專利名稱：定點(diǎn)突變的人胰島素原基因及其腺病毒重組載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物遺傳領(lǐng)域，尤其是用于治療糖尿病的定點(diǎn)突變的人胰 島素原基因及其腺病毒重組載體。
背景技術(shù)：
目前糖尿病已成為僅次于心腦血管病癥和癌癥的第三大死亡疾病，據(jù)
WH0統(tǒng)計(jì)，全民糖尿病患者已接近1.5億，我國目前糖尿病患者的總數(shù)已達(dá) 到5000萬人。它是一種影響體內(nèi)胰島素和糖含量的疾病，共有兩種主要類 型，分別為I型和II型，其共同特征是胰島P細(xì)胞損傷或不能產(chǎn)生足夠 的胰島素或機(jī)體不能有效的利用胰島素，所以胰島素就被作為治療糖尿病 的特效藥應(yīng)用于臨床。由于隨時(shí)需要注射胰島素，給患者帶來了極大的不 便，目前國際上對糖尿病進(jìn)行胰島移植和基因治療研究成為了熱點(diǎn)。
在I型糖尿病中，免疫系統(tǒng)被誤導(dǎo)，對分泌胰島素的胰腺細(xì)胞發(fā)動(dòng)攻 擊導(dǎo)致調(diào)控糖代謝的胰島素水平降低甚至不復(fù)存在。I型糖尿病病人必須每 天注射胰島素才能維持生命。II型糖尿病的發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，與多種因素 相關(guān)，身體不能生成足夠的胰島素或者不能有效利用胰島素。目前的治療 主要著眼于改善機(jī)體的胰島素敏感性，糾正代謝紊亂，其基因治療報(bào)道甚 少。如果糖尿病患者不能適當(dāng)?shù)乜刂破溲撬?，則可能產(chǎn)生嚴(yán)重的并發(fā) 癥，包括心臟病、腎衰、失明和神經(jīng)損傷。
胰島素主要用于i型糖尿病和口服降糖藥不理想及嚴(yán)重并發(fā)癥的n型
糖尿病的治療，其作為糖尿病的特效藥用于臨床已有70多年的歷史。但是 由于胰島素半衰期短，糖尿病患者隨時(shí)需要注射胰島素，給患者帶來了極 大痛苦和不便，雖然口服胰島素和長效胰島素在某種程度上有所進(jìn)步，但 是未能從根本上解決問題。研究者們就把目光轉(zhuǎn)向了對糖尿病患者進(jìn)行胰 島移植和基因治療。胰腺或胰島移植被認(rèn)為是治愈I型糖尿病的有效手段， 但是供體來源不足、自身免疫排斥反應(yīng)、供體存活率低和代價(jià)昂貴等問題 限制了這一療法的廣泛應(yīng)用。而基因治療恰恰可避免上述缺陷，它是通過 將胰島素基因?qū)氩皇茏陨砻庖吖舻姆荘細(xì)胞，使之表達(dá)胰島素，行使代替P細(xì)胞的功能，從而達(dá)到從根本上治愈I型糖尿病的目的。
隨著分子生物學(xué)領(lǐng)域取得的迅猛發(fā)展，特別是隨著基因重組和轉(zhuǎn)基因 技術(shù)的發(fā)展，使基因治療糖尿病成為可能?；蛑委熖悄虿∧壳按嬖诘膬?個(gè)主要問題，S卩胰島素原基因在非e細(xì)胞中不能表達(dá)為成熟的胰島素； 選擇什么樣的安全有效的載體系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn)，只有胰島P細(xì)胞含有特定 前激素轉(zhuǎn)化酶(PC2和PC3)，可以把人胰島素原合成為成熟的具有生理活性 的胰島素A鏈和B鏈復(fù)合體。而非P細(xì)胞不含這類酶，研究者們直接將人 胰島素原基因轉(zhuǎn)染到其中，并不能合成成熟的胰島素。但在大多數(shù)非3細(xì)
胞內(nèi)普遍表達(dá)furin蛋白酶，它的底物是Arg Thr Lys Arg或Arg Gin Lys Arg。在C肽的兩端進(jìn)行定點(diǎn)突變，使其成為furin蛋白酶的底物。另外， 對于選擇安全有效的載體系統(tǒng)，腺病毒載體是在基因治療、基因免疫等方 面應(yīng)用開發(fā)得較早的一種基因載體，在美國近三分之一的基因治療臨床試 驗(yàn)中采用腺病毒載體。這些腺病毒載體現(xiàn)在正在被評估作為載體對癌癥、 心血管疾病和遺傳紊亂等病人進(jìn)行基因治療的安全性和有效性。根據(jù)美國 國家衛(wèi)生院的生物技術(shù)活動(dòng)辦公室統(tǒng)計(jì)，在過去的20年里，己進(jìn)行了將近 144例使用腺病毒載體的基因治療臨床試驗(yàn)，在所有參與基因治療臨床試驗(yàn) 的病人中，將近五分之一己引入了腺病毒載體。研究者們把定點(diǎn)突變的人 胰島素原基因構(gòu)建到真核表達(dá)載體(如pcDNA3. 1、 p (G1RE) 3BP-1、 p EF1 a-GFP等)或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(pLNCX、 PLXSN等)中，但是這些真核表達(dá) 載體只能轉(zhuǎn)染處于分裂期的細(xì)胞，對于非分裂期的細(xì)胞它們的轉(zhuǎn)染效率非 常的低；而逆轉(zhuǎn)錄病毒載體使用起來不安全，它們轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞后要整合 到宿主細(xì)胞的基因組中，極有可能引起致癌基因的激活。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是將野生型人胰島素原基因進(jìn)行定點(diǎn)突
變，然后將其構(gòu)建到腺病毒載體系統(tǒng)pAdEasy-l中，為進(jìn)一步轉(zhuǎn)染非胰島 e細(xì)胞，對糖尿病進(jìn)行基因治療奠定基礎(chǔ)。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是(1) RT — PCR方 法從正常流產(chǎn)胎兒胰腺組織獲取野生型人胰島素原cDNA ; (2)重疊延伸 PCR方法在人胰島素原cDNA上制造兩個(gè)突變位點(diǎn)，以使其可以被蛋白酶 Furin切割成熟，該突變型胰島素原cDNA片段命名為胰島素一M2
5(INS-M2) ; (3)將INS-M2亞克隆至腺病毒載體系統(tǒng)的穿梭載體的多克隆 位點(diǎn)(Hind III和XhoI)上，并與骨架載體共轉(zhuǎn)染至BJ5183細(xì)菌內(nèi)，通過 細(xì)菌內(nèi)同源重組得到重組載體。
一種定點(diǎn)突變的人胰島素原基因，通過重疊延伸PCR方法在人胰島素 原cDNA上制造兩個(gè)突變位點(diǎn)163-164和263位點(diǎn)，使其被蛋白酶Fur in切 割成熟，獲得定點(diǎn)突變的人胰島素原基因。
人胰島素原cDNA的堿基序列為SEQ ID NO. 1，經(jīng)過兩個(gè)突變位點(diǎn)獲得 定點(diǎn)突變的人胰島素原基因的堿基序列為SEQ ID NO. 3，命名為INS-M2。
一種定點(diǎn)突變的人胰島素原基因腺病毒重組載體，將INS-M2亞克隆至 腺病毒載體系統(tǒng)的穿梭載體的多克隆位點(diǎn)Hind III和Xhol上，并與骨架載 體共轉(zhuǎn)染至BJ5183細(xì)菌內(nèi)，通過細(xì)菌內(nèi)同源重組得到重組載體。
將腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdtrack-CMV和突變型人胰島素原基因頂S—M2分 別用HindIII和Xhol雙酶切，純化、回收雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物 命名為pAdtrack-INS-M2; pAdtrack-INS-M2質(zhì)粒經(jīng)Pmel酶線性化、去磷 酸化，以回收的CIAP處理的線性化pAdtrack-INS-M2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化常規(guī)氯化鈣 方法制備的BJ5183pAdEasier-1感受態(tài)細(xì)胞，接種于卡那霉素的LB培養(yǎng)基 內(nèi)，獲得定點(diǎn)突變的人胰島素原基因腺病毒重組載體，命名為pAd-INS-M2， 構(gòu)建策略見圖6。
腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdtrack-CMV和突變型人胰島素原基因INS—M2進(jìn)行 連接反應(yīng)條件為INS—M2雙酶切產(chǎn)物5y 1、pAdtrack-CMV雙酶切產(chǎn)物3u 1、 Buffer lul、 T4 DNA連接酶ltil， 16°C 16h。
pAdtrack-INS-M2質(zhì)粒經(jīng)Pmel酶線性化的條件是pAdtrack-INS-M2 質(zhì)粒2ug，尸/ffe/ 1U， 10 X NEB buff er4 5uL， 100 XBSA 0. 5 u L，補(bǔ)足 去離子水至總體積50uL， 37。C水浴4小時(shí)，95度水浴10分鐘，Takara膠 回收試劑盒純化回收。
線性化質(zhì)粒的去磷酸化的條件是線性化的pAdtrack-頂S-M2質(zhì)粒 lug， 10 XCIAP buffer 5yL， CIAP 1U，補(bǔ)足去離子水至總體積50 u L， 37t:水浴4小時(shí)，65度水浴30分鐘滅活CIAP，賽百盛小量膠回收試劑盒 濃縮回收。
以回收的CIAP處理的線性化pAdtmck-INS-M2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化常規(guī)氯化轉(zhuǎn)方
6法制備的BJ5183pAdEasier-1感受態(tài)細(xì)胞，鋪卡那霉素抗性的LB平板，37 t:孵箱倒置培養(yǎng)14 16小時(shí)，挑選數(shù)個(gè)體積最小的卡那霉素抗性菌落，接 種于3mL含有50 u g/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基內(nèi)，37°C中速振蕩培養(yǎng)過夜。 本發(fā)明的有益效果使人胰島素原基因在非e細(xì)胞內(nèi)可以表達(dá)為成熟 的胰島素分泌出來成為可能，為高效的轉(zhuǎn)染處于非分裂期的細(xì)胞奠定了基 礎(chǔ)。


圖1野生型INS cDNA凝膠電泳分析
圖2突變型INS—M1和INS—M2凝膠電泳分析(M: DL2000 Marker; 1: PCR1 products; 2: PCR2 products; 3: PCR products of INS —Ml; 4: PCR3 products; 5: PCR4 products; 6: PCR products of頂S—M2;)
圖3 pAd—INS—M2的凝膠電泳分析及PCR鑒定(M: DL15000 marker; 1: pAd-INS-M2; 2: Digestion with Pac I ; 3: PCR products of INS-M2)
圖4載體構(gòu)建圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明 本發(fā)明的定點(diǎn)突變的人胰島素原基因，通過重疊延伸PCR方法在人胰
島素原cDNA上制造兩個(gè)突變位點(diǎn)163-164和263位點(diǎn)，使其被蛋白酶Furin 切割成熟，獲得定點(diǎn)突變的人胰島素原基因。
一、野生型人胰島素原基因的獲得應(yīng)用RT-PCR方法從胎齡5m的經(jīng) 水囊引產(chǎn)的健康胎兒胰腺組織中克隆野生型人胰島素原基因。
1、 RNA提取采用Trizol—步法，1)無菌取健康新鮮流產(chǎn)胎兒胰腺 組織塊70mg用液氮在研缽中研磨成粉末，加入lmlTrizol，吹打混勻，轉(zhuǎn)移 至一個(gè)1. 5ml的EP管中，室溫靜置5分鐘。2)加入0. 2ml氯仿，劇烈振 蕩15秒，室溫靜置2-3分鐘。12000g， 4。C，離心15分鐘。3)取上清，加 入0.5 ml異丙醇室溫靜置15分鐘。12000g, 4°C，離心15分鐘。4)棄上 清，加入lml 75%的乙醇洗，7500g， 4°C，離心5分鐘。4)棄上清，沉淀 晾干，加入30ial DEPC水溶解。
2、 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA (40yl):取2. 5mMdNTP4 ii 1 ， 5xfirst strand buffer 8 u 1 ， DTT4u 1， 01igodT2ul，水16. 6 u 1 ，混勻后加入RNA約2ug， 65°C水浴5分鐘，快速冰浴2-3分鐘。加入50u/u lRNasin0. 4 u 1， Superscript II (200u/u 1 ) 1 u 1混勻后37°C水浴>1小時(shí)。取出后70。C 水浴10分鐘?！?0。C保存。
3、 PCR擴(kuò)增野生型人胰島素原基因根據(jù)Genebank發(fā)表的人胰島素 原基因cDNA序列，綜合利用Primer5和01igo6引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)人胰島 素原基因全長的引物，INS1: 5—GCT CTC GAG GCC ACC ATG GCC CTG TGG AT —3 ; INS2: 5— GAG AAG CTT GCT GCG TCT AGT TGC AGT AGT-3，劃 線部分為酶切位點(diǎn)(Xhol和Hindin)。
反應(yīng)條件以胰腺組織cDNA為模板，以上述頂S1和INS2為引物，擴(kuò) 增人INS全長基因序列。采用50uL體系，具體如下
10XPCR Buffer (含Mg2+1.5mM) 5uL
4XdNTP (10mM/mL) 4yL
INS上游引物(20pmol/L) 2uL
INS下游引物(20pmol/L) 2"L
c腿 2 u L
Pyrobest DNA聚合酶 0. 3 u L
滅菌去離子水 補(bǔ)足到50uL PCR擴(kuò)增程序?yàn)?br> 反應(yīng)條件為94。C變性5minute ;94。C變性30 seconds, 60。C退火30 seconds, 72°C延伸1 minute; 72°C延伸10 minute,共35個(gè)循環(huán)。
4、測序載體的構(gòu)建PMD-18T載體為本實(shí)驗(yàn)室所保存。將PMD18T載 體用Xhol和HindIII雙酶切，野生型人胰島素原基因PCR產(chǎn)物回收后補(bǔ)加 Taq酶O. 5uL， 72°C 15minute，與PMD-18T載體連接后，按常規(guī)方法氯化 鈣轉(zhuǎn)化，挑取單個(gè)克隆，搖菌后小量提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR和Xhol /Hindlll 雙酶切鑒定后，送測序，見SEQ IDNO.l，該基因完全符合Genebank上發(fā) 表的人胰島素原基因序列，命名為INS (見圖l)。
二、人胰島素原基因的定點(diǎn)突變根據(jù)PCR定點(diǎn)突變原理，分別在人 胰島素原基因B鏈/C肽及C肽/A鏈連接處進(jìn)行兩次突變，突變引物設(shè)計(jì)如 下INS3: 5—TTC TTC TAC ACA CCC巡ACC CGC—3; INS4: 5—GCG GGTC^" GGG TGT GTA GAA GAA —3 ; INS5: 5—GTC CCf GCA GAA GCG TGG CAT TGT —3; 1懸5—ACA ATG CCA CGC TTC TGC， GAC —3;弓l物INS3、 INS4 和引物INS5、頂S6分別是互補(bǔ)的，只有斜粗體劃線部分為突變的位點(diǎn)。
1、 第一個(gè)位點(diǎn)的突變以獲得的經(jīng)測序正確的野生型人胰島素原基因 為模板，首先進(jìn)行B鏈/C肽連接處的突變。用引物INS1、 INS4和引物INS3、 頂S2分別擴(kuò)增出兩段PCR產(chǎn)物1和2，PCR1的擴(kuò)增條件為94。C變性5minute ; 94。C變性30 seconds, 60。C退火30 seconds, 72°C延伸1 minute; 72°C延 伸10 minute,共35個(gè)循環(huán)。PCR2的擴(kuò)增條件為94。C變性5minute ; 94 。C變性30 seconds, 62。C退火30 seconds, 72°C延伸1 minute; 72°C延 伸10 minute,共35個(gè)循環(huán)。利用引物INS3和頂S4的互補(bǔ)部分使這兩段 PCR產(chǎn)物互為模板和引物，在DNA聚合酶的作用下延伸出整條人胰島素原基 因，擴(kuò)增條件為94。C5minute ; 94°C 30 seconds, 60°C 30 seconds, 72 °C 30 seconds; 7 Cycles。然后再加入引物INS1和INS2各1 u L，并補(bǔ)加 Pyr0beSt DNA聚合酶0. 5 u L，繼續(xù)擴(kuò)增含有第一個(gè)突變位點(diǎn)的人胰島素原 基因，擴(kuò)增條4牛為94°C 5minute ; 94°C 30 seconds, 60°C 30 seconds, 72°C 30 seconds; 30 Cycles; 72°C 7minute。并補(bǔ)力卩Taq酶0. 5 u L， 72°C 15minute，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到T載體中，并送測序公司測序鑒定。測 序結(jié)果顯示第一個(gè)位點(diǎn)突變成功，序列見SEQIDNO. 2。命名為INS—M1 (見 圖2)。
2、 第二個(gè)位點(diǎn)的突變以INS—M1基因?yàn)槟０?，進(jìn)行C肽/A鏈連接處 的突變。用引物頂S1和頂S6、 INS5和INS2分別擴(kuò)增PCR3和PCR4產(chǎn)物片 斷。PCR3的擴(kuò)增條件為94。C變性5minute ; 94。C變性30 seconds, 62°C 退火30 seconds, 72°C延伸1 minute; 72°C延伸10 minute,共35個(gè)循 環(huán)。PCR4的擴(kuò)增條件為94。C變性5minute ; 94。C變性30 seconds, 60°C 退火30 seconds, 72°C延伸1 minute; 72°C延伸10 minute,共35個(gè)循 環(huán)。利用引物INS5和INS6的互補(bǔ)部分使這兩段PCR產(chǎn)物互為模板和引物， 在DNA聚合酶的作用下延伸出整條人胰島素原基因，擴(kuò)增條件為94°C 5minute ; 94。C 30 seconds, 60°C 30 seconds, 72。C 30 seconds; 7 Cycles。 然后再加入引物INS1和INS2各1 u L，并補(bǔ)加PyrobestTMDNA聚合酶0. 5 u L， 繼續(xù)擴(kuò)增含有第一個(gè)突變位點(diǎn)的人胰島素原基因，擴(kuò)增條件為94°C
95minute ; 94。C 30 seconds, 60°C 30 seconds, 72。C 30 seconds; 30 Cycles; 72°C 7minute。補(bǔ)加Taq酶O. 5uL， 72°C 15minute。然后將擴(kuò)增產(chǎn)物連接 到T載體中，并送測序公司測序鑒定，見SEQIDN0.3。測序結(jié)果顯示第二 個(gè)位點(diǎn)突變也突變成功。命名為INS—M2。(見圖2)
三、 穿梭腺病毒載體的構(gòu)建
穿梭質(zhì)粒pAdtrack-CMV保存于DH5 a菌株中。自-80。C冰箱中取出凍 存的甘油菌，用滅菌的接種針刮拭少許菌液，立即劃板于含50ug/mL卡那 霉素的LB瓊脂平板表面。平板放置37'C過夜繼續(xù)培養(yǎng)。12小時(shí)后自抗性 LB瓊脂平板表面挑取中等大小的單克隆菌落，接種于含有相應(yīng)抗生素的LB 液體培養(yǎng)基中，37°C 200rpm培養(yǎng)過夜。然后小量提取質(zhì)粒。將腺病毒穿梭 質(zhì)粒pAdtmck-CMV和突變型人胰島素原基因(INS—M2)分別用HindIII和 Xhol雙酶切，純化、回收雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，連接反應(yīng)條件為INS—M2 雙酶切產(chǎn)物5ti1、 pAdtrack-CMV雙酶切產(chǎn)物1、 Buffer lu 1、 T4 DNA 連接酶lul， 16°C 16h，連接產(chǎn)物命名為pAdtrack-INS-M2，轉(zhuǎn)化DH5a感 受態(tài)細(xì)胞，鋪板、挑菌、搖菌、提取質(zhì)粒，HindIII、 Xho I酶切鑒定。結(jié)果 顯示穿梭腺病毒載體構(gòu)建成功。
四、 重組腺病毒載體的構(gòu)建
1、 pAdtrack-INS-M2質(zhì)粒經(jīng)Pmel酶線性化 pAdtrack-INS-M2質(zhì)粒 2 ti g 尸膨/ 1U
10XNEB buffer4 5uL 100XBSA 0. 5uL
補(bǔ)足去離子水至總體積50u L， 37。C水浴4小時(shí)，95度水浴10分 鐘，Takara膠回收試劑盒純化回收。
2、 線性化質(zhì)粒的去磷酸化
線性化的pAdtrack-INS-M2質(zhì)粒 1 p g
10XCIAP buffer 5uL CIAP 1U 補(bǔ)足去離子水至總體積50 u L， 37。C水浴4小時(shí)，65度水浴30分鐘滅 活CIAP，賽百盛小量膠回收試劑盒濃縮回收。3、 BJ5183 pAdEasier-l氯化鈣法感受態(tài)細(xì)胞的制備
E. coli BJ5183甘油菌復(fù)蘇，常規(guī)氯化f丐方法制備BJ5183感受態(tài)細(xì)胞。 取1 li L pAdEasier-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BJ5183感受態(tài)細(xì)胞，鋪鏈霉素/氨節(jié)青霉素 雙抗性LB平板(濃度均為50ug/mL)，置37"孵箱培養(yǎng)。12-16h后，挑 取數(shù)個(gè)克隆，接種于鏈霉素/氨芐青霉素雙抗性LB培養(yǎng)基，37r振蕩過夜。 次日晨收菌，將含有pAdEasier-l質(zhì)粒的BJ5183菌按照常規(guī)氯化鈣的方法 制備BJ5183pAdEasier-l感受態(tài)細(xì)胞。
4、 細(xì)菌內(nèi)同源重組及鑒定
以回收的CIAP處理的線性化pAdtrack-INS-M2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化常規(guī)氯化鈣方 法制備的BJ5183pAdEasier-l感受態(tài)細(xì)胞，鋪卡那霉素抗性的LB平板，37 'C孵箱倒置培養(yǎng)14 16小時(shí)。挑選數(shù)個(gè)體積最小的卡那霉素抗性菌落，接 種于3mL含有50 p g/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基內(nèi)，37°C中速振蕩培養(yǎng)過夜。 用賽百盛質(zhì)粒抽提試劑盒小量抽提質(zhì)粒DNA， 0. 8%瓊脂糖凝膠電泳根據(jù)質(zhì)粒 大小初步鑒定。選取近40Kb大小的質(zhì)粒，用PCR及尸sc/酶切的方法鑒定 重組子。
尸scl酶切反應(yīng)條件如下 候選質(zhì)粒 1 u g
尸sc/ 1U 10XNEB buffer 1 5uL 100XBSA 0. 5uL
補(bǔ)足去離子水至總體積50 ii L， 37t:水浴4小時(shí)，0.8%瓊脂糖凝膠電泳 分析酶切結(jié)果。正確的重組子命名為pAd-頂S-M2。(見圖3)，整個(gè)構(gòu)建 圖見圖4。
綜上所述，本發(fā)明的內(nèi)容并不局限在上述的實(shí)施例中，相同領(lǐng)域內(nèi)的 有識(shí)之士可以在本發(fā)明的技術(shù)指導(dǎo)思想之內(nèi)可以輕易提出其他的實(shí)施例， 但這種實(shí)施例都包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
iiSEQUENCE LISTING (序列表) 〈110〉中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所 〈120〉定點(diǎn)突變的人胰島素原基因及其腺病毒重組載體 〈160〉 3
<170〉 Paterrtln version 3. 3
〈210〉 <211> 〈212〉 〈213〉
〈220〉 〈221〉 <222>
1
346 DNA
人類(Homo sapiens)
gene
(l).. (346)
〈400〉 1
gccaccatgg ccctgtggat gcgcctcctg cccctgctgg cgctgctggc cctctgggga 60
cctgacccag ccgcagcctt tgtgaaccaa cacctgtgcg gctcacacct ggtggaagct 120
ctctacctag tgtgcgggga acgaggcttc ttctacacac ccaagacccg ccgggaggca 180
gaggacctgc aggtggggca ggtggagctg ggcgggggcc ctggtgcagg cagcctgcag 240
cccttggccc tggaggggtc cctgcagaag cgtggcattg tggaacaatg ctgtaccagc 300
atctgctccc tctaccagct ggagaactac tgcaactaga cgcagc 346<210〉 2
〈211〉 346
<212〉 DNA
〈213> 人類(Homo sapiens) <220>
<221〉 mutation
〈222〉 (163).. (164)
<400〉 2
gccaccatgg ccctgtggat gcgcctcctg cccctgctgg cgctgctggc cctctgggga 60
cctgacccag ccgcagcctt tgtgaaccaa cacctgtgcg gctcacacct ggtggaagct 120
ctctacctag tgtgcgggga acgaggcttc ttctacacac cccggacccg ccgggaggca 180
gaggacctgc aggtggggca ggtggagctg ggcgggggcc ctggtgcagg cagcctgcag 240
cccttggccc tggaggggtc cctgcagaag cgtggcattg tggaacaatg ctgtaccagc 300
atctgctccc tctaccagct ggagaactac tgcaactaga cgcagc 346
〈210〉 3
〈211〉 346
<212> 腿
〈213〉 人類(Homo sapiens) <220〉
<221〉 mutation
<222> (263).■ (263)
〈400〉 3gccaccatgg ccctgtggat gcgcctcctg cccctgctgg cgctgctggc cctctgggga 60
cctgacccag ccgcagcctt tgtgaaccaa cacctgtgcg gctcacacct ggtggaagct 120
ctctacctag tgtgcgggga acgaggcttx ttctacacac cccggacccg ccgggaggca 180
gaggacctgc aggtggggca ggtggagctg ggcgggggcc ctggtgcagg cagcctgc已g 240
cccttggccc tggaggggtc ccggcagaag cgtggcattg tggaacaatg ctgtaccagc 300
atctgctccc tctaccagct ggagaactac tgcaactaga cgcagc 346
1權(quán)利要求
1、一種定點(diǎn)突變的人胰島素原基因，其特征在于，通過重疊延伸PCR方法在人胰島素原cDNA上制造兩個(gè)突變位點(diǎn)163-164和263位點(diǎn)，使其被蛋白酶Furin切割成熟，獲得定點(diǎn)突變的人胰島素原基因。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的定點(diǎn)突變的人胰島素原基因，其特征在于， 人胰島素原cDNA的堿基序列為SEQ ID NO. 1，經(jīng)過兩個(gè)突變位點(diǎn)獲得定點(diǎn) 突變的人胰島素原基因的堿基序列為SEQ ID NO. 3，命名為INS-M2。
3、 一種定點(diǎn)突變的人胰島素原基因腺病毒重組載體，其特征在于，將 INS-M2亞克隆至腺病毒載體系統(tǒng)的穿梭載體的多克隆位點(diǎn)Hind III和Xhol 上，并與骨架載體共轉(zhuǎn)染至BJ5183細(xì)菌內(nèi)，通過細(xì)菌內(nèi)同源重組得到重組 載體。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的定點(diǎn)突變的人胰島素原基因腺病毒重組載體， 其特征在于，將腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdtrack-CMV和突變型人胰島素原基因INS 一M2分別用HindlII和XhoI雙酶切，純化、回收雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，連 接產(chǎn)物命名為pAdtrack-INS-M2; pAdtrack-頂S-M2質(zhì)粒經(jīng)Pmel酶線性化、 去磷酸化，以回收的CIAP處理的線性化pAdtrack-INS-M2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化常規(guī)氯 化鈣方法制備的BJ5183pAdEasier-1感受態(tài)細(xì)胞，接種于卡那霉素的LB培 養(yǎng)基內(nèi)，獲得定點(diǎn)突變的人胰島素原基因腺病毒重組載體，命名為 pAd-INS-M2，構(gòu)建策略見圖6。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的定點(diǎn)突變的人胰島素原基因腺病毒重組載體， 其特征在于，腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdtrack-CMV和突變型人胰島素原基因INS 一M2進(jìn)行連接反應(yīng)條件為INS—M2雙酶切產(chǎn)物5 til、 pAdtrack-CMV雙酶切 產(chǎn)物3ul、 Buffer liil、 T4 DNA連接酶lyl， 16°C 16h。
6、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的定點(diǎn)突變的人胰島素原基因腺病毒重組載體， 其特征在于，pAdtmck-INS-M2質(zhì)粒經(jīng)Pmel酶線性化的條件是 pAdtrack-INS-M2質(zhì)粒2ug，尸歷e/lU， 10XNEB buffer4 5iiL， 100XBSA 0. 5uL，補(bǔ)足去離子水至總體積50uL， 37t:水浴4小時(shí)，95度水浴10分 鐘，Takara膠回收試劑盒純化回收。
7、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的定點(diǎn)突變的人胰島素原基因腺病毒重組載體， 其特征在于，線性化質(zhì)粒的去磷酸化的條件是線性化的pAdtrack-INS-M2質(zhì)粒lug， 10XCIAP buffer 5uL， CIAP 1U，補(bǔ)足去離子水至總體積 50uL， 37。C水浴4小時(shí)，65度水浴30分鐘滅活CIAP，賽百盛小量膠回收 試劑盒濃縮回收。
8、根據(jù)權(quán)利要求4所述的定點(diǎn)突變的人胰島素原基因腺病毒重組載體， 其特征在于，以回收的CIAP處理的線性化pAdtrack-頂S-M2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化常規(guī) 氯化鈣方法制備的BJ5183pAdEasier-l感受態(tài)細(xì)胞，鋪卡那霉素抗性的LB 平板，37'C孵箱倒置培養(yǎng)14 16小時(shí)，挑選數(shù)個(gè)體積最小的卡那霉素抗性 菌落，接種于3mL含有50ug/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基內(nèi)，37。C中速振蕩 培養(yǎng)過夜。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種定點(diǎn)突變的人胰島素原基因及其腺病毒重組載體，(1)RT-PCR方法從正常流產(chǎn)胎兒胰腺組織獲取野生型人胰島素原cDNA；(2)重疊延伸PCR方法在人胰島素原cDNA上制造兩個(gè)突變位點(diǎn)，以使其可以被蛋白酶Furin切割成熟，該突變型胰島素原cDNA片段命名為胰島素-M2(INS-M2)；(3)將INS-M2克隆至腺病毒載體系統(tǒng)的穿梭載體的多克隆位點(diǎn)(Hind III和XhoI)上，并與骨架載體共轉(zhuǎn)染至BJ5183細(xì)菌內(nèi)，通過細(xì)菌內(nèi)同源重組得到重組載體。本發(fā)明使人胰島素原基因在非β細(xì)胞內(nèi)可以表達(dá)為成熟的胰島素分泌出來成為可能，為高效的轉(zhuǎn)染處于非分裂期的細(xì)胞奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/861GK101555478SQ20081005265
公開日2009年10月14日 申請日期2008年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月8日
發(fā)明者琳 石, 韓忠朝 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所