本發(fā)明涉及利用生物技術領域，具體涉及一種蝎神經(jīng)毒素BjαIT重組蛋白及其編碼基因與應用。

背景技術：

昆蟲神經(jīng)毒素是一類只作用于昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)，有毒殺作用的多肽類神經(jīng)毒素，主要來自于蝎，其次來自蜘蛛。這類對昆蟲有專一毒殺作用的毒素的作用位點是各種離子通道，具有高效昆蟲專一性的神經(jīng)毒素主要是作用于鈉離子通道的長鏈神經(jīng)毒素，這類長鏈神經(jīng)毒素一般由60-70個氨基酸組成，有2-4對鏈內(nèi)二硫鍵。不同種屬來源的神經(jīng)毒素在氨基酸的組成上沒有明顯的保守性，而同種來源神經(jīng)毒素在一級結構上具有很高的保守性。BjαIT是一種從蝎子Buthotus judaicus的毒液中分離到的一種對昆蟲具有高度選擇性的作用于鈉離子通道的α-型昆蟲神經(jīng)毒素，該成熟神經(jīng)毒素由64個氨基酸殘基組成，對農(nóng)業(yè)害蟲具有很強的毒殺作用，天然毒素對蝗蟲的半數(shù)癱瘓劑量(PD50)為50 ng/g體重，因此該毒素具有重要抗蟲價值。

現(xiàn)有技術中將昆蟲神經(jīng)毒素構建表達載體，然后轉(zhuǎn)化到E. coli BL21(DE3)進行表達，但得到的都是無活性的包涵體，通過在體外合適的條件下進行溶解、變性、復性和純化，從每升培養(yǎng)基僅能得到微量的可溶性蛋白質(zhì)，生產(chǎn)量低；也存在將構建的表達載體在酵母中表達的方法，但其表達量低且分離純化困難。目前，還沒有通過改造BjαIT的DNA序列且優(yōu)化BjαIT表達純化方法來高效生產(chǎn)BjαIT重組蛋白的方式，極大影響了BjαIT的抗蟲特性和生物安全性的分析研究尤其影響其在抗蟲中的應用，因此需開發(fā)出一種可以降低成本、實現(xiàn)大量生產(chǎn)且具有生物活性的昆蟲神經(jīng)毒素BjαIT的方法。

技術實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術中的缺陷，本發(fā)明目的之一在于提供一種蝎神經(jīng)毒素BjαIT的編碼基因。本發(fā)明提供基因，為編碼蝎神經(jīng)毒素BjαIT類蛋白的基因，為序列表中序列1所示的DNA分子，其編碼基因的讀碼框包含全部192個核苷酸。序列表中的序列1翻譯成的蛋白包括64個氨基酸殘基，為序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)分子。

所述重組載體具體為將上述基因插入表達載體中，得到表達上述蛋白的重組載體。所述重組載體具體優(yōu)選為將上述基因插入表達載體pET32的BamH和Hind酶切位點間，得到表達上述蛋白的重組載體。

擴增所述基因全長或其任意片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護范圍。上述引物對中的一條引物的核苷酸序列為序列表中的序列3，所述引物對中的另一條引物的核苷酸序列為序列表中的序列4，利用序列3和序列4的引物擴增的目標基因同樣可以進行相關的酶切和連接操作。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種制備蛋白的方法，包括步驟：將含有權利要求1所述的基因的重組表達載體導入宿主細胞，所述宿主細胞優(yōu)選為大腸桿菌，用于構建所述重組表達載體的原始載體優(yōu)選為pET32載體。

還包括純化蛋白的步驟：將表達得到的融合蛋白用腸激酶切割，再利用截留分子量為10 kDa的透析袋在pH值為6.5~7.0的5~10 mM Tris-HCl透析緩沖液中透析，將透析后所得的透析緩沖液，利用CM陽離子柱吸附后用10~30 mM NaCl溶液漂洗，再用100~150 mM NaCl洗脫，即可得高純度的BjαIT重組蛋白。

根據(jù)上述的制備蛋白的方法制備得到的純化后的蛋白也屬于本發(fā)明的保護范圍。

制備蛋白的優(yōu)選方法具體包括：

S1：優(yōu)化基因、構建原核表達載體及轉(zhuǎn)化：人工合成經(jīng)優(yōu)化的成熟蝎昆蟲神經(jīng)毒素BjαIT基因，并連接至表達載體pET32中，得到重組表達載體pET32/BjαIT，將重組載體pET32/BjαIT轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP10菌株中，再從TOP10中提取重組載體pET32/BjαIT；用熱激法將重組載體pET32/BjαIT轉(zhuǎn)入到宿主細胞大腸桿菌表達菌株中，用含有Amp抗性的LB平板篩選得到包含有重組載體pET32/BjαIT的大腸桿菌表達菌株轉(zhuǎn)化子；

S2：可溶性Trx-BjαIT融合蛋白的表達與提取：將步驟S1所得的包含有重組載體pET32/BjαIT的大腸桿菌表達菌株轉(zhuǎn)化子在37℃的LB液體抗性培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD₆₀₀為0.5~0.8時，加入濃度為0.1 mM~0.5 mM的IPTG，于18℃~25℃誘導10~16小時，然后超聲破碎，離心取上清液，得到重組的可溶性融合蛋白Trx-BjαIT；

S3：Trx-BjαIT融合蛋白的純化：利用鎳親合層析柱對Trx-BjαIT融合蛋白進行純化，先用含20~30 mM咪唑的pH 8.0 Tris-HCl溶液漂洗親合層析柱，然后用含50~400 mM咪唑的pH 8.0 Tris-HCl溶液將融合蛋白洗脫下來，即可得純度在90%以上的Trx-BjαIT融合蛋白；

S4：Trx標簽的切割及重組BjαIT蛋白的純化：將表達得到的融合蛋白用腸激酶切割，再利用截留分子量為10 kDa的透析袋在pH值為6.5~7.0的5~10 mM Tris-HCl透析緩沖液中透析，將透析后所得的透析緩沖液，利用CM陽離子柱吸附后用10~30 mM NaCl溶液漂洗，再用100~150 mM NaCl洗脫，即可得高純度的BjαIT重組蛋白。

本發(fā)明提供的技術方案具有以下優(yōu)點：一是利用pET32載體和大腸桿菌表達菌株，實現(xiàn)了表達產(chǎn)物與增溶因子Trx融合，得到大量可溶性Trx-BjαIT融合蛋白；二是在本發(fā)明的表達系統(tǒng)內(nèi)，Trx-BjαIT融合蛋白可按適當?shù)姆绞秸郫B，并保持天然構象；三是摸索出一條有效純化活性重組Trx-BjαIT、快速切割Trx并進一步純化得到無任何標簽的BjαIT重組蛋白得方法；四是通過大腸桿菌表達得到的BjαIT蛋白具有很高的生物活性。

本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例中的pET32/BjαIT載體構建示意圖；

圖2為本發(fā)明實施例中含有經(jīng)基因優(yōu)化BjαIT的pET28、pET30和pET32重組載體表達可溶性目標蛋白的SDS-PAGE檢測結果圖；

圖3為本發(fā)明實施例中的含有優(yōu)化BjαIT基因的pET32重組載體表達可溶性目標蛋白在不同條件下的SDS-PAGE檢測結果圖；

圖4為本發(fā)明實施例中的Trx-BjαIT融合蛋白純化的SDS-PAGE檢測結果圖；

圖5為本發(fā)明實施例中的Trx-BjαIT融合蛋白在不同酶切時間酶切得到的蛋白的SDS-PAGE檢測結果圖；

圖6為本發(fā)明實施例中的Trx-BjαIT、Trx-BjαIT酶切產(chǎn)物及rBjαIT重組蛋白的SDS-PAGE檢測結果圖；

圖7為本發(fā)明實施例中的去除標簽經(jīng)純化的rBjαIT重組蛋白的SDS-PAGE檢測結果圖；

圖8為本發(fā)明實施例中的除標簽經(jīng)純化的rBjαIT重組蛋白對蝗蟲的活性測定結果。

具體實施方式

下面將結合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到；下述實施例中的%，如無特殊說明，均為質(zhì)量百分含量。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，數(shù)據(jù)為三次重復實驗的平均值或平均值±標準差。

本發(fā)明選用大腸桿菌表達菌、載體擴增菌株TOP10和表達載體pET32均購自美國Invritrogen公司。

本發(fā)明中的引物具體序列如序列表中的序列3和序列4所示；利用序列3和序列4的引物擴增的目標基因同樣可以進行相關的酶切和連接操作。

所用培養(yǎng)基配方如下：

1）LB液體培養(yǎng)基：NaCl 10 g，蛋白胨10 g，酵母提取物 5 g，蒸餾水1 L，高壓滅菌，室溫保存；

2）LB/Amp平板：NaCl 10 g，蛋白胨10 g，酵母提取物 5 g，蒸餾水1 L，瓊脂粉15 g，高壓滅菌后，冷卻至70℃以下，加入1 mL濃度為100mg/ml的氨芐青霉素（Ampicillin），充分混均后倒板，4℃避光保存；

3）LB/Amp培養(yǎng)基：NaCl 10 g，蛋白胨10 g，酵母提取物 5 g，蒸餾水1 L，高壓滅菌后，冷卻至70℃以下，加入1mL Ampicillin（100mg/ml），充分混均，4℃保存；LB液體培養(yǎng)基：NaCl 10 g，蛋白胨10 g，酵母提取物 5 g，蒸餾水1 L，高壓滅菌，室溫保存。

4）50× TAE瓊脂糖凝膠電泳緩沖液：Tris堿121 g，冰乙酸28.6 mL，0.5 mol/L EDTA （pH 8.0) 50 mL，加蒸餾水定容至500 mL，室溫保存；

5）50 mg/mL氨芐青霉素保存液：氨芐青霉素0.5 g，加蒸餾水溶解并定容至10 mL，分裝后于-20 ℃保存；

6）5×SDS-PAGE上樣緩沖液：1 M Tris-HCl （pH 6.8) 1.25 mL，SDS 0.5 g，BPB 25 mg，甘油 2.5 mL，加去離子水溶解后定容至5 mL，分裝（約500 μL每份）后于室溫保存，使用每份加入25 μL β-巰基乙醇混勻；

7）5×SDS-PAGE電泳緩沖液：Tris 15.1 g，甘氨酸 94 g，SDS 5.0 g，加入約800 mL去離子水，充分攪拌溶解后定容至1 L，室溫保存；

8）考馬斯亮藍R-250染色液：考馬斯亮藍R-250 0.25g，加入225 mL甲醇、46 mL的冰乙酸、225 mL去離子水并攪拌均勻，濾紙去除顆粒物質(zhì)后，室溫保存；

9）考馬斯亮藍脫色液：冰乙酸 50 mL，甲醇 150mL，去離子水300 mL，充分混合后，室溫保存。

實施例一

本實施例提供了一種優(yōu)化的人工合成的BjαIT基因，具體序列如序列表中的序列1所示，該基因所對應的蛋白質(zhì)序列如序列表中的序列2所示。本實施例的優(yōu)化前的序列是根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫提供的DNA序列，是合成BjαIT神經(jīng)毒素的天然DNA，根據(jù)大腸桿菌表達的特點，優(yōu)化并合成優(yōu)化后的DNA。優(yōu)化后的DNA序列與BjαIT的天然多核苷酸(GenBank登錄號AB839884)沒有明顯的同源性。

將上述優(yōu)化前后的基因連接到大腸桿菌表達載體pET28、pET30及pET32中并獲得重組載體，以上經(jīng)測序驗證的重組載體分別熱激轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達菌株的感受態(tài)細胞，涂布對應的抗性LB平板，37℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12小時，篩選轉(zhuǎn)化子，其中pET32/BjαIT載體構建如圖1所示，圖1為本發(fā)明實施例中的pET32/BjαIT載體構建示意圖。

利用含未經(jīng)優(yōu)化的天然BjαIT基因序列以pET28、pET30及pET32為表達載體，其對應的表達菌轉(zhuǎn)化子經(jīng)0.5 mM的IPTG在18、25及37℃下誘導均未檢測到可溶性目標蛋白的表達。利用含優(yōu)化后的BjαIT基因序列的pET28、pET30及pET32重組載體為表達載體，其對應的表達菌轉(zhuǎn)化子經(jīng)0.5 mM的IPTG在18℃下誘導，其菌體總蛋白SDS-PAGE結果如圖2所示，其中以pET28（泳道1為經(jīng)IPTG誘導的菌體可溶性蛋白，泳道2為未經(jīng)IPTG誘導的菌體可溶性蛋白）和pET30為重組表達載體的轉(zhuǎn)化子未檢測到目標蛋白的表達（泳道3為未經(jīng)IPTG誘導的菌體可溶性蛋白，泳道4為未經(jīng)IPTG誘導的菌體可溶性蛋白），以pET32為表達載體檢測到目標蛋白的表達（泳道5為未經(jīng)IPTG誘導的菌體可溶性蛋白，泳道6為未經(jīng)IPTG誘導的菌體可溶性蛋白），BjαIT蛋白分子量約為7 kDa，pET32載體在目標蛋白的N－端融合了一個大小為18 kDa左右的Trx片段，Trx-BjαIT大小為25 kDa左右，表達的目標蛋白如箭頭所示。

實施例二

本實施例提供一種制備蛋白的方法，具體包括如下步驟：

S1：優(yōu)化基因、構建原核表達載體及轉(zhuǎn)化：人工合成經(jīng)優(yōu)化的成熟蝎昆蟲神經(jīng)毒素BjαIT基因，并連接至表達載體pET32中，得到重組表達載體pET32/BjαIT，載體構建如圖1所示。主要的載體構建步驟如下：

（1）用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切重組載體PCP/pUC，獲得目的片斷BjαIT，反應體系如下（所用內(nèi)切酶及緩沖液均購自大連TAKARA公司）：

載體BjαIT/pUC 15 μL

10×H 緩沖液 5μL

BamH Ⅰ 5U

HindⅢ 5U

無菌水 至50μL

（2）用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切pET32，獲得載體片斷，反應體系如下（所用內(nèi)切酶及緩沖液均購自大連TAKARA公司）：

載體pET32 15 μL

10×H 緩沖液 5μL

BamHⅠ 5U

HindⅢ 5U

無菌水 至50μL

（3）將步驟（1）和（2）得到的目的片斷和載體片斷用DNA凝膠收回試劑盒回收，該試劑盒購自大連TAKARA公司，具體操作按試劑盒說明書進行。

（4）將步驟（3）回收得到的目的片斷和載體用T4DNA連接酶（購自大連TAKARA公司）進行連接反應，目的基因準確插入載體讀碼框內(nèi)，反應體系如下：

載體pET32片段 1μL

目的片段落 3μL

10× 緩沖液 1μL

T4連接酶 0.5μL

無菌水 至10μL

將重組載體pET32/BjαIT轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP10菌株中，再從TOP10中提取重組載體pET32/BjαIT；用熱激法將重組載體pET32/BjαIT轉(zhuǎn)入到宿主細胞大腸桿菌表達菌株中，用含有Amp抗性的LB平板篩選得到包含有重組載體pET32/BjαIT的大腸桿菌表達菌株轉(zhuǎn)化子。

S2：可溶性Trx-BjαIT融合蛋白的表達與提?。簩瑑?yōu)化后基因的pET32/BjαIT載體的大腸桿菌重組轉(zhuǎn)化子在37℃的液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD₆₀₀為0.6，然后分別加入濃度為0、0.1、0.2、0.5和1.0 mM的IPTG，分別在18、25和37℃誘導12小時，誘導后收集的菌體超聲破碎，破碎功率300 W，破碎5 s，間隙9 s，循環(huán)90次后，離心取上清液，SDS-PAGE分析得到重組的可溶性融合蛋白Trx-BjαIT表達的最適條件18℃下用0.1 mM IPTG誘導12小時。

S3：Trx-BjαIT融合蛋白的純化：經(jīng)擴大培養(yǎng)和在18℃下用0.1 mM IPTG誘導12小時，收集經(jīng)IPTG誘導表達后后的表達菌的菌體，將菌體重懸于50 ml 的緩沖液A（含20 mM Tris-HCl，100 mM NaCl，和1 mM 蛋白酶抑制劑 PMSF，pH 8.0）中，然后用超聲破碎儀進行破碎，破碎功率300 W，破碎5 s，間隙9 s，循環(huán)90次；將破碎后的菌液在4℃下，30000 g離心15 min；將離心所得到的上清液加入到經(jīng)緩沖液A預平衡的鎳親合層析柱中；用100 ml緩沖液B（含20 mM Tris-HCl，100 mM NaCl，20~30 mM咪唑和0.5-1.0% Triton X-114，pH 8.0，先于冰浴上預冷至0℃-4℃）漂洗蛋白純化柱子后，分別加入包括濃度為50、100、200和400 mM咪唑的緩沖液C（含20 mM Tris-HCl，100 mM NaCl，pH 8.0），將蛋白洗脫下來，400 mM咪唑洗脫的溶液即可得純度在90%以上的Trx-BjαIT融合蛋白。

S4：Trx標簽的切割及重組BjαIT蛋白的純化：取1 mg Trx-BjαIT融合蛋白，加入2~3 U的重組小牛腸激酶，于25℃下進行酶切，每2小時取樣，至酶切12小時。酶切完成后，利用截留分子量為10 kDa的透析袋在pH值為6.5~7.0的5~10 mM Tris-HCl透析緩沖液中透析，將透析后所得的透析緩沖液，利用CM陽離子柱吸附后用10~30 mM NaCl溶液漂洗，再用100~150 mM NaCl洗脫，以即可得純度達95%以上的BjαIT重組蛋白，從1L大腸桿菌菌體中最終可獲得60 mg的高純度BjαIT重組蛋白。

需要說明的是， 在步驟S2得到的上清液中加入SDS-PAGE樣品緩沖液，對其可溶蛋白進行分析。在18℃、25℃和37℃溫度下IPTG的濃度為0.1 mM、0.5 mM和1.0 mM時，都可以得到可溶性Trx-BjαIT融合蛋白，具體結果如圖3所示，圖3為本發(fā)明實施例中的包含優(yōu)化后基因的pET32/BjαIT載體的大腸桿菌表達得到的可溶性Trx-BjαIT融合蛋白的SDS-PAGE檢測結果圖。其中，在18℃時，在供試濃度范圍內(nèi)，可溶性Trx-BjαIT均可高水平表達；在25℃時，在IPTG的濃度為0.1~0.5 mM時都有少量的可溶性Trx-BjαIT表達；在37℃時，在IPTG的濃度為0.2~0.5 mM時都有微量的可溶性Trx-BjαIT表達。。為節(jié)約成本，縮短生產(chǎn)周期，我們優(yōu)選采用誘導溫度18℃，0.1~0.2mM的IPTG進行誘導表達。

對于步驟S3，結果顯示利用包括50~400 mM的咪唑緩沖液C洗脫，其中400 mM咪唑的洗脫緩沖液中含有純度可達90%以上的Trx-BjαIT重組蛋白，融合蛋白的分子量約為25 kDa，表達產(chǎn)物可溶性Trx-BjαIT的純化過程的優(yōu)化如圖4所示，圖4為本發(fā)明實施例中的純化前Trx-BjαIT融合蛋白和用包括不同濃度的咪唑的緩沖液C純化得到的Trx-BjαIT融合蛋白的SDS-AGE檢測結果圖，在經(jīng)過50 ~200 mM的咪唑緩沖液C洗脫除去大量雜蛋白后，400 mM咪唑的洗脫緩沖液中含有純度可達90%以上的Trx-BjαIT重組蛋白。

對于步驟S4，用SDS-PAGE分析酶切效果，結果如圖5所示，圖5為本發(fā)明實施例中的Trx-BjαIT融合蛋白在不同酶切時間酶切得到的蛋白SDS-PAGE檢測結果圖。經(jīng)1小時酶切即可獲得經(jīng)切割的rBjαIT蛋白，經(jīng)2小時酶切就可獲得大量經(jīng)切割的rBjαIT蛋白但隨著時間的延長可以增加酶切效果，考慮到生產(chǎn)成本，在實際生產(chǎn)中優(yōu)先選擇用腸激酶切割4小時到6小時。酶切完成后，利用截留分子量為10 kDa的透析袋在pH值為6.5~7.0的5~10 mM Tris-HCl透析緩沖液中透析，將透析后所得的透析緩沖液，利用CM陽離子柱吸附后用10~30 mM NaCl溶液漂洗，再用100~150 mM NaCl洗脫，以即可得純度達95%以上的BjαIT重組蛋白，從1 L大腸桿菌菌體中最終可獲得50 mg的高純度BjαIT重組蛋白。Trx-BjαIT蛋白（條帶3）、經(jīng)酶切后的Trx-BjαIT蛋白（條帶2）和經(jīng)CM柱純化的不含表達標簽的rBjαIT蛋白（條帶1）的SDS-PAGE結果如圖6所示，可以看出不含表達標簽的rBjαIT蛋白經(jīng)CM陽離子柱吸附后得到了純化。純化后的蛋白利用截留分子量為3 kDa的超濾管進行濃縮，深縮后的rBjαIT蛋白SDS-PAGE結果如圖7所示，目標蛋白得到了濃縮。

對比例

本發(fā)明的發(fā)明人先前也將未優(yōu)化的天然蝎神經(jīng)毒素BjαIT的DNA，將其連接至pET系列載體中，經(jīng)IPTG誘導表達和鎳親合純化，未得到可溶性蛋白。之后，本發(fā)明的發(fā)明人先前也人工合成并優(yōu)化蝎神經(jīng)毒素BjαIT的DNA，將其連接至pET-30a(+)載體中，經(jīng)IPTG誘導表達和鎳親合純化，得到了少量的融合蛋白，僅在銀染條件下可看清目標蛋白條帶，但該蛋白經(jīng)注射和飼喂蝗蟲和德國小蠊均未檢測到生物活性。以上結果說明，原未經(jīng)優(yōu)化的基因未能實現(xiàn)目標蛋白的可溶性表達而優(yōu)化的基因以pET-30a(+)載體并不適合表達該殺蟲活性蛋白。同樣，將該基因連接至畢赤酵母分泌表達載體pPIC9K后轉(zhuǎn)化畢赤酵母，經(jīng)誘導表達，雖然獲得到較高水平的分泌表達，但由于其在酵母中分泌表達的雜蛋白太多，因而導至分離純化困難，最終未獲得純化的重組蛋白，僅對誘導后的上清液混合蛋白進行了活性測試。而本發(fā)明，從1 L大腸桿菌菌體中最終可獲得50 mg的高純度BjαIT重組蛋白。

同時，將對比例得到未經(jīng)純化的酵母表達的含有BjαIT蛋白的混合產(chǎn)物（A組）、上述步驟S3得到的純化后Trx-BjαIT融合蛋白（B組）和上述步驟S4得到的純化后的重組蛋白rBjαIT（C組）進行生物學活性分析，具體分析方法和結果如下。

實驗方法：利用PBS將對比例純化得到BjαIT蛋白（A組）、純化的Trx-BjαIT融合蛋白（B組）和純化的rBjαIT蛋白（C組）分別稀釋至2 mg/ml，按10 μg/g體重注射4齡東亞飛蝗各30只，同時以注射相同體積PBS（D組）的4齡東亞飛蝗作為對照，觀察4齡東亞飛蝗的中毒死亡癥狀。

實驗結果：結果發(fā)現(xiàn)，注射比例未純化含有BjαIT蛋白的誘導液上清的東亞飛蝗表現(xiàn)出了神經(jīng)系統(tǒng)中毒癥狀，并在24小時內(nèi)死亡率達到40%，注射純化的rBjαIT蛋白的東亞飛蝗立即表現(xiàn)出強烈的神經(jīng)毒素中毒癥狀，并在24小時內(nèi)所有蝗蟲全部死亡，注射純化的Trx-BjαIT融合蛋白的蝗蟲未表現(xiàn)出明顯神經(jīng)系統(tǒng)中毒癥狀，24小時內(nèi)死亡率為10%，而注射相同體積PBS的對照組蝗蟲無一出現(xiàn)中毒癥狀。其中注射純化的rBjαIT的東亞飛蝗12小時觀察到的部分死亡蝗蟲結果如圖8所示。生物學活性檢測結果表明，本發(fā)明技術方案制備的rBjαIT蛋白具有最強的生物活性。具體結果如下表1所示：

表1 生物學活性分析結果（n=3）。

在本說明書的描述中，參考術語“一個實施例”、“一些實施例”、 “示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結合該實施例或示例描述的具體特征、結構、材料或者特點包含于本發(fā)明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術語的示意性表述不必須針對的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結構、材料或者特點可以在任一個或多個實施例或示例中以合適的方式結合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領域的技術人員可以將本說明書中描述的不同實施例或示例以及不同實施例或示例的特征進行結合和組合。

盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，可以理解的是，上述實施例是示例性的，不能理解為對本發(fā)明的限制，本領域的普通技術人員在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對上述實施例進行變化、修改、替換和變型，而并不使相應技術方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實施例技術方案的范圍，其均應涵蓋在本發(fā)明的權利要求和說明書的范圍當中。

SEQUENCE LISTING

<110> 懷化學院

<120> 一種蝎神經(jīng)毒素BjαIT無標簽重組活性蛋白的高效生產(chǎn)方法

<130> 2016-12-15

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 192

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggtagagacg cttacatcgc tgacaacttg aactgtgctt acacctgtgg ttctaactct 60

tactgtaaca ctgaatgtac taaaaacggt gctgtttctg gatactgtca atggttggga 120

aaatacggaa acgcctgttg gtgtatcaat ttgcctgaca aagttcctat cagaatccct 180

ggagcctgta ga 192

<210> 2

<211> 64

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Gly Arg Asp Ala Tyr Ile Ala Asp Asn Leu Asn Cys Ala Tyr Thr Cys

1 5 10 15

Gly Ser Asn Ser Tyr Cys Asn Thr Glu Cys Thr Lys Asn Gly Ala Val

20 25 30

Ser Gly Tyr Cys Gln Trp Leu Gly Lys Tyr Gly Asn Ala Cys Trp Cys

35 40 45

Ile Asn Leu Pro Asp Lys Val Pro Ile Arg Ile Pro Gly Ala Cys Arg

50 55 60

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcctcgaggg tagagacgct tacatc 26

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gctctagatc tctacaggct ccagggattc 30