本發(fā)明涉及生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種發(fā)酵生產(chǎn)L-丙氨酸的方法。

背景技術(shù)：

L-丙氨酸，學(xué)名L-氨基丙酸(L-alanine；L-lactamine)，分子式CH₃CH(NH₂)COOH，分子量89.04，外觀為無色至白色結(jié)晶，無毒無臭，溶于水(16.72g/100mL)，微溶于乙醇，不溶于乙醚和丙酮，密度1.401，理化性質(zhì)穩(wěn)定。具有特殊的甜味，甜度為甘氨酸的1.6倍，是一種最甜的氨基酸。當溫度高于200℃時，可升華；達到264～295℃時可分解。

L-丙氨酸在食品、醫(yī)藥和化工領(lǐng)域均具有廣泛的應(yīng)用，并有日益增長的趨勢。它的技術(shù)開發(fā)較晚，80年代初才在日本工業(yè)化生產(chǎn)。我國在80年代末有小批量生產(chǎn)，由于應(yīng)用開發(fā)的滯后，產(chǎn)品內(nèi)銷不暢，工業(yè)化生產(chǎn)舉步維艱。L-丙氨酸制備經(jīng)歷了由蛋白水解提取法、酶法到發(fā)酵法的過程。提取法由于原料來源的限制和成本的居高不下，無法大規(guī)模生產(chǎn)；酶法轉(zhuǎn)化分為固定化細胞法和游離細胞法，生產(chǎn)工藝較為復(fù)雜；發(fā)酵法生產(chǎn)工藝簡單，發(fā)酵液中雜質(zhì)含量相對較少，有利于減少分離提取的成本和廢水的用量。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種發(fā)酵生產(chǎn)L-丙氨酸的方法，技術(shù)方案如下：

一種發(fā)酵生產(chǎn)L-丙氨酸的方法，在發(fā)酵過程中采用向發(fā)酵培養(yǎng)基流加補糖的方式進行L-丙氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)。

進一步地，流加補糖的糖液中含有葡萄糖、甘油及谷氨酸/谷氨酸鈉。

作為優(yōu)選，所述糖液中葡萄糖的質(zhì)量濃度為60～80％，甘油的質(zhì)量濃度為葡萄糖質(zhì)量濃度的0.5～1.5％，谷氨酸/谷氨酸鈉的濃度為5～10mM。

更為優(yōu)選，所述糖液中葡萄糖的質(zhì)量濃度65％，甘油的質(zhì)量濃度為葡萄糖質(zhì)量濃度的1％，谷氨酸/谷氨酸鈉的濃度為5～10mM。

進一步地，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的成分包括(質(zhì)量百分比)：葡萄糖6～8％，牛骨蛋白胨0.1％，Na₂HPO₄·H₂O 1％，KH₂PO₄ 0.1％，NH₄Cl 0.5％，MgSO₄·7H₂O 0.05％。

更為具體地，發(fā)酵過程采用好氧及限氧兩階段發(fā)酵：

(1)好氧階段：

將丙氨酸生產(chǎn)菌接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)；50L發(fā)酵罐發(fā)酵條件為通風比1:0.6vvm，轉(zhuǎn)速300rpm，溫度35℃；

(2)限氧階段：

當菌體OD₆₀₀達到2.5～3.5時開始補糖，當丙氨酸產(chǎn)率小于0.02g·L^-1·h^-1時停止補糖，當葡萄糖質(zhì)量濃度在小于0.1％時放罐；當菌體OD₆₀₀達到4～6時，停止通風進氣，并將轉(zhuǎn)速降至200rpm，直至發(fā)酵結(jié)束。

進一步地，根據(jù)發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度來控制補糖流加速率。補糖后的前5～8h，通過補糖控制發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖質(zhì)量濃度在0.4～0.6％，8h之后通過補糖控制發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖質(zhì)量濃度在0.2～0.4％。

作為優(yōu)選，所述丙氨酸生產(chǎn)菌接種至發(fā)酵培養(yǎng)基的接種量為10％。經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn)，該接種量能夠更好的利用發(fā)酵培養(yǎng)基，有利于L-丙氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明優(yōu)選了特定的培養(yǎng)基，并在發(fā)酵過程中采用流加補糖的方式進行L-丙氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)，有效的提高L-丙氨酸的產(chǎn)量，發(fā)酵水平達到135g/L，并有效縮短了L-丙氨酸的發(fā)酵周期。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。

在下面所述實施例中，葡萄糖濃度采用SBA-40E葡萄糖生物傳感儀(山東省科學(xué)院生物研究所)進行測定；L-丙氨酸含量的檢測方法參照中國專利公開號CN102329765A公開的方法；菌體密度采用分光光度法，測定波長600nm處的吸光值(OD₆₀₀)。以下實施例的發(fā)酵規(guī)模為50L發(fā)酵罐。其他如無特別說明，均采用本領(lǐng)域常用的知識和方法。

所述丙氨酸生產(chǎn)菌為E.coli FYFJ18，中國微生物菌種保藏中心的菌種保藏號為CGMCC No.12636。

實施例1

1、發(fā)酵培養(yǎng)基的配制：

所得發(fā)酵培養(yǎng)基包括(質(zhì)量百分比)：葡萄糖6％，牛骨蛋白胨0.1％，Na₂HPO₄·H₂O 1％，KH₂PO₄ 0.1％，NH₄Cl 0.5％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，其余為水。所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH自然。

采用50L發(fā)酵罐進行補料分批發(fā)酵，起始裝液量為50％。將上述培養(yǎng)基于121℃滅菌30min后，降溫至35℃?zhèn)溆谩?/p>

2、發(fā)酵：

2.1好氧發(fā)酵

將丙氨酸生產(chǎn)菌以10％的接種量接種至上述培養(yǎng)基中，于通風比為1:0.6vvm，轉(zhuǎn)速為300rpm，溫度35℃的條件中進行培養(yǎng)。采用分光光度法，實時測定波長600nm處的吸光值(OD₆₀₀)，檢測菌體密度。

2.2限氧發(fā)酵

在OD₆₀₀達到3時開始流加補糖，流加補糖的糖液中含有質(zhì)量濃度為65％的葡萄糖，質(zhì)量濃度為葡萄糖的1％的甘油，以及5～10mM的谷氨酸鈉。

補糖后的前6h，通過補糖控制發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖質(zhì)量濃度在0.4～0.6％，之后通過補糖控制發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖質(zhì)量濃度在0.2～0.4％。

發(fā)酵周期40h，檢測發(fā)酵液中的L-丙氨酸含量為135g/L。

實施例2

本實施例與實施例1的區(qū)別在于：將谷氨酸鈉替換為谷氨酸，發(fā)酵周期40h，檢測L-丙氨酸含量為130g/L。

實施例3

本實施例與實施例1的區(qū)別在于：補糖后的前8h，通過補糖控制發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖質(zhì)量濃度在0.4～0.6％，發(fā)酵周期42h，檢測L-丙氨酸含量為127g/L。

實施例4

本實施例與實施例1的區(qū)別在于：所得發(fā)酵培養(yǎng)基包括(質(zhì)量百分比)：葡萄糖8％，牛骨蛋白胨0.1％，Na₂HPO₄·H₂O 1％，KH₂PO₄ 0.1％，NH₄Cl 0.5％，MgSO₄·7H₂O 0.05％。發(fā)酵周期40，檢測L-丙氨酸含量為125g/L。

對比例1

本實施例與實施例1的區(qū)別在于：所得發(fā)酵培養(yǎng)基包括(質(zhì)量百分比)：葡萄糖12％，牛骨蛋白胨0.1％，Na₂HPO₄·H₂O 1％，KH₂PO₄ 0.1％，NH₄Cl 0.5％，MgSO₄·7H₂O 0.05％。好氧階段通風比為1:0.6vvm，轉(zhuǎn)速300rpm。當菌體OD₆₀₀達到5時，停止進氣，并將轉(zhuǎn)速降至200rpm，發(fā)酵進入限氧階段。發(fā)酵溫度35℃，罐壓0.05MPa，發(fā)酵過程中用氨水控制pH至7.0。發(fā)酵周期45h，L-丙氨酸含量為92g/L。

對比例2

本實施例與對比例1的區(qū)別在于：在限氧發(fā)酵過程中分三次補加質(zhì)量濃度為65％的葡萄糖，每次補加200mL。發(fā)酵周期50h，L-丙氨酸含量為99g/L。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明、具體實施方式及試驗，對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。