本發(fā)明涉及抗體藥物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種借助于穿膜肽將抗體導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的方法。

背景技術(shù)：

在分子生物學(xué)中，胞內(nèi)抗體(intrabody)指的是識別細(xì)胞內(nèi)的蛋白并在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用的抗體。由于缺乏有效的將抗體導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的手段，胞內(nèi)抗體主要通過在靶細(xì)胞內(nèi)表達(dá)抗體分子的手段實(shí)現(xiàn)，并應(yīng)用基因重組技術(shù)對抗體分子進(jìn)行適當(dāng)修飾，使之有不同的亞細(xì)胞定位，如線粒體、高爾基體、溶酶體或細(xì)胞核，從而可以阻斷某些重要的過程，或者干擾靶分子的加工分泌過程，從而發(fā)揮其生物學(xué)功能。早期通過抗體阻斷細(xì)胞內(nèi)的蛋白之間的相互作用是通過顯微注射(microinjection)這種技術(shù)實(shí)現(xiàn)的，對成熟抗體在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性及功能進(jìn)行了研究。然而，這方面的研究報(bào)道很少，可能是這種技術(shù)需要復(fù)雜的操作過程。因此迫切需要開發(fā)更加廣泛應(yīng)用的技術(shù)來實(shí)現(xiàn)將抗體分子導(dǎo)入活細(xì)胞內(nèi)。

自然產(chǎn)生的抗體來源于b細(xì)胞，并且在細(xì)胞外發(fā)揮作用，目前臨床上使用的抗體藥物一般針對的是細(xì)胞表面的靶標(biāo)，通過循環(huán)系統(tǒng)被運(yùn)送至靶部位，而胞內(nèi)抗體則是可以進(jìn)入到靶細(xì)胞內(nèi)部發(fā)揮其作用的抗體。自然產(chǎn)生的抗體是高度復(fù)雜的有序結(jié)構(gòu)，抗體的結(jié)構(gòu)對于維持抗體識別抗原及引起免疫效應(yīng)起著重要的作用。雖然抗體分子可以在不同的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，但是由于不同類型的細(xì)胞由于細(xì)胞質(zhì)中的環(huán)境不同，最終導(dǎo)致產(chǎn)生出的抗體結(jié)構(gòu)會有較大差別，甚至完全不能識別抗原。不僅如此，在臨床應(yīng)用時(shí)，若通過使用抗體基因運(yùn)送到靶細(xì)胞表達(dá)的方式產(chǎn)生胞內(nèi)抗體會受到載體的限制。其它用于基因治療的將胞內(nèi)抗體導(dǎo)入細(xì)胞的方法，包括病毒轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和非病毒轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，也面臨各種問題。病毒轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)包括腺病毒、慢病毒及腺相關(guān)病毒等，存在安全性(如引起癌基因的表達(dá))及免疫排斥等問題。而利用非病毒轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，例如裸露dna、各種dna的包裹技術(shù)，雖然安全性得到提高，但存在其它方面的問題，如靶向性差，轉(zhuǎn)染效率低和基因表達(dá)的瞬時(shí)性表達(dá)量低等問題。

細(xì)胞穿膜肽(cell-penetratingpeptides，cpps)是一段短的多肽，通常小于30個(gè)氨基酸，不僅本身具有穿越細(xì)胞膜的能力，還可以作為載體將生物大分子一同轉(zhuǎn)到細(xì)胞內(nèi)。目前研究較多的是1988年green等首次發(fā)現(xiàn)的hiv-ⅰ的轉(zhuǎn)錄活化因子tat，后續(xù)的研究表明有轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的結(jié)構(gòu)存在于49～57位氨基酸，被稱為蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(proteintransductiondomain，ptd)，在此之后，很多具類似跨膜功能的多肽分子陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。

通過穿膜肽將親水的物質(zhì)導(dǎo)入活細(xì)胞在基礎(chǔ)研究和治療學(xué)上都具有強(qiáng)大的應(yīng)用潛力。而且，在實(shí)際中所轉(zhuǎn)導(dǎo)的貨物可以不受尺寸的限制，從而極大的提高可以轉(zhuǎn)運(yùn)的貨物的范圍。穿膜肽在介導(dǎo)生物分子進(jìn)入細(xì)胞有很多優(yōu)勢，表現(xiàn)在：首先，細(xì)胞穿膜肽轉(zhuǎn)導(dǎo)的貨物不受分子量和其性質(zhì)的顯著影響，應(yīng)用范圍廣泛；其次，研究表明細(xì)胞穿膜肽毒性相對較小，具有良好的臨床應(yīng)用潛力；再次，細(xì)胞穿膜肽可以穿越多種類型的組織細(xì)胞，無顯著的特異性，可以廣泛的應(yīng)用于不同疾病的治療；最后，細(xì)胞穿膜肽穿膜能力強(qiáng)，可以通過粘膜進(jìn)入組織細(xì)胞，不局限于靜脈注射，可以用于口服或鼻黏膜給藥。理論上，細(xì)胞穿膜肽可以攜帶的貨物種類非常多，包括：小分子蛋白，多肽，質(zhì)粒，核酸，寡聚核苷酸，脂質(zhì)體及納米顆粒物等。

在將胞內(nèi)抗體導(dǎo)入細(xì)胞的技術(shù)中，至今尚未成功地采用穿膜肽將抗體導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，同時(shí)還能保持抗體的生物學(xué)功能。因此，研究穿膜肽介導(dǎo)的胞內(nèi)抗體導(dǎo)入細(xì)胞技術(shù)具有重要意義和應(yīng)用價(jià)值，也將為針對胞內(nèi)靶標(biāo)的治療性抗體研究提供了新的思路。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種將抗體導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的方法，使用穿膜肽能夠成功地將融合表達(dá)的抗體導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，并且保持抗體的生物學(xué)活性不受影響，該抗體能夠用于抗體藥物的制備中。

根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供一種將抗體導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的方法，通過將穿膜肽與抗體融合表達(dá)，上述抗體能夠穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與靶分子結(jié)合，上述抗體保持對抗原的特異性結(jié)合功能。

進(jìn)一步地，上述抗體包括完整抗體以及抗體片段。

進(jìn)一步地，上述穿膜肽與上述抗體的重鏈c端連接。

進(jìn)一步地，上述穿膜肽與上述抗體直接連接或通過連接序列介導(dǎo)連接。

進(jìn)一步地，上述穿膜肽的序列選自seqidno：5-17中任意一種。

進(jìn)一步地，上述穿膜肽是來源于hiv-ⅰ的轉(zhuǎn)錄活化因子tat(48-60)，上述抗體是針對hbx蛋白的單克隆抗體，并且上述穿膜肽與上述抗體的重鏈連接后形成的氨基酸序列是seqidno：1，上述抗體的輕鏈的氨基酸序列是seqidno：2。

根據(jù)本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提供一種第一方面的方法中得到的穿膜肽與抗體融合表達(dá)產(chǎn)物在制備抗體藥物中的用途。

進(jìn)一步地，上述抗體藥物是用于治療和/或預(yù)防腫瘤的抗腫瘤藥物。

根據(jù)本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提供一種將抗體藥物偶聯(lián)物導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的方法，通過將穿膜肽與抗體融合表達(dá)，上述抗體能夠穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與靶分子結(jié)合，上述抗體保持對抗原的特異性結(jié)合功能，并且上述抗體上偶聯(lián)有藥物分子。

進(jìn)一步地，上述偶聯(lián)的藥物是細(xì)胞毒性藥物或放射性核素。

進(jìn)一步地，上述偶聯(lián)的藥物是抗腫瘤藥物。

進(jìn)一步地，上述穿膜肽是來源于hiv-ⅰ的轉(zhuǎn)錄活化因子tat(48-60)，上述抗體是針對hbx蛋白的單克隆抗體，并且上述穿膜肽與所述抗體的重鏈連接后形成的氨基酸序列是seqidno：1，上述抗體的輕鏈的氨基酸序列是seqidno：2。

進(jìn)一步地，上述偶聯(lián)的藥物分子是甲基澳瑞他汀e(monomethylauristatine，mmae)。

根據(jù)本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提供一種第三方面的方法中得到的穿膜肽與抗體融合表達(dá)并且偶聯(lián)有藥物分子的產(chǎn)物在制備抗體藥物中的用途。

進(jìn)一步地，上述抗體藥物是用于治療和/或預(yù)防腫瘤的抗腫瘤藥物。

本發(fā)明的將抗體導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的方法，通過將穿膜肽與抗體融合表達(dá)，能夠成功地將抗體導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，并且保持抗體的生物學(xué)活性不受影響，該抗體能夠用于抗體藥物的制備中。

附圖說明

圖1為本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中在6d12抗體不同末端融合表達(dá)tat后對hbx的反應(yīng)動力學(xué)曲線；其中，對照表示未融合表達(dá)tat的6d12抗體，c:h-tat表示融合于重鏈c端，c:l-tat表示融合于輕鏈c端，n:h-tat表示融合于重鏈n端，n:l-tat表示融合于輕鏈n端；

圖2為本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中將tat融合表達(dá)于抗體fc末端的模式圖；

圖3為本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中重組表達(dá)的tat-6d12進(jìn)入細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，采用免疫熒光用共聚焦顯微鏡；

圖4為本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中幾種胞吞抑制劑可以阻斷tat-6d12可以進(jìn)入細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，采用免疫熒光用共聚焦顯微鏡；

圖5為本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中細(xì)胞內(nèi)tat-6d12對hbx的反應(yīng)活性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；

圖6為本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中tat-6d12與hbx在細(xì)胞內(nèi)的共定位的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，采用激光共聚焦顯微鏡；

圖7為本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的tat-6d12可以降解其靶標(biāo)hbx的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；

圖8為本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中tat-6d12與trim21在細(xì)胞內(nèi)共定位的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，采用激光共聚焦顯微鏡；

圖9為本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中突變后的tat-6d12不能降解細(xì)胞內(nèi)hbx的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；

圖10為本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中穿膜肽與adc融合表達(dá)tat-3g11-mmae治療組與對照組3g11-mmae相比的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，治療組顯著減小腫瘤的體積，提高其抗腫瘤療效。

具體實(shí)施方式

下面通過具體實(shí)施方式結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。

本發(fā)明首次成功地將穿膜肽與抗體融合表達(dá)在一起，形成能夠穿透細(xì)胞膜并在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮抗體活性作用的融合抗體。本發(fā)明通過具體實(shí)驗(yàn)證實(shí)了穿膜肽能夠?qū)⑴c其融合的抗體導(dǎo)入細(xì)胞?；诟鞣N穿膜肽的一般共性和各種抗體的一般共性，能夠知道本發(fā)明的穿膜肽與抗體形成融合抗體并具有穿膜功能和抗體活性作用的技術(shù)方案，廣泛地適用于各種穿膜肽和抗體。

合適的穿膜肽按照其來源特征包括但不限于：來源于天然蛋白中的穿膜肽，如tat、pvec和penetratin等；模式(model)穿膜肽，它們是模擬穿膜肽的結(jié)構(gòu)通過人工合成的兩親性α螺旋結(jié)構(gòu)，如map和(arg)7等；完全人工設(shè)計(jì)合成的穿膜肽，如transportan和mpg等，它們通常是嵌合多肽、兩性分子。可用于本發(fā)明中的一些典型的穿膜肽及其來源和功能性肽序列如表1所示。

表1細(xì)胞穿膜肽的種類

可用于本發(fā)明的合適的抗體指完整抗體以及抗體片段如fab片段，單鏈抗體(single-chainfv,scfv)，雙特異性單克隆抗體(bispecificmonoclonalantibodies,bsab)，二硫鍵穩(wěn)定抗體(disulfied-stablizedfv,dsfv)，單域抗體(singledomainantibody,sdab)?？贵w可以是多克隆抗體也可以是單克隆抗體，優(yōu)選單克隆抗體，本發(fā)明中的抗體是重組表達(dá)的抗體，優(yōu)選重組表達(dá)的抗體作為單克隆抗體。重組表達(dá)的抗體能夠通過重組表達(dá)的方式與穿膜肽融合在一起直接形成融合抗體。

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，在穿膜肽與抗體融合表達(dá)時(shí)，穿膜肽與抗體的重鏈c端連接比與抗體的其它部位(例如重鏈n端、輕鏈c端和輕鏈n端等)連接能夠更好地保持抗體活性作用不受影響。因此，優(yōu)選穿膜肽與抗體的重鏈c端連接。

穿膜肽與抗體之間的連接可以是直接連接，也可以是通過連接序列(linker)介導(dǎo)連接。典型但非限定性的連接序列比如(gggs)4。在不影響抗體活性作用的前提下，優(yōu)選穿膜肽與抗體之間直接連接。在某些情況下，穿膜肽與抗體之間直接連接會影響抗體活性作用，而通過連接序列連接能夠消除這種影響，在這樣的情況下，穿膜肽與抗體之間最好通過連接序列。具體地，可以根據(jù)具體的抗體特性和采用的穿膜肽的類型和特性選擇連接方式。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，穿膜肽是來源于hiv-ⅰ的轉(zhuǎn)錄活化因子tat(48-60)，抗體是針對hbx蛋白的單克隆抗體，其是通過重組表達(dá)獲得的抗體。tat(48-60)與針對hbx蛋白的單克隆抗體通過重組表達(dá)方式形成融合抗體，二者直接連接在一起，并且優(yōu)選地將tat(48-60)連接在針對hbx蛋白的單克隆抗體的重鏈c端。在該優(yōu)選實(shí)施例中，穿膜肽與抗體的重鏈c端連接后形成的氨基酸序列是seqidno：1(參見序列表)，抗體的輕鏈的氨基酸序列是seqidno：2(參見序列表)。

本發(fā)明的融合抗體可以直接作為抗體藥物使用，也可以用于藥物的制備中。這種抗體藥物帶有穿膜肽，因此能夠穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，抗體能夠靶向細(xì)胞內(nèi)的靶標(biāo)，提高治療的靶向性和療效。這種抗體藥物優(yōu)選是用于治療和/或預(yù)防腫瘤的抗腫瘤藥物。由于腫瘤治療中存在靶向性不足和對正常組織造成負(fù)面性殺傷問題，而本發(fā)明的融合抗體能夠穿透細(xì)胞膜進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)，克服了抗體藥物難以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的難題，從而對于細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo)分子引起的腫瘤具有明顯的療效。

在進(jìn)一步研究中，本發(fā)明的融合抗體可以與目前的抗體藥物偶聯(lián)物(antibodydrugconjugate,adc)結(jié)合在一起，形成帶有穿膜肽的抗體藥物偶聯(lián)物，該抗體藥物偶聯(lián)物包括融合抗體和偶聯(lián)的藥物，其中融合抗體包括融合在一起的穿膜肽和抗體，并且融合抗體能夠穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與靶分子結(jié)合。一方面，抗體能夠發(fā)揮對靶標(biāo)分子的特異性結(jié)合作用，進(jìn)而清除靶標(biāo)分子或清除其影響；另一方面，偶聯(lián)的藥物也能靶向性地發(fā)揮其治療作用，提高靶向性和療效。偶聯(lián)的藥物可以是細(xì)胞毒性藥物或放射性核素等，其可以是用于治療和/或預(yù)防腫瘤的抗腫瘤藥物。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所形成的帶有穿膜肽的抗體藥物偶聯(lián)物，包括來源于hiv-ⅰ的轉(zhuǎn)錄活化因子tat(48-60)作為穿膜肽，針對hbx蛋白的單克隆抗體作為抗體，甲基澳瑞他汀e(monomethylauristatine，mmae)作為偶聯(lián)的藥物分子。其中，穿膜肽和抗體通過重組表達(dá)方式以直接連接的形式形成融合抗體，而偶聯(lián)的藥物與融合抗體通過化學(xué)偶聯(lián)的方式偶聯(lián)在一起，優(yōu)選在活化后通過edc(1-ethyl-3-(3a-dimethylaminopropyl)-carbodiimidehydrochloride)偶聯(lián)在一起。

本發(fā)明的融合抗體包括融合在一起的穿膜肽和抗體，能夠成功地導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，并且保持抗體的生物學(xué)活性不受影響，該融合抗體能夠用于抗體藥物的制備中。

下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，應(yīng)當(dāng)理解的是，實(shí)施例僅是示例性的，并不構(gòu)成對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。

實(shí)施例1：穿膜肽tat(48-60)與抗hbx蛋白的抗體形成融合抗體tat-6d12

本實(shí)施例采用融合表達(dá)的方法，分別將tat(48-60)(具體的氨基酸序列是：grkkrrqrrrppq)添加到已經(jīng)構(gòu)建好的重組表達(dá)6d12抗體的重鏈c端(c:h-tat)、輕鏈c端(c:l-tat)、重鏈n端(n:h-tat)或輕鏈n端(n:l-tat)四種方式。

首先評價(jià)改造后的抗體對hbx的反應(yīng)活性是否發(fā)生變化。用不同濃度重組hbx蛋白包板，以間接化學(xué)發(fā)光免疫檢測精細(xì)評估各融合抗體的反應(yīng)動力學(xué)曲線，圖1所示的結(jié)果顯示，將tat(48-60)加在重鏈或者輕鏈的n端都導(dǎo)致抗體對hbx蛋白反應(yīng)性的完全消失，而加在輕鏈的c端，雖然保留了與hbx蛋白的反應(yīng)性，但與未改造的抗體相比反應(yīng)活性下降了近兩個(gè)數(shù)量級，只有將tat(48-60)融合表達(dá)于抗體的重鏈c端(c:h-tat)，即抗體的fc端，不影響6d12對hbx的反應(yīng)活性。將tat融合表達(dá)于抗體的fc端的模式圖如圖2所示。

實(shí)施例2：融合表達(dá)的tat-6d12抗體的穿膜效果

將在6d12fc末端融合tat(48-60)構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染cho細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，并用proteina親和層析純化分泌到培養(yǎng)基上清的抗體，進(jìn)而開展生物學(xué)功能分析。將重組表達(dá)的tat-6d12和未改造的6d12分別添加到huh7的細(xì)胞培養(yǎng)基中，終濃度為0.3mg/ml，孵育12h，然后做免疫熒光用共聚焦顯微鏡分析tat-6d12能否進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。結(jié)果如圖3所示，重組表達(dá)的tat-6d12可以顯著地進(jìn)入huh7細(xì)胞內(nèi)(注：熒光原來為綠色，轉(zhuǎn)化后為灰白色)，進(jìn)入效率接近100％，非常高效，并且呈彌散狀分布，提示抗體在細(xì)胞質(zhì)中分布。進(jìn)而在不同種屬及組織來源的細(xì)胞系如，人肝癌細(xì)胞系hepg2、鼠肝癌細(xì)胞系hepa1-6、人胚腎細(xì)胞系hek-293、人肺癌細(xì)胞系a549等研究發(fā)現(xiàn)，tat-6d12都可以有效的穿越細(xì)胞膜進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)(結(jié)果未示出)。提示重組表達(dá)的tat-6d12可以非特異性的高效進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。

實(shí)施例3：融合表達(dá)的抗體tat-6d12的穿膜機(jī)制研究

tat介導(dǎo)的穿膜機(jī)制目前還沒有徹底研究清楚，最新的研究結(jié)果表明，胞吞作用(endocytosis)在其內(nèi)化過程中占有重要地位，普遍認(rèn)為tat接到的大分子轉(zhuǎn)運(yùn)依賴于胞吞作用。因此，采用幾種常用的胞吞抑制劑進(jìn)行研究，研究能否阻斷tat-6d12進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。這幾種常用的胞吞抑制劑的作用機(jī)制如表2所示。首先將這些抑制劑分別加入到huh7細(xì)胞培養(yǎng)基中，然后將終濃度為0.3mg/mltat-6d12添加到細(xì)胞培養(yǎng)基中，孵育12h，然后做免疫熒光用共聚焦顯微鏡分析tat-6d12進(jìn)入細(xì)胞的過程是否被阻斷。結(jié)果如圖4所示，非律平(filipin)、細(xì)胞松弛素d(cytochalasind，cytod)、氯喹(chloroquine，chlo)這三種抑制劑能夠顯著阻斷tat-6d12進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，甲基-β-環(huán)糊精(methyl-β-cyclodextrin，mβcd)對tat-6d12的內(nèi)化過程也有一定程度的抑制作用。綜上所述，tat-6d12穿越細(xì)胞膜進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)部是一個(gè)依賴胞吞的過程，并且，網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞(cme,clathrin-mediatedendocytosis)、網(wǎng)格蛋白獨(dú)立的內(nèi)吞(cie,clathrin-independentendocytosis)、巨胞飲(macropinocytosis)以及脂筏(lipidraft)四種模式都可能參與了tat介導(dǎo)的抗體入胞過程。

表2幾種常用胞吞抑制劑及作用模式

(ccvs，clathrin-coatedvesicles,網(wǎng)格蛋白包被的囊泡)

實(shí)施例4：進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的tat-6d12仍具有對hbx的反應(yīng)活性

為了研究內(nèi)化到細(xì)胞中的tat-6d12是否還具有對hbx的反應(yīng)活性，將終濃度0.3mg/ml的tat-6d12分別孵育huh7細(xì)胞0.5h、2h、4h、6h、8h、10h、12h，然后用pbs洗滌5遍，并用非變性裂解液ddm裂解細(xì)胞，并將細(xì)胞裂解液添加到hbx包被的elisa板，檢測其對hbx的親和力。圖5所示的結(jié)果顯示，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的tat-6d12對hbx仍具有良好的反應(yīng)活性(注：熒光原來為綠色，轉(zhuǎn)化后為灰白色)，提示tat-6d12在細(xì)胞內(nèi)仍能夠保持其活性。

實(shí)施例5：進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的tat-6d12可以識別其靶標(biāo)hbx

為了研究內(nèi)化到細(xì)胞中的tat-6d12是否能夠識別細(xì)胞內(nèi)的hbx蛋白，通過免疫熒光的方法，研究二者在細(xì)胞內(nèi)是否共定位。如圖6所示，綠色熒光代表hbx蛋白(注：右上圖，熒光原來是綠色，轉(zhuǎn)化后成灰白色)，紅色熒光代表tat-6d12(注：左下圖，熒光原來是紅色，轉(zhuǎn)化后成灰白色)，通過激光共聚焦顯微鏡拍攝，然后將圖片合并在一起，結(jié)果顯示綠色熒光與紅色熒光重疊在一起(注：右下圖，熒光原來是綠色和紅色，轉(zhuǎn)化后成灰白色)，表明細(xì)胞內(nèi)的tat-6d12與hbx蛋白形成復(fù)合物，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的tat-6d12可以識別其靶標(biāo)hbx。

實(shí)施例6：進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的tat-6d12可以降解其靶標(biāo)hbx

通過蛋白印跡(westernblot)檢測進(jìn)去到細(xì)胞內(nèi)的tat-6d12是否降解其靶標(biāo)hbx，內(nèi)參蛋白為微管蛋白(tublin)，用于表示所使用蛋白總量一致。圖7所示的結(jié)果顯示，tat-6d12處理組中的hbx量顯著少于6d12處理組及對照抗體處理組，表明進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的tat-6d12可以降解其靶標(biāo)hbx。

實(shí)施例7：進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的tat-6d12與trim21相互作用

最新的研究表明，當(dāng)腺病毒感染細(xì)胞后，吸附在腺病毒表面上的抗體也隨之被一起帶入細(xì)胞內(nèi)，并可以與細(xì)胞質(zhì)中的抗體fc受體——trim21結(jié)合，激發(fā)起細(xì)胞內(nèi)免疫反應(yīng)以消滅病毒。作為一種存在于細(xì)胞內(nèi)部的fc受體，trim21與igg的結(jié)合力比目前已知的所有fc受體都要強(qiáng)。trim21識別吸附在病毒表面的抗體分子，然后通過其e3泛素化配體的功能催化k48和kk63泛素化鏈的形成。催化形成的k48能夠通過aaaatpasevcp和蛋白酶體(proteasome)降解系統(tǒng)，將病毒顆粒在幾小時(shí)內(nèi)快速消滅。同時(shí)，trim21催化形成的k63鏈能夠激活下游的固有免疫信號通路，例如nfκb、ap-1和irf3/5/7，這導(dǎo)致細(xì)胞因子和趨化因子等抗病毒分子的大量表達(dá)，上調(diào)nkg2d配體和mhcⅱ類分子，使細(xì)胞處于抗病毒狀態(tài)。猜測通過基因改造過的在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用的tat-6d12抗體，其作用機(jī)制很可能是通過類似的途徑，因此，對這一猜測進(jìn)行驗(yàn)證。trim21是目前唯一被報(bào)道的細(xì)胞質(zhì)中的抗體fc受體，通過改造過的可以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的抗體很可能是通過這個(gè)fc受體發(fā)揮作用。為了研究trim21與進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的tat-6d12之間是否存在相互作用，通過免疫熒光的檢測方法，用共聚焦顯微鏡觀察他們在細(xì)胞內(nèi)是否共定位。圖8所示的結(jié)果表明，代表tat-6d12的綠色信號(注：左上圖，熒光信號原來為綠色，轉(zhuǎn)化后為灰白色)與代表trim21的紅色信號(注：右上圖，熒光信號原來為紅色，轉(zhuǎn)化后為灰白色)重疊在一起，顯示tat-6d12和trim21之間存在相互作用，形成復(fù)合物。

實(shí)施例8：突變后的tat-6d12抗體不能降解細(xì)胞內(nèi)hbx蛋白

為了進(jìn)一步確認(rèn)抗體在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用是依賴trim21分子的模式，首先構(gòu)建了ch3缺失的tat-6d12克隆(tat-6d12-ch3^-)，然后表達(dá)純化，結(jié)果顯示tat-6d12-ch3^-與hbx的結(jié)合活性沒有發(fā)生顯著的改變，表明抗體的fc端ch3區(qū)域在介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)免疫起著重要的作用。

為了進(jìn)一步評價(jià)tat-6d12在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用依賴于與trim21的相互作用，通過將其與抗體結(jié)合的熱點(diǎn)(hot-spots)做點(diǎn)突變，為h433a、n434a、h435a，更深入的研究trim21在抗體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)免疫所起的作用。圖9所示的結(jié)果顯示，突變后的tat-6d12由于不能與trim21形成復(fù)合物，因此不能降解細(xì)胞內(nèi)的hbx蛋白。

實(shí)施例9：穿膜肽提高adc的治療效果

近幾年發(fā)展起來的抗體藥物偶聯(lián)物(antibodydrugconjugate,adc)，即將細(xì)胞毒性藥物或放射性核素與抗體偶聯(lián)并帶入至靶細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞的高效特異的殺傷，是新一代抗體技術(shù)臨床應(yīng)用的發(fā)展方向。雖然adc獲得了巨大的成功，引起了廣泛的關(guān)注，但是adc開發(fā)技術(shù)要求高，工藝復(fù)雜，其中adc被靶細(xì)胞吞噬的效率低是目前臨床應(yīng)用的瓶頸問題，數(shù)據(jù)顯示僅有極少數(shù)的adc分子可以進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，吞噬的效率的提高對于抗腫瘤療效的提升至關(guān)重要。

本研究發(fā)現(xiàn)，將穿膜肽與抗體融合表達(dá)可以顯著的提高抗體的內(nèi)化效率，該技術(shù)可應(yīng)用于adc藥物的開發(fā)，提高內(nèi)化效率及對腫瘤的殺傷能力。本研究的數(shù)據(jù)顯示，穿膜肽不具有靶向性，然而將針對hbs的抗體(3g11)與穿膜肽(tat)融合表達(dá)后，一方面可以將抗體導(dǎo)入細(xì)胞，另一方面提高了穿膜肽的靶向性，即tat-3g11在hbv陽性的肝癌細(xì)胞(hepa1-6-n10)進(jìn)入效率更高。由于抗體進(jìn)入細(xì)胞后沒有顯著的細(xì)胞毒性，為了提高對肝癌細(xì)胞的殺傷力，將前期研究過的小分子毒素mmae(monomethylauristaine)與tat-3g11偶聯(lián)在一起，即tat-3g11-mmae。其中，tat與3g11抗體的重鏈c端融合后形成的氨基酸序列是seqidno：3(參見序列表)，3g11抗體的輕鏈的氨基酸序列是seqidno：4(參見序列表)。

體外的細(xì)胞測定表明tat-3g11-mmae對hbv陽性的肝癌細(xì)胞(hepa1-6-n10)具有更顯著的細(xì)胞毒性，隨后的動物實(shí)驗(yàn)(圖10)也證實(shí)了該偶聯(lián)物對由hepa1-6-n10所形成的腫瘤具有顯著的治療作用。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明穿膜肽與adc融合表達(dá)可以提高其在靶細(xì)胞的內(nèi)化效率，提高其抗腫瘤療效。對于adc藥物的開發(fā)策略具有重要的指導(dǎo)意義。

以上內(nèi)容是結(jié)合具體的實(shí)施方式對本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

sequencelisting

<110>張軍方

<120>一種將抗體導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的方法

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