本發(fā)明屬于生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種核盤(pán)菌異核體不親和YD-7蛋白及其編碼基因與其在抗油菜菌核病方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

油菜是重要的經(jīng)濟(jì)作物。來(lái)自油菜的菜籽油是人類最主要的食用油來(lái)源之一，是我國(guó)糧油安全保障的重要一環(huán)，為我國(guó)重要的戰(zhàn)略物質(zhì)之一。目前，我國(guó)的食用油將近60％依賴進(jìn)口。制約我國(guó)油菜產(chǎn)量與品質(zhì)提高的重要限制因素之一是核盤(pán)菌對(duì)田間油菜的危害。核盤(pán)菌是一種廣譜性真菌，能寄生和侵害75科278屬的450多種植物(Boland GJ,Hall R.Can J Plant Pathol,1994,16:93-100)。由它引起的菌核病是一種世界范圍性嚴(yán)重病害，是我國(guó)油菜最主要病害，嚴(yán)重影響大豆、番茄、油菜等的品質(zhì)和產(chǎn)量。比如，一般年份油菜菌核病發(fā)病率為10％-30％，嚴(yán)重的時(shí)候可以達(dá)到80％以上(費(fèi)維新,李強(qiáng)生,吳新杰.中國(guó)油料作物學(xué)報(bào),2002,3:47-49)。

目前，油菜抗菌核病的研究處于領(lǐng)先地位，如何防治油菜抗菌核病主要有如下途徑：農(nóng)藥與生物防治、選育抗(耐)菌核病材料、基因工程方法。通過(guò)這些途徑，取得了一些成績(jī)，篩選到一些抗(耐)病性比較好的材料，但是生產(chǎn)中菌核病危害嚴(yán)重的問(wèn)題依然存在(劉正立,劉春林.甘藍(lán)型油菜抗菌核病研究進(jìn)展.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2015,31(15):114-123)。

基因工程途徑解決菌核病危害的問(wèn)題，應(yīng)該是一條可行的途徑，可是現(xiàn)有的思路與轉(zhuǎn)基因?qū)嵺`并未獲得顯著提高抗菌核病的植物材料。為此，與以往基因工程的策略不同，本發(fā)明人改變思路，采用“以毒攻毒”的思想，克隆核盤(pán)菌中推測(cè)為異核體不親和YD-7的基因，并構(gòu)建該基因的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒；然后將核盤(pán)菌異核體不親和YD-7蛋白基因轉(zhuǎn)入植物中，以期獲得具有抗菌核病的植物種質(zhì)資源。本發(fā)明通過(guò)基因工程的方法，首次發(fā)現(xiàn)核盤(pán)菌異核體不親和YD-7蛋白及其編碼基因，該基因可顯著提高植物對(duì)核盤(pán)菌的抗性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是，針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種來(lái)源于油菜病原菌核盤(pán)菌的核盤(pán)菌異核體不親和YD-7蛋白及其編碼基因，同時(shí)提供該基因在植物抗核盤(pán)菌中的應(yīng)用。

為達(dá)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：一種核盤(pán)菌異核體不親和YD-7蛋白，來(lái)源于油菜致病菌核盤(pán)菌(Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary)，是下述氨基酸殘基序列之一：

1)序列表中的SEQ ID No:1；

2)將序列表中的SEQ ID No:1的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一至五個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且對(duì)提高植物抗菌核病作用的蛋白質(zhì)。

編碼本發(fā)明核盤(pán)菌異核體不親和YD-7蛋白的基因(YD-7)，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中的SEQ ID No:2的核苷酸序列；

2)編碼序列表中的SEQ ID No:1蛋白質(zhì)序列的DNA；

3)與序列表中的SEQ ID No:2限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且編碼相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列；

4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中的SEQ ID No:2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。

上述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為：用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在65℃下雜交并洗膜。

序列表中的SEQ ID No:2由909個(gè)堿基組成，其編碼框?yàn)樽?’端第1-906位堿基，編碼具有序列表中的SEQ ID No:1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。

本發(fā)明還包括含有本發(fā)明基因的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和工程菌以及擴(kuò)增該基因中任一片段的引物對(duì)。

本發(fā)明還提供上述的核盤(pán)菌異核體不親和YD-7蛋白基因在調(diào)控植物抗菌核病中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供將編碼上述核盤(pán)菌異核體不親和YD-7蛋白的基因轉(zhuǎn)入模式植物擬南芥中，經(jīng)培育得到轉(zhuǎn)基因植物，該轉(zhuǎn)基因植物的抗菌核病能力得到提高，從而得到抗核盤(pán)菌侵染的高抗菌核病的植物種質(zhì)資源。該植物為雙子葉植物和單子葉植物。

本發(fā)明的核盤(pán)菌異核體不親和YD-7蛋白基因的過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植物對(duì)菌核病抗性顯著提高。本發(fā)明為植物提高抗菌核病提供了一個(gè)優(yōu)質(zhì)基因。本發(fā)明的蛋白質(zhì)及其編碼基因具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，應(yīng)用前景廣闊。

附圖說(shuō)明

圖1是核盤(pán)菌菌核在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5天生長(zhǎng)情況。

其中，5d代表生長(zhǎng)到第5天時(shí)的菌絲分別情況，S3表示緊靠培養(yǎng)皿壁的發(fā)育中的新菌核。

圖2是從發(fā)育中的核盤(pán)菌菌核中分離出的總RNA電泳圖。

其中：M為指示DNA片段大小的DNA分子標(biāo)記，1、2為核盤(pán)菌菌核樣品；該兩個(gè)樣品來(lái)源的RNA都有明顯5S rRNA、18S rRNA和28S rRNA三條帶，說(shuō)明RNA質(zhì)量可靠，能用于下一步反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

圖3是核盤(pán)菌異核體不親和YD-7蛋白基因全長(zhǎng)CDS的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖。

其中，M為DNA片段分子量大小的100bp plus Ladder DNA標(biāo)記，1為全長(zhǎng)CDS的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物帶。

圖4是構(gòu)建的YD-7基因過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的菌落PCR驗(yàn)證電泳圖。

其中：M為指示DNA片段大小的DNA分子標(biāo)記，1-7為過(guò)表達(dá)質(zhì)粒單菌落，8為空白對(duì)照。

圖5是構(gòu)建的YD-7基因的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的酶切驗(yàn)證電泳圖。

其中：1為經(jīng)NcoI和XbaI雙酶切的表達(dá)質(zhì)粒，2為未經(jīng)酶切的表達(dá)質(zhì)粒。

圖6是轉(zhuǎn)pFGC5941-YD-7CDS質(zhì)粒的油菜抗性苗的轉(zhuǎn)基因PCR檢測(cè)電泳圖。

其中：1-2為非轉(zhuǎn)基因植株；3-8為過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株；9為空白對(duì)照，10為陽(yáng)性對(duì)照；M為DNA片段分子量大小的100bp plus Ladder DNA標(biāo)記。

圖7是轉(zhuǎn)基因植株中目標(biāo)基因表達(dá)的RT-PCR檢測(cè)圖。

其中：1-6為轉(zhuǎn)基因植株；BnaACTIN2為油菜看家基因的表達(dá)情況，作為表達(dá)量的相對(duì)參照；YD-7為轉(zhuǎn)基因植株中YD-7基因的相對(duì)表達(dá)量。

圖8是核盤(pán)菌接種油菜的抗性試驗(yàn)圖。

其中：A為轉(zhuǎn)基因植株，B為受體植株。從菌斑大小和葉片生長(zhǎng)大小可以看出轉(zhuǎn)YD-7基因的植株抗菌核病能力顯著提高。

圖9是轉(zhuǎn)pFGC5941-YD-7CDS質(zhì)粒擬南芥抗性苗的轉(zhuǎn)基因PCR檢測(cè)電泳圖。

其中：M為DNA片段分子量大小的100bp plus Ladder DNA標(biāo)記；+為陽(yáng)性對(duì)照；-為陰性對(duì)照；1-5為轉(zhuǎn)基因植株；6為非轉(zhuǎn)基因植株。

圖10是擬南芥轉(zhuǎn)基因植株中目標(biāo)基因表達(dá)的RT-PCR檢測(cè)圖。

其中：1-5為轉(zhuǎn)基因植株；ACTIN2為擬南芥看家基因的表達(dá)情況，作為表達(dá)量的相對(duì)參照；YD-7為轉(zhuǎn)基因植株中YD-7基因的相對(duì)表達(dá)量。

圖11是核盤(pán)菌接種擬南芥的抗性試驗(yàn)圖。

其中：A受體植株，B為轉(zhuǎn)基因植株；從菌斑大小可以看出轉(zhuǎn)YD-7基因的植株抗菌核病能力顯著提高。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中的方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。所用引物和測(cè)序工作由上海生工生物科技有限公司完成。

實(shí)施例1.核盤(pán)菌總RNA分離與異核體不親和YD-7蛋白基因全長(zhǎng)CDS的克隆

一、核盤(pán)菌總RNA分離與第一互補(bǔ)鏈cDNA的合成

在超凈工作臺(tái)上，將核盤(pán)菌菌株SS-3(由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供)的菌核用75％的乙醇消毒5min，用滅菌蒸餾水沖洗3次，滅菌后的菌核接種到帶PDA固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中央；接種后培養(yǎng)皿放置在培養(yǎng)箱中，25℃暗培養(yǎng)5天。暗培養(yǎng)第五天，沿著培養(yǎng)皿壁會(huì)有新的菌核形成(圖1)。從接種后培養(yǎng)第5天的培養(yǎng)皿中，取發(fā)育中的菌核約100mg放入1.5mL離心管中，蓋緊管蓋，迅速轉(zhuǎn)移至液氮中速凍；往離心管中加入700μL REB(RNA extraction buffer(REB)組成：1M Tris-HCl(pH＝8)40mL，0.5M EDTA(pH＝8)10mL，LiCl 3.4g，SDS 2g，H₂O定容至200mL)，并用電動(dòng)研磨棒快速研磨；研磨充分后，加入700μL水飽和酚，劇烈振蕩，12000×g，4℃離心10min；取上清液至1.5mL離心管中，并加入600μL氯仿，充分振蕩，12000×g，4℃離心10min；取上清液至另一個(gè)1.5mL離心管中，加入200μL的冷乙醇和40μL 3M的NaAc，-20℃靜置20min以上；12000×g，4℃離心10min后棄上清液，加入700μL的75％乙醇(DEPC處理水配制)，洗滌沉淀；11000×g，4℃離心5min后棄上清液，將帶有總RNA沉淀的離心管放入生物安全柜中吹干，至沉淀為半透明狀，然后加入40μL無(wú)RNA酶水(RNase-free水)溶解RNA 5min左右；整個(gè)操作要帶口罩及一次性手套。

取RNA溶液5μL與1×loading buffer(6×loading buffer：30mM EDTA,36％(v/v)甘油,0.05％(w/v)溴酚藍(lán))混合，用1.5％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，見(jiàn)圖2。結(jié)果顯示：第二泳道的28S rRNA的亮度大約是18S rRNA的2倍，而且5S的條帶較弱，未見(jiàn)DNA殘留，表明提取的核盤(pán)菌RNA質(zhì)量較好，純度較高，可用于下一步反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。提取的總RNA溶液經(jīng)DNAase酶消化后，利用Thermo Scientific公司商業(yè)化的Revertaid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒合成cDNA(具體步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作)，反轉(zhuǎn)錄成的cDNA用于下一步Y(jié)D-7基因全長(zhǎng)CDS的克隆的PCR模板。

二、核盤(pán)菌YD-7基因全長(zhǎng)CDS克隆

從NCBI網(wǎng)站上查找核盤(pán)菌凝集素目標(biāo)基因的參考序列為XM_001584918，根據(jù)參考的CDS全長(zhǎng)序列，使用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)YD-7基因全長(zhǎng)CDS的PCR引物對(duì)，引物序列分別為正向引物YD-7CDSF：5’－TCTAGAATGCTGCTCAAACCACTT－3’(SEQ ID No:3，下劃線表示為XbaI酶切位點(diǎn))和反向引物YD-7CDSR：5’－CCATGGTCAACCACTAGCAACATGTAC－3’(SEQ ID No:4，下劃線表示為NcoI酶切位點(diǎn))。以前述反轉(zhuǎn)錄成的cDNA為模板，高保真PCR擴(kuò)增YD-7基因的全長(zhǎng)CDS序列。PCR反應(yīng)體系(50μl)包含：模板2μl，高保真酶Phusion High-fidelity DNA Polymerase(Invitrogen)1μl，10×緩沖液5μl，2.5uM dNTP 8μl，20μM的正向和反向引物各1μl，水32μl。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2分鐘；94℃變性30秒，57℃退火30秒，68℃延伸1分鐘，共30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖3，擴(kuò)增得到一條909bp大小的DNA片段，與預(yù)期的目標(biāo)片段大小相符。將擴(kuò)增片段回收并純化后，將其克隆到載體pEASY-Blunt Cloning(購(gòu)自全式金公司)中，得到含有目的片段的重組質(zhì)粒pEASY-YD-7CDS，經(jīng)轉(zhuǎn)化、篩選后測(cè)序，結(jié)果見(jiàn)SEQ ID No:2所示的核苷酸序列，其由909個(gè)堿基組成，其編碼框?yàn)樽?’端第1-906位堿基(最后三個(gè)堿基為終止密碼子TGA)，編碼具有序列表中的SEQ ID No:1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì),為302個(gè)氨基酸殘基，編碼的蛋白命名為YD-7。

實(shí)施例2.YD-7基因過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

選擇測(cè)序正確的pEASY-YD-7CDS重組質(zhì)粒，與pFGC5941質(zhì)粒分別同時(shí)用Fast Digest Enzyme NcoI和XbaI(Fermetans)兩種質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，酶切溫度37℃，酶切時(shí)間為30-40min，反應(yīng)體系40μL(1μg質(zhì)粒DNA，2μL10×FastDigest Green Buffer，0.5μL FastDigest NcoI，0.5μL FastDigest XbaI，加水至40μL)，具體按照Fermetans公司試劑盒說(shuō)明進(jìn)行；酶切產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1.5％瓊脂糖凝膠電泳分離后，切下目的條帶，用膠回收試劑盒純化回收，將回收的兩個(gè)目標(biāo)DNA片段通過(guò)T4連接酶連接，連接產(chǎn)物通過(guò)熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Esherichia coli)DH5α，轉(zhuǎn)化細(xì)胞在液體LB培養(yǎng)基中，37℃、200rpm的條件下復(fù)蘇1h；將經(jīng)過(guò)恢復(fù)培養(yǎng)的細(xì)胞均勻涂于含卡那霉素(50μg/mL)的LB固體培養(yǎng)皿上，37℃培養(yǎng)16h。挑取LB固體培養(yǎng)基上的單菌落，以引物35SF：5'-CTATCCTTCGCAAGACCCTTC-3'(SEQ ID No.5)和YD-7CDSR(SEQ ID No.4)進(jìn)行菌落PCR鑒定，見(jiàn)圖4，顯示PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳帶在1000bp與900bp之間，結(jié)果與預(yù)期的片段大小一致。選擇PCR檢測(cè)正確的單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，以Fast Digest Enzyme NcoI和XbaI進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，見(jiàn)圖5，雙酶切片段弱大于1000bp，與預(yù)期的片段大小一致。PCR鑒定和雙酶切鑒定兩種結(jié)果都說(shuō)明過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pFGC5941-YD-7CDS構(gòu)建成功。

實(shí)施例3.甘藍(lán)型油菜轉(zhuǎn)化及分子鑒定與轉(zhuǎn)基因油菜抗菌核病檢測(cè)

一、甘藍(lán)型油菜轉(zhuǎn)化

一)外植體的準(zhǔn)備

選取甘藍(lán)型油菜易感病品種“98C40”完整飽滿的種子約100顆，置于150mL三角瓶中。向裝有種子的三角瓶中加入20-30mL 75％乙醇，振蕩消毒30s，棄去酒精；再加入20mL 0.1％HgCl₂和1滴TWEEN-20的消毒液，劇烈搖晃至起泡，靜置20min，棄去消毒液，用無(wú)菌水反復(fù)沖洗3-5遍以洗凈泡沫；加入50mL經(jīng)高溫滅菌的無(wú)菌水浸泡種子，浸泡時(shí)間為1h；倒掉無(wú)菌水，把種子均勻鋪在含有1/2MS固體培養(yǎng)基上，22℃暗培養(yǎng)4-5d。待油菜幼苗長(zhǎng)到4-5cm后將其轉(zhuǎn)移到光照條件下生長(zhǎng)6-8h，使幼苗子葉轉(zhuǎn)綠。子葉柄作為轉(zhuǎn)化的外植體。

二)農(nóng)桿菌的準(zhǔn)備

幼苗生長(zhǎng)到1-2cm時(shí)，開(kāi)始準(zhǔn)備菌液。將分別帶有pFGC5941-YD-7CDS質(zhì)粒的農(nóng)桿菌LBA4404菌株在含50mg/mL卡那霉素、50mg/mL鏈霉素和100mg/mL利福平的YEB固體培養(yǎng)基上劃線，28℃恒溫培養(yǎng)3d。挑取單菌落于10mL含50mg/mL卡那霉素、50mg/mL鏈霉素和100mg/mL利福平的YEB液體培養(yǎng)基中，28℃、200rpm擴(kuò)大培養(yǎng)16-18h。吸取1mL菌液加入到50mL含50mg/mL卡那霉素、50mg/mL鏈霉素和100mg/mL利福平的YEB液體培養(yǎng)基中，擴(kuò)大培養(yǎng)至菌液OD₆₀₀達(dá)到0.4-0.8。

三)子葉柄的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化與抗性苗篩選

將油菜幼苗子葉柄從生長(zhǎng)點(diǎn)以上的分支處切下，轉(zhuǎn)移到BM液中。將擴(kuò)大后的農(nóng)桿菌菌液從三角瓶轉(zhuǎn)移至50mL離心管，6000rpm/min離心10min，去上清后于離心管中加入25mL BM液，振蕩使農(nóng)桿菌重懸；再加入10μLβ-巰基乙醇和20μL乙酰丁香酮，搖勻后作為工作液倒入已滅菌的平皿中。將切好的子葉柄轉(zhuǎn)到該工作液中浸泡10min。浸泡后，將子葉柄轉(zhuǎn)移到已滅菌的吸水紙上。用鑷子翻動(dòng)子葉柄使子葉柄表面殘留工作液被吸水紙吸干。最后將子葉柄均勻鋪放在共培培養(yǎng)基(1升MS+1mg 6-芐氨基嘌呤+30g蔗糖+1.6g植物凝膠)上，22℃，暗共培養(yǎng)36h。共培完成后，將外植體轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基(1升MS+2mg 6-芐氨基嘌呤+20mg草銨膦+500mg頭孢霉素+30g蔗糖+1.6g植物凝膠)中。22℃，長(zhǎng)日照培養(yǎng)；每10-14d更換一次篩選培養(yǎng)基。

當(dāng)外植體分化出若干簇抗性不定芽后，將不定芽切開(kāi)分離后放入生根(1升1/2MS+20mg草銨膦+10g蔗糖+1.6g植物凝膠)篩選培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。分化苗長(zhǎng)出足夠的根系后，將其從生根培養(yǎng)基中取出，并用無(wú)菌水將根上殘留的培養(yǎng)基清洗干凈。然后將分化苗移入蛭石中，煉苗10天。煉苗之后轉(zhuǎn)入土壤中，共獲得草銨膦抗性苗8株?？剐悦缬糜谙乱徊絇CR轉(zhuǎn)基因檢測(cè)鑒定。

四)油菜抗性苗轉(zhuǎn)基因鑒定與YD-7基因表達(dá)檢測(cè)

用CTAB方法從轉(zhuǎn)pFGC5941-YD-7CDS質(zhì)粒的抗性苗葉組織中提取總DNA，以總DNA作為模板，35SF(SEQ ID No.5)和YD-7CDSR(SEQ ID No.4)為引物，進(jìn)行PCR檢測(cè)(擴(kuò)增片段為1925bp)，檢測(cè)結(jié)果顯示與質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增片段大小一致的有6株，說(shuō)明總共獲得了6株YD-7基因過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株(見(jiàn)圖6)。用Trizol(Invitrogen)法提取6株轉(zhuǎn)基因植株葉片中的總RNA，利用Thermo Scientific公司商業(yè)化的Revertaid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒合成cDNA(具體步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作)。以cDNA為模板，YD-7CDSF(SEQ ID No.3)和YD-7CDSR(SEQ ID No.4)為引物，用半定量RT-PCR方法擴(kuò)增目標(biāo)片段，以BnaACTIN2基因作為內(nèi)參。結(jié)果顯示6株轉(zhuǎn)基因植株皆有YD-7表達(dá)，但是表達(dá)程度不同，又高有底(見(jiàn)圖7)。選YD-7基因表達(dá)量最高的轉(zhuǎn)基因植株做抗菌核病鑒定。

二、轉(zhuǎn)基因油菜抗菌核病檢測(cè)

所用核盤(pán)菌的菌株為能侵染油菜的菌株SS-3(由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供)。取其飽滿、無(wú)裂無(wú)霉變的SS-3菌核顆粒，用75％乙醇浸泡5min，無(wú)菌水沖洗3-4次，滅菌后接種到帶PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中央，放置在培養(yǎng)箱中，25℃暗培養(yǎng)2-3天。接種用植株為生長(zhǎng)到有4片真葉的轉(zhuǎn)基因植株與易感病98C40受體植株。在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)大約3天，核盤(pán)菌菌絲已經(jīng)觸及平皿邊緣，用直徑為1厘米的打孔器沿著圓形培養(yǎng)皿邊緣采集菌塊；將菌塊上帶有菌絲的面覆蓋到油菜葉片上，使菌絲與葉片表面直接接觸；將接種了核盤(pán)菌菌絲的植株轉(zhuǎn)入28℃，濕度大于90％的光照培養(yǎng)箱中。放置5-7天后，觀察接種核盤(pán)菌菌絲的葉片上形成的菌斑大小。結(jié)果見(jiàn)圖8，顯示，轉(zhuǎn)基因植株接種葉片上的菌斑明顯小于易感菌核病品種98C40受體植株葉片上的病斑，說(shuō)明YD-7基因能顯著提高油菜抗菌核病的能力。

實(shí)施例4.擬南芥轉(zhuǎn)化及分子鑒定與轉(zhuǎn)基因油菜抗菌核病檢測(cè)

一)擬南芥植株的準(zhǔn)備

將在每一缽營(yíng)養(yǎng)缽的營(yíng)養(yǎng)土上點(diǎn)3-4顆擬南芥野生型Col-0的種子，用保鮮膜覆蓋點(diǎn)了種子的缽子，然后放入4℃培養(yǎng)箱，避光4℃低溫處理2-3天；低溫處理完之后，將帶擬南芥種子的營(yíng)養(yǎng)缽移至生長(zhǎng)室，3天后揭膜，生長(zhǎng)條件為溫度控制在22-25℃之間，光照為16h光照對(duì)8h黑暗。根據(jù)土壤的干濕程度適當(dāng)澆水。待擬南芥植株生長(zhǎng)進(jìn)入盛花期，植株就可以用來(lái)做轉(zhuǎn)化。

二)農(nóng)桿菌的準(zhǔn)備

幼苗生長(zhǎng)到1-2cm時(shí)，開(kāi)始準(zhǔn)備菌液。將分別帶有pFGC5941-YD-7CDS質(zhì)粒的農(nóng)桿菌GV3101菌株在含50mg/mL卡那霉素、50mg/mL鏈霉素和100mg/mL利福平的YEB固體培養(yǎng)基上劃線，28℃恒溫培養(yǎng)3d。挑取單菌落于10mL含50mg/mL卡那霉素、50mg/mL鏈霉素和100mg/mL利福平的YEB液體培養(yǎng)基中，28℃、200rpm擴(kuò)大培養(yǎng)16-18h。吸取1mL菌液加入到50mL含50mg/mL卡那霉素、50mg/mL鏈霉素和100mg/mL利福平的YEB液體培養(yǎng)基中，擴(kuò)大培養(yǎng)至菌液OD₆₀₀達(dá)到0.4-0.8。

三)擬南芥的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化與抗性苗篩選

將擴(kuò)大后的農(nóng)桿菌菌液從三角瓶轉(zhuǎn)移至50mL離心管，6000rpm/min離心10min，去上清后于離心管中加入100mL高滲液(5g蔗糖+20μL silwet-77+1μL6-BA定容至100mL，調(diào)節(jié)pH至5.7)，振蕩使農(nóng)桿菌重懸；再加入10μLβ-巰基乙醇和20μL乙酰丁香酮，搖勻后作為工作液倒入已滅菌的平皿中。將擬南芥的花序浸泡在帶有農(nóng)桿菌的高滲液中大約10s，之后從高滲液中拿出，用保鮮膜覆蓋花序保濕，然后將植株轉(zhuǎn)入22℃的暗室中放置24h。24h后揭膜，轉(zhuǎn)入22-25℃、長(zhǎng)日照條件(光照16h，黑暗8h)下繼續(xù)生長(zhǎng)，及時(shí)澆水，定期護(hù)理；待擬南芥果莢轉(zhuǎn)黃，收集成熟的種子。擬南芥種子裝在1.5mL離心管中，置于37℃干燥2-4天，之后常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

四)擬南芥抗性苗轉(zhuǎn)基因鑒定與YD-7基因表達(dá)檢測(cè)

用CTAB方法從轉(zhuǎn)pFGC5941-YD-7CDS質(zhì)粒的抗性苗葉組織中提取總DNA，以總DNA作為模板，35SF(SEQ ID No.5)和YD-7CDSR(SEQ ID No.4)為引物，進(jìn)行PCR檢測(cè)(擴(kuò)增片段為1900bp)，檢測(cè)結(jié)果顯示與質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增片段大小一致的有5株，說(shuō)明總共獲得了5株YD-7基因過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株(見(jiàn)圖9)。用Trizol(Invitrogen)法提取5株轉(zhuǎn)基因植株葉片中的總RNA，利用Thermo Scientific公司商業(yè)化的Revertaid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒合成cDNA(具體步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作)。以cDNA為模板，YD-7CDSF(SEQ ID No.3)和YD-7CDSR(SEQ ID No.4)為引物，用半定量RT-PCR方法擴(kuò)增目標(biāo)片段，以擬南芥ACTIN2基因作為內(nèi)參。結(jié)果顯示2株轉(zhuǎn)基因植株有YD-7高表達(dá)，3株為低表達(dá)(見(jiàn)圖10)。選YD-7基因高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株做抗菌核病鑒定。

二、轉(zhuǎn)基因擬南芥抗菌核病檢測(cè)

所用核盤(pán)菌的菌株為能侵染油菜的菌株SS-3(由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供)。取其飽滿、無(wú)裂無(wú)霉變的SS-3菌核顆粒，用75％乙醇浸泡5min，無(wú)菌水沖洗3-4次，滅菌后接種到帶PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中央，放置在培養(yǎng)箱中，25℃暗培養(yǎng)2-3天。接種用植株為生長(zhǎng)到有4片真葉的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株與受體擬南芥Col-0植株。在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)大約3天，核盤(pán)菌菌絲已經(jīng)觸及平皿邊緣，用直徑為1厘米的打孔器沿著圓形培養(yǎng)皿邊緣采集菌塊；將菌塊上帶有菌絲的面覆蓋到擬南芥葉片上，使菌絲與葉片表面直接接觸；將接種了核盤(pán)菌菌絲的植株轉(zhuǎn)入28℃，濕度大于90％的光照培養(yǎng)箱中。放置5-7天后，觀察接種核盤(pán)菌菌絲的葉片上形成的菌斑大小。結(jié)果見(jiàn)圖11，顯示，轉(zhuǎn)基因擬南芥植株接種葉片上的菌斑明顯小于受體植株葉片上的病斑，說(shuō)明YD-7基因能顯著提高擬南芥抗菌核病的能力。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120> 核盤(pán)菌異核體不親和YD-7蛋白及其編碼基因與應(yīng)用

<130> 15

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 302

<212> PRT

<213> 核盤(pán)菌（Sclerotinia sclerotiorum）

<400> 1

Met Leu Leu Lys Pro Leu Ala Leu Phe Ser Ser Leu Ala Leu Ala Thr

1 5 10 15

Ala Ile Pro Asn Pro Leu Glu Lys Arg Ala Pro Tyr Gln Ala Arg Ile

20 25 30

Leu Asp Thr Gly Thr Thr Phe Val Glu Glu His Asn Gly Trp Trp Gln

35 40 45

Leu Ile Asp Ala Thr Gly Asp Gly Arg Pro Asp Leu Ala Tyr Ile Lys

50 55 60

Asn Lys Asn Thr Gly Thr Gly Tyr Val Glu Val His Ile Ala Ser Ser

65 70 75 80

Ser Ser Asn Phe Gln Thr Arg Ile Leu Glu Val Gly Thr Thr Phe Ala

85 90 95

Gln Glu Asp Asn Gly Thr Trp Arg Leu Phe Lys Ser Ser Asn Ser Val

100 105 110

Leu Pro Asp Leu Val Tyr Ile Lys Thr Gln Asn Thr Pro Ser Gly Lys

115 120 125

Val Glu Val His Ile Ala Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Lys Thr Arg Thr

130 135 140

Val Glu Val Val Thr Ser Phe Gly Asn Glu Gln Asp Gly Gln Trp Asn

145 150 155 160

Val Tyr Asp Tyr Asp Gly Asp Gly Lys Pro Asp Leu Val Phe Ile Lys

165 170 175

Thr Ser Asn Thr Gly Thr Gly Thr Thr Glu Leu Phe Val Ala Ser Ala

180 185 190

Ser Ser Asn Tyr Gln Thr Arg Leu Ile Ser Thr Gly Thr Thr Phe Thr

195 200 205

Val Glu Asn Asn Gly Phe Trp Gln Leu Gly Pro Tyr Ser Ala Asn Gly

210 215 220

Asp Leu Ile Tyr Ile Lys Asp Ala Asn Thr Gly Thr Gly Thr Thr Glu

225 230 235 240

Val His Ile Ala Ser Arg Ala Ser Gly Tyr Lys Thr Arg Leu Leu Asp

245 250 255

Val Gly Ser Thr Phe Thr Gln Glu Gln Asn Gly Val Trp Gln Leu Ile

260 265 270

Asp Phe Asn Ala Asn Gly Lys Leu Asp Leu Thr Tyr Ile Lys Tyr Gln

275 280 285

Asn Thr Gly Thr Gly Thr Val Glu Val His Val Ala Ser Gly

290 295 300

<210> 2

<211> 909

<212> DNA

<213> 核盤(pán)菌（Sclerotinia sclerotiorum）

<400> 2

atgctgctca aaccacttgc acttttttca tcacttgctc tggccaccgc catcccaaac 60

ccccttgaga aacgtgctcc atatcaggca agaatcttgg atactggaac tacctttgta 120

gaagagcata atggatggtg gcaattgatt gacgccactg gtgatggcag accagactta 180

gcctatatca agaataagaa cacagggact ggatatgtcg aagttcatat tgcctcttca 240

tcttccaatt tccagactcg aattcttgaa gtcggcacca catttgctca ggaagataac 300

ggaacatggc gtctattcaa atcatccaac tctgttcttc ctgacttggt atacatcaag 360

acacaaaata ccccgtcagg aaaagtagag gttcacatcg ctagcggagc atcaacctac 420

aagacacgga ctgttgaagt tgttacctca ttcgggaatg agcaagatgg tcaatggaac 480

gtgtatgact atgatggtga tggaaagcca gacttagtct tcatcaaaac tagcaatacc 540

ggtacaggaa caaccgaatt gttcgtcgca tctgcttctt ccaattatca aacaagactc 600

atcagcaccg ggactacctt tacggtagaa aacaacggtt tttggcagct tggaccttat 660

agcgctaatg gagatttgat ctacatcaag gatgccaata ctggcactgg gacaacagag 720

gtccacattg catctagagc atcgggttac aagactagat tgctggatgt tggttctact 780

ttcactcagg aacaaaatgg agtttggcaa ttgattgact ttaatgctaa tggcaagctc 840

gaccttactt atatcaagta tcagaacact gggacgggta ccgtcgaagt acatgttgct 900

agtggttga 909

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 合成

<400> 3

tctagaatgc tgctcaaacc actt 24

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 合成

<400> 4

ccatggtcaa ccactagcaa catgtac 27

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成

<400> 5

ctatccttcg caagaccctt c 21