本發(fā)明涉及一種SNP位點(diǎn)及基于其開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記及其應(yīng)用，特別涉及一種與玉米抗絲黑穗病次主效抗病位點(diǎn)連鎖的SNP位點(diǎn)，基于該位點(diǎn)的分子標(biāo)記及其在玉米抗絲黑穗病分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

玉米絲黑穗病是一種世界性的病害，近年來(lái)玉米種植面積逐年遞增，連作現(xiàn)象嚴(yán)重，絲黑穗病的發(fā)生也逐年加劇。一般年份該病的發(fā)病率在5％～10％，個(gè)別地塊達(dá)60％以上，感病株率每增加1個(gè)百分點(diǎn)，玉米減產(chǎn)100kg/hm²，嚴(yán)重影響玉米產(chǎn)量的提高。采用化學(xué)藥物防治無(wú)法從根本上解決問(wèn)題，選育抗病品種是現(xiàn)階段育種工作者的主要目標(biāo)。用傳統(tǒng)育種的方法篩選抗病種質(zhì)和選育抗病品種耗時(shí)耗力、效率差。應(yīng)用分子標(biāo)記的分子標(biāo)記輔助選擇(marker-assisted selection，MAS)技術(shù)不僅增加了選擇的準(zhǔn)確性，而且大大縮短了育種年限。

研究表明，植物的抗病性大多表現(xiàn)為由多基因控制數(shù)量抗病性，還沒(méi)有數(shù)量性狀被完整的定位出來(lái)。不同的數(shù)量性狀之間還存在連鎖遺傳現(xiàn)象，因此，分子標(biāo)記輔助選擇還不能被全面有效的應(yīng)用于針對(duì)數(shù)量性狀的育種中。為了解決這一問(wèn)題，研究者們提出主效QTL(quantitative trait locus)這一概念，主效QTL通常均有較高的變異系數(shù)，這樣將與主效QTL緊密連鎖的標(biāo)記應(yīng)用于輔助選擇可以大大提高育種進(jìn)程。

然而數(shù)量性狀除了受到主效QTL的調(diào)控外，次主效位點(diǎn)以及微效的QTL的作用也是十分重要的。包勁松等(2000年)對(duì)稻米直鏈淀粉含量進(jìn)行研究結(jié)果表明，稻米直鏈淀粉含量為數(shù)量性狀，除了受到1-2個(gè)主效QTL(qAc-6和qAC-3)控制外，還受到一些微效QTL(qAC-5,qAC-6a,qAC-6b等)的影響。2012年欒俊文采用遺傳分析和QTL定位分析相結(jié)合的方式對(duì)雄穗發(fā)育狀況進(jìn)行分析，說(shuō)明該性狀數(shù)量性狀，由主效基因和微效基因共同控制。2007年，Jines等在10號(hào)染色體短臂上定位到一個(gè)抗南方銹病的主效QTL，另外在4、8、9號(hào)染色體上定位到了微效QTL。徐凌等通過(guò)對(duì)前人研究進(jìn)行總結(jié)可知，控制SCMV的主效抗病QTL位于第6號(hào)染色體上，因此bin6.00/6.01為SCMV的主效區(qū)；而位于bin3.04/05區(qū)段的Scmv2是一個(gè)微效位點(diǎn)，對(duì)SCMN同樣具有重要作用。2001年Lehmensiek在第1染色體上發(fā)現(xiàn)灰斑病主效QTL，在第3、5染色體上定位出2個(gè)微效QTL。

其他禾谷類(lèi)作物不同，玉米是一個(gè)高度異花授粉作物，具有龐大且復(fù)雜的基因組，在繁育后代的過(guò)程中通過(guò)重組大量的差異基因被保留，故而在后代中產(chǎn)生豐富的多樣性變異。玉米的大多數(shù)性狀都是由多個(gè)QTL控制的數(shù)量性狀，因此，玉米育種家可以采用將多個(gè)微效QTL聚合在一起的方式，有效的利用遺傳資源的多樣性，進(jìn)而獲得穩(wěn)定抗性。同時(shí)由于玉米中缺少主效單一的抗病基因，玉米育種家只能通過(guò)利用病累加多個(gè)抗病QTL使抗性達(dá)到較高的水平。由此可見(jiàn)主效QTL的研究固然重要，與此同時(shí)次主效位點(diǎn)的研究同樣重要，將主次QTL結(jié)合起來(lái)才能使數(shù)量性狀的研究更加完善。

玉米絲黑穗病是由多基因控制的數(shù)量遺傳性狀，在10條染色體上都發(fā)現(xiàn)與絲黑穗病緊密連鎖的QTL，其中貢獻(xiàn)率較高的有bin1.04、bin2.09、bin3.04-3.05、bin8.02-8.03等，貢獻(xiàn)率分別為10.6％、15.37％和9.78％。bin2.09區(qū)域被大多數(shù)研究者公認(rèn)為該病的主效區(qū)域，該區(qū)域存在的主效QTL平均可解釋表型變異達(dá)35％左右。針對(duì)該主效抗病位點(diǎn)，2014年左為亮等克隆一個(gè)抗病基因ZmWAK(wall-assoeiated kinase)，通過(guò)驗(yàn)證可知，ZmWAK基因可能在玉米對(duì)絲黑穗病的抗病途徑中起重要作用。此外，針對(duì)該主效抗病位點(diǎn)研究者已經(jīng)開(kāi)發(fā)了一系列不同類(lèi)型與之緊密連鎖的分子標(biāo)記，包括SSR、SCAR、dCAPs、STS等。除了在主效區(qū)開(kāi)發(fā)標(biāo)記外，高樹(shù)仁(2005年)和石紅良等(2009年)還在次主效區(qū)域開(kāi)發(fā)出一些標(biāo)記，如bin3.04區(qū)域的標(biāo)記scar-111、bin1.09區(qū)的標(biāo)記ASP和bin3.08區(qū)域的標(biāo)記S100等，這也說(shuō)明次主效區(qū)研究的重要性。本研究室前期針對(duì)bin2.09區(qū)域開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記進(jìn)行選擇效率的比較研究結(jié)果表明，15個(gè)分子標(biāo)記中標(biāo)記MZA6393和LSdCAP2的選擇效率較高，分別為84.4％和78.5％。因此，有必要開(kāi)發(fā)其他次主效抗病位點(diǎn)的標(biāo)記用于標(biāo)記輔助育種。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種與玉米抗絲黑穗病次主效位點(diǎn)連鎖的SNP位點(diǎn)，基于該位點(diǎn)開(kāi)發(fā)的dCAPS分子標(biāo)記及其在玉米抗絲黑穗病分子標(biāo)記輔助育種中的用途。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)手段：

本發(fā)明的一種與玉米抗絲黑穗病次主效位點(diǎn)連鎖的SNP位點(diǎn)，所述的SNP位點(diǎn)位于玉米基因組bin8.03區(qū)域的抗病候選基因GRMZM2G047152的開(kāi)放閱讀框中的第3169位，當(dāng)該位點(diǎn)為G時(shí)，表現(xiàn)為抗病，當(dāng)該位點(diǎn)為A時(shí)表現(xiàn)為感病。

其中，所述的GRMZM2G047152的開(kāi)放閱讀框的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了一種基于所述的SNP位點(diǎn)開(kāi)發(fā)dCAPS分子標(biāo)記的方法，其特征在于以含有與玉米抗絲黑穗病次主效位點(diǎn)連鎖的SNP位點(diǎn)的序列為基礎(chǔ)序列，設(shè)計(jì)dCAPS引物對(duì)，以玉米總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使SNP位點(diǎn)有效的轉(zhuǎn)化為dCAPS標(biāo)記；其中所述的含有與玉米抗絲黑穗病次主效位點(diǎn)連鎖的SNP位點(diǎn)的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。

其中，優(yōu)選的，所述的dCAPS引物對(duì)的序列如下所示：

上游引物：5’AGCTCAACGCAATTCATTGTGC 3’(SEQ ID NO.3所示)

下游引物：5’CGCTCACTGCCAAGTTTTGC 3’(SEQ ID NO.4所示)

按照所述的方法得到的與玉米抗絲黑穗病次主效位點(diǎn)連鎖的dCAPS分子標(biāo)記，命名為DNdCAPS8.03-1，該分子標(biāo)記的內(nèi)切酶為BsiHKAI，酶切位點(diǎn)為GWGCWC。

獲得所述的與玉米抗絲黑穗病次主效位點(diǎn)連鎖的dCAPS分子標(biāo)記的引物對(duì)也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。優(yōu)選的，所述的引物對(duì)的序列如下所示：

上游引物：5’AGCTCAACGCAATTCATTGTGC 3’(SEQ ID NO.3所示)

下游引物：5’CGCTCACTGCCAAGTTTTGC 3’(SEQ ID NO.4所示)

再進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了所述的與玉米抗絲黑穗病次主效位點(diǎn)連鎖的SNP位點(diǎn)、所述的與玉米抗絲黑穗病次主效位點(diǎn)連鎖的dCAPS分子標(biāo)記以及所述的引物對(duì)在玉米抗絲黑穗病分子標(biāo)記輔助育種中的用途，優(yōu)選的，將所述的與玉米抗絲黑穗病次主效位點(diǎn)連鎖的SNP位點(diǎn)、所述的與玉米抗絲黑穗病次主效位點(diǎn)連鎖的dCAPS分子標(biāo)記以及所述的引物對(duì)與位于bin2.09主效抗病位點(diǎn)區(qū)域的分子標(biāo)記MZA6393和LSdCAP2聯(lián)合使用，以提高選擇效率。

相較于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明提出了一種與玉米抗絲黑穗病次主效位點(diǎn)連鎖的SNP位點(diǎn)以及基于該位點(diǎn)開(kāi)發(fā)的dCAPS分子標(biāo)記，命名為DNdCAPS8.03-1。實(shí)踐證明，將DNdCAPS8.03-1與位于bin2.09主效抗病位點(diǎn)區(qū)域的分子標(biāo)記MZA6393和LSdCAP2聯(lián)合使用，選擇效率大大高于單標(biāo)記。因此，本發(fā)明提出的分子標(biāo)記可用于玉米抗絲黑穗病分子標(biāo)記輔助育種，加速玉米抗絲黑穗病種質(zhì)資源的篩選抗病品種選育進(jìn)程。

附圖說(shuō)明

圖1為Fgenesh預(yù)測(cè)基因結(jié)果；

注：TSS.轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)；CDSo.單外顯子；PolA:末端polyA區(qū)；

圖2A-D為開(kāi)放閱讀框分析；

注：方框代表起始密碼子；*代表終止密碼子；

圖3為玉米基因GRMZM2G047152編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域；

圖4為標(biāo)記DNdCAPS8.03-1在不同抗感材料間的PCR擴(kuò)增結(jié)果；

M:DNA Marker D2000；1-4：B73；5-8：Mo17；9-12：齊319；13-17：黃早四；18：水對(duì)照；

圖5為擴(kuò)增片段克隆載體的菌液PCR檢測(cè)結(jié)果；

M:DNA Marker D2000；1-4：B73；5-8：Mo17；9-12：齊319；13-16：黃早四；

圖6為標(biāo)記DNdCAPS8.03-1酶切檢測(cè)結(jié)果。

M:DNA Marker pBR322DNA/MspI；1-4：B73；Mo17；齊319；黃早四。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，應(yīng)該理解的是，這些實(shí)施例僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1玉米抗絲黑穗病次主效位點(diǎn)連鎖的SNP位點(diǎn)、基于該位點(diǎn)的分子標(biāo)記DNdCAPS8.03-1的建立

一、位于玉米次主效抗病區(qū)域bin8.03候選基因GRMZM2G047152的生物信息學(xué)分析

1材料與方法

本試驗(yàn)研究對(duì)象為位于bin8.03區(qū)域的候選基因GRMZM2G047152，該基因?yàn)楹蠳BS結(jié)構(gòu)的抗病基因。

在MaizeGDB和Phytozome11網(wǎng)站上對(duì)基因GRMZM2G047152進(jìn)行檢索，利用在線(xiàn)預(yù)測(cè)基因軟件Fgenesh對(duì)該段核苷酸序列進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析。

利用NCBI中的ORF Finder和CD-search搜索對(duì)候選基因GRMZM2G047152的氨基酸序列進(jìn)行預(yù)測(cè)并分析其保守結(jié)構(gòu)域。

登陸NCBI網(wǎng)站利該網(wǎng)站上BLAST工具，對(duì)候選序列的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)。從而尋找到與其相似性高的氨基酸序列，然后使用DNAMAN4.0軟件進(jìn)行同源性分析，進(jìn)而利用MEGA6軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，以分析候選序列與抗病基因的進(jìn)化關(guān)系。

2結(jié)果與分析

2.1基因GRMZM2G047152的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

由MaizeGDB和Phytozome11網(wǎng)站上對(duì)基因GRMZM2G047152進(jìn)行檢索均得到3620bp的一段序列。在Phytozome11網(wǎng)站中，對(duì)該基因的genomic sequence進(jìn)行分析，該段序列僅含有一個(gè)連續(xù)的CDS。故而以B73RefGen_v3為模板，在該基因兩側(cè)各截取5000bp序列，利用在線(xiàn)預(yù)測(cè)基因軟件Fgenesh對(duì)該段核苷酸序列進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析(圖1)，分別在編碼區(qū)的前端和后端找到一個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和一個(gè)PolyA尾巴。

2.2基因GRMZM2G047152編碼蛋白質(zhì)氨基酸序列及保守結(jié)構(gòu)域分析

在線(xiàn)使用ORF Finder確定玉米抗絲黑穗病候選基因GRMZM2G047152的開(kāi)放閱讀框，結(jié)果表明，基因包括一個(gè)完整的ORF，大小為3336bp(SEQ ID NO.1所示，圖2A-D)。利用NCBI中的CD-search搜索玉米抗病候選基因GRMZM2G047152編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。結(jié)果如圖3，蛋白具有NB-ARC、LRR等一系列保守結(jié)構(gòu)域，且所包含的NB-ARC、LRR這些保守結(jié)構(gòu)域絕大多數(shù)存在于植物R蛋白中，其結(jié)構(gòu)高度保守，可能參與植物抗病信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和抗病作用的發(fā)揮。

二、抗病候選基因的克隆及差異SNP位點(diǎn)的挖掘

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

自交系材料：測(cè)序材料B73(Reid)

抗病材料Mo17(Lancaster)、齊319(PB)，發(fā)病率分別為：1.64％、3.63％

感病材料黃早四(SPT)發(fā)病率為：76.81％

1.2葉片總DNA提取

本試驗(yàn)采用CTAB法提取玉米自交系Mol7、齊319、黃早四以及B73的DNA。將提取的DNA去除RNA后，用瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度和純度于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3目的基因片段的序列獲取

1.3.1 PCR擴(kuò)增

用Primer Premier5對(duì)候選基因部分序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)(如表1)。查詢(xún)可知，GRMZM2G047152基因CDS區(qū)共3336bp，編碼1111個(gè)氨基酸，設(shè)計(jì)引物時(shí)將其分成兩段，分別擴(kuò)增，且兩段序列間存在重疊部分以保證序列的完整性。篩選合適的體系(表2)及反應(yīng)條件(表3)進(jìn)行PCR反應(yīng)。

表1 擴(kuò)增GRMZM2G047152基因的引物序列

表2 GRMZM2G047152基因的PCR反應(yīng)體系

表3 GRMZM2G047152基因的PCR反應(yīng)程序

取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物6ul進(jìn)行1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.3.2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠回收與純化

對(duì)于瓊脂糖凝膠電泳分離的DNA產(chǎn)物，利用OMEGA的DNA膠回收試劑盒進(jìn)行回收和純化。

1.3.3 PCR純化產(chǎn)物的連接、轉(zhuǎn)化與鑒定

選用北京全式金生物技術(shù)有限公司pEASY-T1載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化，挑選白斑進(jìn)行PCR鑒定，對(duì)白斑進(jìn)行菌液培養(yǎng)后測(cè)序，三次重復(fù)。PCR產(chǎn)物的連接轉(zhuǎn)化步驟如下：

(1)克隆反應(yīng)體系的建立

(2)轉(zhuǎn)化

(3)陽(yáng)性重組子的鑒定和測(cè)序

利用原引物對(duì)菌液直接進(jìn)行PCR，對(duì)鑒定出的陽(yáng)性克隆，取0.5ml菌液加入0.5ml無(wú)菌30％甘油至終濃度為15％，-80℃保存菌液，并將菌液送出測(cè)序

1.4 SNP差異位點(diǎn)挖掘

利DNAMAN軟件將4份試驗(yàn)材料的測(cè)序結(jié)果分別與抗病候選序列進(jìn)行比對(duì)分析，從而明確所選用的材料是否含有候選序列；并且將4個(gè)抗、感材料間的序列進(jìn)行比對(duì)，以便找到抗感材料之間的差異位點(diǎn)。

2結(jié)果與分析

2.1目的基因片段的獲取

本研究利用全式金的DNA膠回收試劑盒對(duì)B73、Mol7、齊319和感病品種黃早四這4份試驗(yàn)材料擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收和純化。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，沒(méi)有雜帶，效果好，可以用于連接轉(zhuǎn)化，進(jìn)一步確定是否為目的基因的擴(kuò)增片段。釆用北京全式金生物技術(shù)有限公司的pEASY-T1載體對(duì)純化后的產(chǎn)物進(jìn)行連接，然后轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，最后在含有Amp、IPTG和X-Gay的固體LB平板上篩選重組體。在含有藍(lán)白斑的LB平板中挑選白色單菌落接種于LB/Amp的液體培養(yǎng)基中，200rpm，培養(yǎng)16小時(shí)左右，將菌液作為PCR的模板進(jìn)行PCR鑒定，PCR產(chǎn)物大小與目的片段大小一致，且無(wú)雜帶，初步斷定為重組子，將菌液送至公司測(cè)序，每個(gè)樣品三次重復(fù)。

2.2 SNP差異位點(diǎn)挖掘

對(duì)目的序列的測(cè)序選擇吉林庫(kù)美生物科技有限公司和上海生工生物工程股份有限公司共同完成，每個(gè)公司均進(jìn)行兩次測(cè)通型式的重復(fù)測(cè)序。以B73為參考序列。

通過(guò)對(duì)抗感材料中擴(kuò)增出的序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)在抗感材料間存在6個(gè)SNP位點(diǎn)，其中位點(diǎn)2的突變會(huì)引起氨基酸的變化(如表4)，位于富亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)中，故而主要針對(duì)SNP2開(kāi)發(fā)dCAPs標(biāo)記。

表4 抗感材料差異SNP信息

三、基于抗病候選基因SNP位點(diǎn)的dCAPs標(biāo)記的開(kāi)發(fā)

1材料與方法

本試驗(yàn)以獲得的SNP2序列信息(SEQ ID NO.2)為研究對(duì)象，利用在線(xiàn)網(wǎng)站dCAPs Finder獲得一條引物、最佳酶切位點(diǎn)以及相應(yīng)的限制性?xún)?nèi)切酶。再利用primer5.0軟件在序列的另一端距離已知引物90-140bp處設(shè)計(jì)另一條引物；要求上、下游引物的退火溫度(Tm)相近，且約為60℃。引物由北京生工生物科技有限公司合成。需要經(jīng)過(guò)一系列PCR驗(yàn)證和酶切反應(yīng)摸索，確定最佳PCR和酶切反應(yīng)體系和程序。

以B73、Mo17、齊319和黃早四為材料，對(duì)這四個(gè)品種進(jìn)行DNA提取和PCR鑒定，之后通過(guò)酶切反應(yīng)和聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，確定SNP是否能被有效的區(qū)分。

1.1 dCAPs引物PCR擴(kuò)增

按照dCAPs標(biāo)記開(kāi)發(fā)要求設(shè)計(jì)引物，篩選合適的反應(yīng)體系為ddH₂O 13.3μL，10×Taq Buffer和dNTP(2.5mM/mL)各4μL，Primer和酶為0.4μL，DNA為2.5μL，且PCR反應(yīng)程序如表5。

表5 dCAPS引物的PCR反應(yīng)程序

1.2 dCAPs標(biāo)記PCR產(chǎn)物限制性酶切反應(yīng)

篩選合適的酶切反應(yīng)體系為ddH₂O 6.1μL，10×NEBuffer1μL，限制性?xún)?nèi)切酶為0.4μL，PCR產(chǎn)物為2.5μL，按照內(nèi)切酶的要求確定酶切溫度，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切。

1.3聚丙稀酰胺凝膠電泳及銀染

dCAPs標(biāo)記的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶酶切后，用8％的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，8％的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)方法如下：

(1)清洗制備凝膠的小玻璃板，晾干，組裝好兩塊玻璃板，備用。

(2)配制10×TBE緩沖液。

(3)配制8％的聚丙烯酰胺凝膠：先將380gAcrylamide(聚丙烯酰胺)和20g Bisacrylamide(雙叉聚丙烯酰胺)用蒸餾水稀釋至1000ml，過(guò)濾，配制成40％的Acrylamide，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩＞郾０纺z一般現(xiàn)用現(xiàn)制，TEMED和20％的APS在灌膠前加入。

(4)灌膠：灌膠時(shí)防止出現(xiàn)氣泡，待灌好膠后插入梳子，等待凝膠約20min。

(5)安裝電泳槽：一個(gè)電泳槽安裝兩塊膠板，注入1×TBE緩沖液(將配置好的10×TBE緩沖液稀釋10倍)，拔梳子，將點(diǎn)樣孔內(nèi)的碎膠吹掉，備用點(diǎn)樣。

(6)電泳：每個(gè)點(diǎn)樣孔點(diǎn)樣1.5μl，每個(gè)電泳槽恒功率30W，電泳50min左右結(jié)束電泳。小心分開(kāi)兩個(gè)玻璃板，并取下電泳的膠片進(jìn)行銀染。

(7)銀染程序

(8)拍照：將膠片放在燈箱上面讀帶，并用相機(jī)拍照記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，膠片放在指定的地方以便處理。

1.4分子標(biāo)記的單克隆及鑒定方法

對(duì)新開(kāi)發(fā)的dCAPs標(biāo)記進(jìn)行單克隆鑒定，并送出測(cè)序。再利用DNAMAN軟件對(duì)測(cè)序獲得的結(jié)果與目的片段序列進(jìn)行比對(duì)分析，驗(yàn)證PCR產(chǎn)物。

2結(jié)果與分析

2.1基于SNP位點(diǎn)的dCAPs標(biāo)記開(kāi)發(fā)

6個(gè)SNP位點(diǎn)中只有SNP2、3和4能使氨基酸發(fā)生突變，因此本發(fā)明以SNP2為對(duì)象開(kāi)發(fā)dCAPs標(biāo)記。由于引物是根據(jù)參考序列的反向互補(bǔ)鏈設(shè)計(jì)的，故SNP2由G/A變?yōu)镃/T突變。利用在線(xiàn)網(wǎng)站dCAPs Finder分析最佳酶切位點(diǎn)和選擇限制性?xún)?nèi)切酶。然后使用DNAMAN軟件對(duì)已獲得的克隆的候選序列及SNP序列進(jìn)行比對(duì)，找出突變SNP位點(diǎn)兩側(cè)附近延伸堿基序列，總長(zhǎng)度約500bp。再利用primer5.0軟件，固定SNP位點(diǎn)一端(帶改變堿基的酶切位點(diǎn))的引物，使突變位點(diǎn)為PCR擴(kuò)增延伸的第一個(gè)堿基，而后用該軟件需找另一端合適的引物。要求：退火溫度(Tm)值約60℃將上、下游引物TM值調(diào)至相近，產(chǎn)物大小為90-140bp左右。將設(shè)計(jì)的引物下載，并在其中固定的一條引物鏈中，根據(jù)所選擇的限制性?xún)?nèi)切酶，變化相應(yīng)的1-2個(gè)堿基，復(fù)查后合成引物。引物由北京生工生物科技有限公司合成。對(duì)于己設(shè)計(jì)合成的引物，要經(jīng)過(guò)一系列PCR驗(yàn)證和酶切摸索分析。開(kāi)發(fā)的標(biāo)記命名為DNdCAPS8.03-1，信息見(jiàn)表6。

表6 dCAPs標(biāo)記引物及相應(yīng)的內(nèi)切酶

2.2分子標(biāo)記的單克隆及鑒定

以dCAPs標(biāo)記的PCR產(chǎn)物為材料，利用瓊脂糖凝檢測(cè)，結(jié)果表明可以擴(kuò)增出單一、清晰大小與目標(biāo)片段一致的條帶(圖4)，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收目的片斷，再通過(guò)連接、轉(zhuǎn)化和搖菌步驟，獲得每個(gè)標(biāo)記的單克隆，利用原引物對(duì)菌液直接進(jìn)行PCR(圖5)，鑒定片斷后，將菌液送出測(cè)序，以B73為例測(cè)序結(jié)果如SEQ ID NO.5所示。再利用DNAMAN軟件對(duì)測(cè)序獲得的結(jié)果與目的片段序列進(jìn)行比對(duì)分析。比對(duì)結(jié)果表明擴(kuò)增出的片段與目標(biāo)片段一致，且抗感之間的SNP仍然存在，說(shuō)明該SNP位點(diǎn)可以有效的轉(zhuǎn)化成dCAPs標(biāo)記。用限制性?xún)?nèi)切酶切割PCR產(chǎn)物，抗感材料間差異較大，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為137bp，酶切后產(chǎn)物為114bp，能明顯區(qū)分，故而轉(zhuǎn)化的dCAPs標(biāo)記在開(kāi)發(fā)材料B73、Mo17、齊319和黃早四間有效(圖6)。

四、抗絲黑穗病次主效位點(diǎn)dCAPS標(biāo)記驗(yàn)證

1試驗(yàn)材料

75份常用玉米自交系：在2003年和2004年?yáng)|北農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米研究所對(duì)這75份自交系進(jìn)行了田間人工菌土接種鑒定，各材料的發(fā)病率，結(jié)果見(jiàn)表7。以上植物材料均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米研究所提供。

表7 75份自交系材料田間接種中后的絲黑穗抗性評(píng)價(jià)及其血緣系譜表

注：常用自交系血緣劃分按照目前我國(guó)玉米種質(zhì)主要分為6個(gè)類(lèi)群，即四平頭(SPT)、旅大紅骨(LRC)、蘭卡斯特(Lan)、瑞德(Reid)、PA和PB。

2試驗(yàn)方法

2.1新開(kāi)發(fā)標(biāo)記DNdCAPS8.03-1基因型分析方法

提取試驗(yàn)材料葉片的總DNA，具體PCR和酶切方法見(jiàn)前文。

8％的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)。

2.2主效抗病位點(diǎn)bin2.09區(qū)域已開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記的基因型分析方法

前期試驗(yàn)表明，位于主效抗病位點(diǎn)bin2.09的標(biāo)記MZA6393和LSdCAP2的選擇效率較高。上述兩個(gè)標(biāo)記的引物信息見(jiàn)表8。

表8 2個(gè)與玉米bin2.09主效抗病位點(diǎn)連鎖分子標(biāo)記的引物信息

(1)STS標(biāo)記基因型分析方法

1)STS標(biāo)記引物PCR反應(yīng)(表9、10)

2)利用3％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

表9 STS引物PCR的反應(yīng)體系

表10 STS引物的PCR反應(yīng)程序

(2)dCAPs標(biāo)記基因型分析方法

與標(biāo)記DNdCAPs8.03-1對(duì)75份常用自交系的基因型分析方法相同。

2.3分子標(biāo)記及標(biāo)記組合在自交系中分子檢測(cè)符合率分析

本試驗(yàn)利用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，具體公式如下：

(1)主效抗病區(qū)單一標(biāo)記分子檢測(cè)符合率

標(biāo)記對(duì)抗病材料的分子檢測(cè)符合率＝基因型為R株數(shù)/表型為抗病株數(shù)×100％；

標(biāo)記對(duì)感病材料的分子檢測(cè)符合率＝基因型為S株數(shù)/表型為感病株數(shù)×100％；

標(biāo)記平均分子檢測(cè)符合率＝(標(biāo)記對(duì)抗病材料的分子檢測(cè)符合率+標(biāo)記對(duì)感病材料的分子檢測(cè)符合率)/2

(2)標(biāo)記組合分子檢測(cè)符合率

標(biāo)記組合對(duì)抗病材料的分子檢測(cè)符合率＝各標(biāo)記共檢測(cè)出基因型為R株數(shù)/表型為抗病株數(shù)×100％；

標(biāo)記組合對(duì)感病材料的分子檢測(cè)符合率＝各標(biāo)記共檢測(cè)出基因型為S株數(shù)/表型為感病株數(shù)×100％；

標(biāo)記組合平均分子檢測(cè)符合率＝(標(biāo)記組合對(duì)抗病材料的分子檢測(cè)符合率+標(biāo)記組合對(duì)感病材料的分子檢測(cè)符合率)/2

3結(jié)果與分析

3.1單個(gè)分子標(biāo)記在自交系中分子檢測(cè)符合率分析

75份絲黑穗病發(fā)病率已知的自交系材料中，根據(jù)王曉鳴(2002)提出的抗性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，將高抗HR、抗R以及中抗MR定為抗病，將感病S和高感HS界定為感病。根據(jù)表11可知，75份自交系材料中共有抗病材料32份，感病材料43份。在32份抗病材料中，標(biāo)記MZA6393共檢測(cè)出基因型為R的有26份，分子檢測(cè)符合率為81.25％；在43份感病材料中檢測(cè)出基因型為S的有35份，分子檢測(cè)符合率為81.4％，平均分子檢測(cè)符合率為81.33％?？芍獦?biāo)記MZA6393在抗病材料中的分子檢測(cè)符合率高于在感病材料中。在32份抗病材料中，標(biāo)記LSdCAP2檢測(cè)基因型為R的有26份，分子檢測(cè)符合率為81.25％；在感病材料中分子檢測(cè)符合率為53.49％，平均分子檢測(cè)符合率為67.37％，可知標(biāo)記LSdCAP2在抗病材料中的符合率也高于在感病材料中的符合率。由于bin2.09區(qū)域?yàn)橛衩卓菇z黑穗病的主效區(qū)域，故而針對(duì)這一區(qū)域開(kāi)發(fā)出的標(biāo)記的效率明顯高于次主效區(qū)開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記，因此，次主效區(qū)新開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記應(yīng)結(jié)合主效區(qū)標(biāo)記進(jìn)行分析，從而確定次主效區(qū)開(kāi)發(fā)出標(biāo)記的意義。

表11 標(biāo)記自交系中的分子檢測(cè)符合率

3.2標(biāo)記組合在自交系中分子檢測(cè)符合率分析

將基于bin8.03次主效抗病區(qū)域開(kāi)發(fā)的標(biāo)記DNdCAPS8.03-1，與基于bin2.09主效抗病區(qū)域開(kāi)發(fā)的標(biāo)記MZA6393和LSdCAP2，配成標(biāo)記組合聯(lián)合分析，結(jié)果見(jiàn)表12。

在不同發(fā)病率的75份玉米自交系材料中，標(biāo)記組合DNdCAPS8.03-1+MZA6393、DNdCAPS8.03-1+LSdCAP2、MZA6393+LSdCAP2以及DNdCAPS8.03-1+MZA6393+LSdCAP2的分子檢測(cè)符合率均高于主效區(qū)的兩個(gè)單標(biāo)記的符合率。其中標(biāo)記組合DNdCAPS8.03-1+MZA6393的分子檢測(cè)符合率較單一標(biāo)記MZA6393高10.53％；標(biāo)記組合DNdCAPS8.03-1+LSdCAP2的分子檢測(cè)符合率較單一標(biāo)記LSdCAP2高12.87％；標(biāo)記組合DNdCAPS8.03-1+MZA6393+LSdCAP2的分子檢測(cè)符合率較單標(biāo)記MZA6393和LSdCAP2分別高11.70％和25.66％，較標(biāo)記組合MZA6393+LSdCAP2高8.98％，說(shuō)明在bin2.09區(qū)標(biāo)記組合中加入次主效區(qū)標(biāo)記DNdCAPS8.03-1，標(biāo)記組合的分子檢測(cè)符合率提高；在所有標(biāo)記及標(biāo)記組合中，三標(biāo)記組合DNdCAPS8.03-1+MZA6393+LSdCAP2的分子檢測(cè)符合率最高，為93.03％，說(shuō)明三標(biāo)記組合DNdCAPS8.03-1+MZA6393+LSdCAP2為最優(yōu)組合。

表12 標(biāo)記組合在自交系中的分子檢測(cè)符合率

以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明而言?xún)H是說(shuō)明性的，而非限制性的；本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解，在本發(fā)明權(quán)利要求所限定的精神和范圍內(nèi)可對(duì)其進(jìn)行許多改變，修改，甚至等效變更，但都將落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

序列表

<110> 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120> 一種與玉米抗絲黑穗病次主效位點(diǎn)連鎖的分子標(biāo)記DNdCAPS8.03-1及其應(yīng)用

<160> 4

<210> 1

<211> 3336bp

<212> DNA

<213> GRMZM2G047152 ORF

<400> 1

atggcggaga cgttggccgg ctggctggtg tgcccgatca tcaagatcgt gatggataag 60

gcaaaatctt gcgcttccga caggatcaag agcctgggcg acggcgtccc caaggcgctc 120

aagcggatgg agcacttgct gtatcagctc cgcgccgtgg gggccgccgt ccagcggcgg 180

ggctctccga acggatgcgg ggacccggac ttccgtgagt ggctacagca gctcatggat 240

gccgtgtacg aggccctaga cgtcgtcgat gacttcgacg actctatgcc gccgcctgaa 300

tcccccgtcg ccagggtcag caagcggatc ttcggcaccg acgagcgcgt caacaggctc 360

aacgatgtcg tcgacaagct ggaagccatc tccaaagcct cgccgacact gattctgacg 420

gcggaggcca acgcgtcggc gtcgcgcgaa cagagcggtc acctgccccc gctcggccgc 480

atcacggcct cgctgcgcca ccacaaggac gtggtggttg ggcgcgactg ggagctgcaa 540

aatatggtgt cctggctcgt cggcgcaggc ggcgacgccc aggttgtctc tgtccccatc 600

gcggcgatca taggacatgg cgggatgggg aagaccacgc tggcgcaggt cctgttagag 660

gacccgaatg tggtctccac ctttgaaatc aaaatctgga tccagccttt cccgacggac 720

aacgagcttg agcttgccaa gaagatcctc ctgggcgccg acgtgggcgt cgacgccttc 780

gacgggctga cgaatttcga cttgctactg aaaaagataa aggagaaagt ctcgttgcgc 840

aagttcctgc tggtgatcga cgacgtctgg aacaaggaga acatgggtca gcatgagtac 900

cgagagatgt ggtccaaggt gctggcgccc ctcagccacg gggaaagggg aagcaggatc 960

gtggtcacca cccgtcaaaa gatggtagcg aatttgctgt ccgcaagcat ggaggtccgg 1020

ttggatgact tgccggccaa tgacatctgg tctctgttca agaggtatgc cttcggtggc 1080

gaggacattg atggtcagcc ttgtgcactg caggacatcg gaaggaaaat tgcccaaaag 1140

ctcaaggggt ctccaatgct cgccaaggcc gttgggcaga tgcttgaagg caaccccagt 1200

gtctcccact ggaggaaggt gcttgagatg gacatcttcg acaatgtttc caagacatta 1260

gagttgtgct accagaattt accgggccac ctgcaaccat gcttcgcaat ctgcagctta 1320

ttccccaaga actggaggtt caagcgcgat aagctggtga agatttggat ggcccttggt 1380

ttcgtgcagg cagcggatgg gaaattggag gatctgggaa gtgactactt cgatcagctt 1440

gtggccaggt cctttttcca taggcagaag gtggggcgtc ggagttacta ttacatccac 1500

gaccttatgc atgatttggc caagaaggtt tctcggtttg attgtgtgag agttgaagat 1560

gcaaagaagg agatccccaa gacagttcgg cacctgtctg tctgcagtga taccgtggca 1620

cagctcaaga gccgacctga gcttaaaaga ttgcacacgt tgctgattct caagagccct 1680

tcctcttcgc tggatcaact gccaggagat cttttcacag agctgaaaag ccttcgagtt 1740

cttggtttgg aagactgcaa tatcattcgc ctaccggaga ggattgggaa ccttaagtac 1800

atcagatacc tggcactttg caaatcaatc accaagcttc cacaagcact gacaaggctc 1860

tatcgtcttc agaccttaag tagtcctaag gggtctggcc ttgaggtccc ggaagatatc 1920

gtaaacctga cgcgtctgag acatttggac atggatacat ccaaaatcac cggcattggg 1980

aaactggttc acctgcaggg atctgtcaag ttccatgtta aaaatgaaaa aggccatact 2040

ttaggagact tgaatggtat gaatggtctt cgtaaagagc ttcatatcaa gaatcttgat 2100

cttgtagcgg ataaacaaga agcctgccag gctgggctaa acaagaagga gaatgttaag 2160

gtcctggaat tagaatggaa ctcgactggt aagattgtgc cctctagtga ggctgatgtc 2220

ttggatggcc ttgaacccaa ccaatatgtt aaaaagctta ctgttagaag atatcatggt 2280

gatagatcac caaactggct taacacaagc ttgaaagtga gtgtcttcta cgttaaatac 2340

ctgcatttgg tcaactgcag aaaatgggag gtcctgcctc ctctggggca gcttccatgc 2400

ctcaaggctt tgcgtctgaa agagatgtgt gcagtgaaaa aaatcagctt ccgtgacttc 2460

tatggaacca aatcgactgc gtttccatct ttggaggaac ttgaattcga tgatatgcct 2520

caatgggttg agtggaccca agaagagaag aatatcgatg tgctacctaa actccgtagg 2580

ctgaagcttt tgaactgtcc caagctcgtt aggttgcccc agctccctct gtccgtgagg 2640

aaggtctcgg taaaaaatac aggatttgtt tcacagctga aactatcccc ctgctcttcc 2700

tcgccatcaa acgcgtgcaa gtttaaatta gatacgtgct ctgccaccat ccttacaaat 2760

ggcttaatgc accagcaaca taaggaatca attgctactt tggctctgag gaactgtcaa 2820

gatgcaaagt ttgaagagct tgagaagctg acttccctga agagtctgca aatatgccat 2880

tcaagcatta acgatggcca gctgggcact tgtttgaggg gatcgcgagt acttacctgt 2940

ctggaattgt ccaactgcaa caacatcaca tgccttccac agatggaagg ttcagactgc 3000

ttaacaaaaa tgcatgagtt acgcattcaa cagtgttctg aattctcctc tctgcgctca 3060

ctgccaagtt ttgcggctct agaaagtgta ttgattgaaa actgctcgaa gatcactgcg 3120

ggatcgttcc ctaccgactt cagcagcaac acctctctga gaaaactggg cataatgaat 3180

tgcgttgagc tggagtcgtt gccaagcggt ttcccatctt cactgcaagt tcttcatcta 3240

attgggtgca aagcaagttt gacgaagcaa ctacaactca aggatggacc agaatgggat 3300

aaagtagcta gtattcccat aaaacaaatc cgttga 3336

<210> 2

<211> 141bp

<212> DNA

<213> 玉米（Zea mays L.）

<220> m= G/A

<400> 2

gcggctctag aaagtgtatt gattgaaaac tgctcgaaga tcactgcggg atcgttccct 60

accgacttca gcagcaacac ctctctgaga aaactgmgca taatgaattg cgttgagctg 120

gagtcgttgc caagcggttt c 141

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agctcaacgc aattcattgt gc 22

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgctcactgc caagttttgc 20

<210> 5

<211> 137bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

agctcaacgc aattcattat gcccagtttt ctcagagagg tgttgctgct gaagtcggta 60

gggaacgatc ccgcagtgat cttcgagcag ttttcaatca atacactttc tagagccgca 120

aaacttggca gtgagcg 137