccgatgatatcgaagacgagaacccgaacgaacacaaaaaaaagaagatcatc240cacagagatgttgaacgccaaagaaggcaagaaatgtccactctttactccactcttcgt300tcacttctcccgcttgaatatcttaaggggaagcgatcaatatgtgatcacatgcatgaa360acagtgaagtacatacaacatatgcaaagcaagattcaaaagctaacgaacaagagagat420gagctgaaaaaagacattgaggatgattcaaacattagtacaatcgaaacattaaactcc480tcaaaaagggattgtgtggtagtaaagccaagatcgggaggatttcaaattcttctagac540acagccactcaacataggctcccactttcaaatcttctaaaatttctacttactgaaagg600cttgaaatcattagttgccattccaccaagataaatgacaggttcctccacactattgaa660tctgaagctatcgatattggaaccatcgatgtgtcggaactccaacataaattgaccaat720ttagaatattttccattagattaa744<210>4<211>750<212>DNA<213>西瓜<400>4atggaattcaatgttgagtcccccttctcatttgatttaggagatgacctatttaatctg60ccttctcttccatcgtcttctatctctccgcccttcgacaatggtaacctcgtcgtgtcc120aaaaagcaaaaaaatggccgccgacgaaagaagacagcgccgcccgacactcacaacaat180gaaaatggcagtgaggttttggatgaacagaaaaagaagaagttaatacatagagatgtg240gagcgacaaagaagacaagaaatgtcttctctttacaccactcttcgctcacttctccct300cttgaatacctcaaggataaaaggtcaatatccgaccatatacatgagacagttaattac360attcaacatatacaaaaaagaatccaacaattgtctgataaaagagatgagctaagaaaa420ctctccgacggaaacatggatgccat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