本發(fā)明屬于生物醫(yī)用高分子聚合物有機(jī)/無機(jī)復(fù)合材料領(lǐng)域，特別涉及一種主鏈中含有二硫鍵節(jié)點(diǎn)的兩親性可降解雙響應(yīng)聚合物及其負(fù)載藥物和金納米粒子膠束的制備方法與在CT成像和藥物遞釋領(lǐng)域中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

腫瘤的藥物化療一直以來都是人們研究的重點(diǎn)，其中基于納米聚合物膠束為載體的診療一體化體系，即診斷-治療一體化系統(tǒng)，為高效的腫瘤可視化靶向化療提供了強(qiáng)有力的手段。

研究表明載藥聚合物膠束在腫瘤細(xì)胞內(nèi)部的藥物釋放非常緩慢，這導(dǎo)致了細(xì)胞內(nèi)部藥物濃度低下，不利于克服腫瘤細(xì)胞的多抗藥性，從而導(dǎo)致了腫瘤治療效率低下。當(dāng)藥物載體在腫瘤細(xì)胞內(nèi)部較快的釋放藥物并能在短時(shí)間內(nèi)積累較高濃度的藥物分子則可以有效克服腫瘤細(xì)胞的多抗藥性，進(jìn)而殺死腫瘤細(xì)胞?；谶@種目的，多刺激響應(yīng)可降解聚合物膠束則能很好的實(shí)現(xiàn)聚合物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)部微環(huán)境中藥物的快速釋放并在短時(shí)間內(nèi)積累高濃度的藥物分子。刺激響應(yīng)聚合物能對(duì)外部刺激如pH、還原電勢(shì)、光、超聲等進(jìn)行智能響應(yīng)，實(shí)現(xiàn)自組裝膠束微觀結(jié)構(gòu)的失穩(wěn)甚至解體(降解)等，明顯提升膠束內(nèi)核藥物的釋放速率。基于腫瘤組織和正常組織微環(huán)境中的谷胱甘肽(GSH)濃度的顯著差異，這種特異性差異性可以很好的應(yīng)用到智能刺激響應(yīng)可降解膠束藥物遞釋體系的研究中，將二硫鍵引入到聚合物膠束結(jié)構(gòu)中，使其在正常生理環(huán)境中結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定，而在腫瘤細(xì)胞內(nèi)部的強(qiáng)還原性(即高GSH濃度)條件下斷裂，引起膠束結(jié)構(gòu)失穩(wěn)解體(降解)，進(jìn)而有效的控制和促進(jìn)藥物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)藥物的快速釋放和高濃度積累，克服多抗藥性，實(shí)現(xiàn)較高的腫瘤化療效果。

另外，在較高的藥物化療效果的同時(shí)，若能將腫瘤部位進(jìn)行可視化治療，即實(shí)現(xiàn)腫瘤組織部位的成像，則化療的準(zhǔn)確性和靶向性將進(jìn)一步提高。常用的腫瘤部位成像技術(shù)有MRI、超聲、CT等。其中，金納米顆粒在量子尺寸效應(yīng)和表面效應(yīng)方面較其他的金屬粒子有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，而且可以在腫瘤部位富集，在CT成像用于腫瘤部位的可視化治療和診斷領(lǐng)域有著重要的應(yīng)用價(jià)值。然而，在一般的制備納米金粒子的過程中，小分子硫化物作為穩(wěn)定劑，硼氫化鈉作為還原劑，這樣會(huì)產(chǎn)生小分子副產(chǎn)物，而且得到的金納米粒子不穩(wěn)定，這樣就限制了金納米顆粒在CT成像技術(shù)中的應(yīng)用。Armes等合成了PMPC-b-PDMAEMA兩嵌段聚合物，在不添加任何其它還原劑時(shí)，PDMA可以原位還原AuCl4-生成金納米粒子，并能很好的穩(wěn)定納米金顆粒(Langmuir,2006,22,11022-11027)。

同時(shí)負(fù)載抗癌疏水藥物和金納米粒子刺激響應(yīng)型膠束系統(tǒng)，可以將胞內(nèi)藥物的快速釋放和CT可視化成像兩種手段結(jié)合起來。在正常生理環(huán)境中，膠束體系保持良好的穩(wěn)定性，藥物釋放緩慢，而在腫瘤細(xì)胞內(nèi)部的高GSH濃度條件下，藥物得到快速釋放。同時(shí)，膠束負(fù)載的金納米粒子用于CT成像，從而極大的實(shí)現(xiàn)膠束藥物載體在腫瘤化療過程中的靶向性和高效性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，明顯提高載藥膠束用于腫瘤化療的高效性和靶向性，本發(fā)明的首要目的在于提供一種主鏈中含有二硫鍵節(jié)點(diǎn)的兩親性線性可降解雙響應(yīng)聚合物，具體為聚己內(nèi)酯-SS-聚甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯。

本發(fā)明另一目的在于提供上述可降解雙響應(yīng)聚合物的制備方法。本發(fā)明方法先利用小分子引發(fā)劑2-羥乙基-2’-(異丁酰溴)乙基二硫醚(HO-SS-iBuBr)引發(fā)己內(nèi)酯開環(huán)聚合物得到大分子引發(fā)劑PCL-SS-iBuBr，然后利用大分子引發(fā)劑PCL-SS-iBuBr引發(fā)甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯(DMAEMA)進(jìn)行電子轉(zhuǎn)移活化再生原子轉(zhuǎn)移自由基聚合反應(yīng)(ARGET ATRP)，得到親疏水嵌段之間含有二硫鍵節(jié)點(diǎn)的兩親性線性可降解雙響應(yīng)聚合物，聚己內(nèi)酯-SS-聚甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯，即PCL-SS-PDMAEMA。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種基于上述可降解雙響應(yīng)聚合物的聚合物膠束系統(tǒng)。兩親性嵌段聚合物溶于有機(jī)溶劑中可制備得到內(nèi)核嵌段疏水，外殼嵌段親水，親疏水嵌段之間含有二硫鍵節(jié)點(diǎn)的聚合物膠束系統(tǒng)。

本發(fā)明再一目的在于提供一種基于上述可降解雙響應(yīng)聚合物的負(fù)載金納米粒子的膠束系統(tǒng)。

本發(fā)明再一目的在于提供上述負(fù)載金納米粒子的膠束系統(tǒng)在CT成像和藥物遞釋領(lǐng)域中的應(yīng)用。氯金酸(HAuCl₄)加入到聚合物膠束溶液中后，膠束中的親水嵌段PDMAEMA可以原位還原AuCl₄^-生成金納米粒子，并能很好的穩(wěn)定金納米粒子顆粒。這種聚合物膠束載金系統(tǒng)可以用于CT成像，以實(shí)現(xiàn)化療過程的可視化，極大的提高了聚合物膠束藥物遞釋系統(tǒng)的靶向性。

本發(fā)明的再一目的在于提供上述負(fù)載金納米粒子的膠束系統(tǒng)在負(fù)載水難溶性藥物方面的應(yīng)用，尤其是對(duì)水難溶性抗腫瘤藥物，如阿霉素的負(fù)載。在正常生理環(huán)境中，膠束結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定，內(nèi)核藥物釋放緩慢；在載藥膠束系統(tǒng)到達(dá)腫瘤細(xì)胞內(nèi)部后，膠束親疏水嵌段間的二硫鍵節(jié)點(diǎn)在胞內(nèi)較高濃度的GSH作用下斷裂，膠束親水外殼從疏水內(nèi)核上脫落，進(jìn)而導(dǎo)致了膠束結(jié)構(gòu)失穩(wěn)解體，藥物釋放明顯加快。這種還原響應(yīng)降解的聚合物膠束納米藥物載體可以顯著的增強(qiáng)聚合物膠束系統(tǒng)在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的藥物釋放速率，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)高效的腫瘤藥物化療效率。

本發(fā)明的目的通過下述方案實(shí)現(xiàn)：

一種主鏈中含有二硫鍵節(jié)點(diǎn)的兩親性線性可降解雙響應(yīng)聚合物，具體為聚己內(nèi)酯-SS-聚甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯，將其命名為PCL-SS-PDMAEMA，具體如下式(一)所示結(jié)構(gòu)：

其中，x＝40～60，y＝40～70。

優(yōu)選的，本發(fā)明中的兩親性嵌段聚合物的數(shù)均分子量為11082～22008g/mol。

本發(fā)明提供一種上述兩親性嵌段聚合物的制備方法，包括以下兩個(gè)步驟：

(1)制備聚己內(nèi)酯ATRP大分子引發(fā)劑PCL-SS-iBuBr：將小分子引發(fā)劑HO-SS-iBuBr、ε-己內(nèi)酯(ε-CL)和催化劑混合，加熱反應(yīng)，得到大分子引發(fā)劑PCL-SS-iBuBr。

(2)制備兩親性嵌段聚合物PCL-SS-PDMAEMA：將步驟(1)制備的大分子引發(fā)劑PCL-SS-iBuBr，甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯(DMAEMA)、配體1,1,4,7,10,10-六甲基三乙烯四胺(HMTETA)和催化劑加入到溶劑中，攪拌均勻，加入還原劑，加熱反應(yīng)，得到兩親性嵌段聚合物PCL-SS-PDMAEMA。

所述步驟(1)中反應(yīng)物摩爾份數(shù)的配方如下：

HO-SS-iBuBr 1份；ε-CL 40～60份；

所述步驟(2)中反應(yīng)物摩爾份數(shù)的配方如下：

大分子引發(fā)劑PCL-SS-iBuBr 1份；DMAEMA 40～70份；HMTETA 1～2份。

步驟(1)中所述的加熱反應(yīng)優(yōu)選指加熱到110～135℃反應(yīng)24～48h。

步驟(1)中所述的催化劑采用本領(lǐng)域常用的催化劑即可，如為Sn(Oct)₂，其用量為催化量即可，優(yōu)選為0.02～0.12摩爾份。

步驟(2)中所述的加熱反應(yīng)優(yōu)選指加熱到60～90℃反應(yīng)8～16h。

步驟(2)中所述的溶劑為本領(lǐng)域常用的溶劑，如甲苯。

步驟(2)中所述的催化劑為本領(lǐng)域常用的催化劑，如CuBr₂，用量為催化量即可，優(yōu)選為0.1～0.2摩爾份。

所述的還原劑為本領(lǐng)域常用的還原劑，如Sn(Oct)₂，用量?jī)?yōu)選為1～2摩爾份。

優(yōu)選的，步驟(1)反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)體系稀釋、沉淀并干燥，得到純化后的產(chǎn)物。所述的稀釋指將反應(yīng)后的溶液旋蒸濃縮，再用四氫呋喃稀釋；沉淀指的是將上述的四氫呋喃溶液加入到10倍的0℃混合溶劑甲醇/水(體積比1/1)沉淀；干燥指的是將沉淀出的產(chǎn)物至于40℃的真空干燥箱中真空干燥24h。

優(yōu)選的，步驟(2)反應(yīng)完成后，將反應(yīng)溶液冷卻、稀釋、沉淀、干燥，最后得到純化后的產(chǎn)物。所述的冷卻和稀釋指的是將反應(yīng)后的溶液冷卻后用四氫呋喃稀釋，至于空氣中過夜，然后將溶液通過氧化鋁出去催化劑；沉淀指的是將將旋蒸后的濃縮液滴入到0℃的乙醚中；干燥指的是將沉淀出的產(chǎn)物至于40℃的真空干燥箱中真空干燥24h。

優(yōu)選地，所述的步驟(1)和步驟(2)均在惰性氣體氬氣的保護(hù)和無水條件下進(jìn)行。

本發(fā)明提供了一種基于上述兩親性嵌段聚合物的聚合物膠束系統(tǒng)。

上述基于本發(fā)明兩親性嵌段聚合物的聚合物膠束系統(tǒng)，通過包括以下步驟方法制備得到：將本發(fā)明的兩親性嵌段聚合物PCL-SS-PDMAEMA溶于溶劑中，用去離子水透析，優(yōu)選為24h，得到兩親性嵌段聚合物膠束體系。

優(yōu)選的，上述溶劑指的是本領(lǐng)域最為常見的溶劑，如DMSO。

本發(fā)明還提供了一種基于上述可降解雙響應(yīng)聚合物的負(fù)載金納米粒子的膠束系統(tǒng)，其通過包括以下步驟方法制備得到：將上述可降解雙響應(yīng)聚合物溶于溶劑中，透析，優(yōu)選為24h，再加入氯金酸(HAuCl₄)，室溫下避光攪拌，優(yōu)選48h，得到負(fù)載金納米粒子的膠束體系。

本發(fā)明還提供上述負(fù)載金納米粒子的膠束系統(tǒng)在CT成像和藥物遞釋領(lǐng)域中的應(yīng)用。氯金酸(HAuCl₄)加入到聚合物膠束溶液中后，膠束中的親水嵌段PDMAEMA可以原位還原AuCl₄^-生成金納米粒子，并能很好的穩(wěn)定金納米粒子顆粒。這種聚合物膠束載金系統(tǒng)可以用于CT成像，以實(shí)現(xiàn)化療過程的可視化，極大的提高了聚合物膠束藥物遞釋系統(tǒng)的靶向性。

本發(fā)明還提供上述負(fù)載金納米粒子的膠束系統(tǒng)在負(fù)載水難溶性藥物方面的應(yīng)用，具體包括以下步驟：

將上述負(fù)載金納米粒子的膠束系統(tǒng)冷凍干燥后，再和水難溶性藥物溶解于溶劑中，室溫?cái)嚢?，?yōu)選為12h，透析，優(yōu)選用去離子水透析24h，得到包載水難溶性藥物的聚合物膠束體系。

優(yōu)選的，上述的冷凍干燥指的是-50℃，0.06mbar條件下將聚合物膠束系統(tǒng)的溶液凍干。

優(yōu)選的，上述的水難溶性藥物可為常見的抗癌藥物阿霉素。

優(yōu)選的，上述的溶劑指的是本領(lǐng)域常用的有機(jī)溶劑，如DMSO。

上述的包載水難溶性藥物和金納米粒子的聚合物膠束體系可以在正常生理環(huán)境中保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，有效包載水難溶性藥物，并且防止金納米顆粒的團(tuán)聚；而在腫瘤細(xì)胞內(nèi)部的強(qiáng)還原性環(huán)境中(10mM GSH)，則能快速實(shí)現(xiàn)膠束的降解，實(shí)現(xiàn)包載水難溶性藥物的快速可控釋放。另外，負(fù)載的金納米顆粒用于CT成像，使得腫瘤組織化療過程的可視化。

本發(fā)明的機(jī)理為：

本發(fā)明首先利用雙官能團(tuán)小分子引發(fā)劑HO-SS-iBuBr引發(fā)己內(nèi)酯單體(ε-CL)發(fā)生開環(huán)聚合，得到大分子引發(fā)劑PCL-SS-iBuBr，然后對(duì)親水性單體甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯(DMAEMA)進(jìn)行自由基聚合物，得到主鏈中含有二硫鍵節(jié)點(diǎn)的兩親性嵌段聚合物PCL-SS-PDMAEMA。將此兩親性嵌段聚合物溶于溶劑中得到兩親性嵌段聚合物膠束系統(tǒng)。向上述兩親性嵌段聚合物膠束系統(tǒng)中加入氯金酸，利用親水嵌段PDMAEMA的還原性原位還原氯金酸得到粒徑分布均勻的金納米顆粒，并且PDMAEMA可以穩(wěn)定得到的金納米顆粒使其具有良好的穩(wěn)定性而不發(fā)生團(tuán)聚；最終得到了負(fù)載金納米顆粒的聚合物膠束體系。將此負(fù)載金納米顆粒的膠束體系凍干后，和水難溶性抗癌藥物阿霉素溶解于溶劑中，得到了內(nèi)核組成為疏水嵌段PCL，外殼組成為親水嵌段PDMAEMA的兩親性聚合物膠束，膠束內(nèi)核PCL可以對(duì)水難溶性藥物阿霉素進(jìn)行有效的負(fù)載，外殼PDMAEMA穩(wěn)定金納米顆粒，最終得到內(nèi)核負(fù)載阿霉素外殼負(fù)載金納米顆粒的聚合物載藥載金膠束體系。膠束主鏈結(jié)構(gòu)上的二硫鍵節(jié)點(diǎn)則提供了可還原響應(yīng)斷裂的位點(diǎn)，以智能響應(yīng)腫瘤細(xì)胞內(nèi)部的刺激而降解。這種膠束體系在正常生理環(huán)境中保持良好的穩(wěn)定性，而在進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)部后，則在前還原性(10mM GSH)環(huán)境中，膠束結(jié)構(gòu)上的二硫鍵斷裂，進(jìn)而引起膠束結(jié)構(gòu)的解體，抗癌藥物阿霉素得到快速釋放，同時(shí)負(fù)載的金納米顆粒用于CT成像，將腫瘤化療過程可視化，為抗腫瘤化療過程中藥物遞釋的高效性和化療過程的可視化提供了有價(jià)值的制備方法和技術(shù)，最終提高了腫瘤藥物化療的效率和靶向性。

本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有的技術(shù)，具有以下優(yōu)點(diǎn)和有益的效果：

(1)本發(fā)明制備方法簡(jiǎn)單，技術(shù)操作可行，制備條件溫和，而且嵌段聚合物各嵌段分子量便于調(diào)控，以利于制備負(fù)載水難溶性藥物和金納米粒子膠束體系，滿足膠束藥物遞釋系統(tǒng)的診療一體化要求。

(2)本發(fā)明制備的兩親性可降解聚合物膠束系統(tǒng)，具有較高的藥物和金納米粒子包載能力。

(3)本發(fā)明制備得到的兩親性可降解聚合物載藥載金聚合物膠束系統(tǒng)，可以實(shí)現(xiàn)在不同的生理環(huán)境中藥物的可控及快速釋放，并且利用CT成像使得藥物化療過程可視化，可以顯著的提高藥物遞釋效率和靶向性，為診療一體化藥物遞釋系統(tǒng)提供了有參考價(jià)值的方法。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1中主鏈含有二硫鍵的大分子引發(fā)劑PCL-SS-iBuBr的核磁氫譜。

圖2為實(shí)施例1中主鏈含有二硫鍵的大分子引發(fā)劑PCL-SS-iBuBr的GPC洗脫曲線。

圖3為實(shí)施例4中兩親性嵌段聚合物PCL-SS-PDMAEMA的核磁氫譜。

圖4為實(shí)施例4中兩親性嵌段聚合物PCL-SS-PDMAEMA的GPC洗脫曲線。

圖5為實(shí)施例7中兩親性嵌段聚合物膠束的DLS圖。

圖6為實(shí)施例7中兩親性嵌段聚合物膠束的TEM圖。

圖7為實(shí)施例8中載金聚合物膠束的DLS圖。

圖8為實(shí)施例8中載金聚合物膠束的TEM圖。

圖9為實(shí)施例8中載金聚合物膠束的UV-vis譜圖。

圖10為實(shí)施例8中載金聚合物膠束的XRD譜圖。

圖11為實(shí)施例9中載藥/載金聚合物膠束的DLS圖。

圖12為實(shí)施例9中載藥/載金聚合物膠束的載藥量和包封率圖。

圖13為實(shí)施例10中載藥/載金聚合物膠束的在不同pH和GSH濃度條件下粒徑分布圖。

圖14為實(shí)施例11中載藥/載金聚合物膠束的在不同pH和GSH濃度條件下藥物釋放曲線。

圖15為實(shí)施例12載金聚合物膠束的細(xì)胞毒性效果圖。

圖16為實(shí)施例12中載藥/載金聚合物膠束的細(xì)胞毒性效果圖。

圖17為實(shí)施例13中載藥/載金聚合物膠束X-射線衍射效果圖。

圖18為實(shí)施例14中載藥/載金聚合物膠束體外細(xì)胞CT成像效果圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

下列實(shí)施例中使用的試劑均可從商業(yè)渠道獲得。

實(shí)施例1：大分子引發(fā)劑PCL-SS-iBuBr制備(x＝40)

將含有攪拌子的100mL干燥反應(yīng)瓶用酒精燈烘烤5min，再將引發(fā)劑HO-SS-iBuBr(304mg，1mmol)加入反應(yīng)瓶中，滴加入Sn(Oct)₂(16.2mg，0.04mmol)。密封后抽真空-通氬氣3次，在氬氣保護(hù)下加入單體ε-CL(4.56g，40mmol)，用液氮進(jìn)行三次冷凍-抽氣-升溫循環(huán)后，在氬氣保護(hù)下置于135℃油浴中加熱反應(yīng)48h后，用液氮冷卻終止反應(yīng)，并且用50mL THF溶解后，加入到冷甲醇/水(1:1)(加攪拌子攪拌)沉淀，抽濾得到固體，40℃真空干燥12h。合成反應(yīng)式見公式(1)。利用核磁和GPC對(duì)分子結(jié)構(gòu)和組成進(jìn)行分析，結(jié)果見圖1和圖2，M_n＝4794g/mol，M_w/M_n＝1.47。

實(shí)施例2：大分子引發(fā)劑PCL-SS-iBuBr制備(x＝50)

將含有攪拌子的100mL干燥反應(yīng)瓶用酒精燈烘烤5min，再將引發(fā)劑HO-SS-iBuBr(304mg，1mmol)加入反應(yīng)瓶中，滴加入Sn(Oct)₂(48.6mg，0.12mmol)。密封后抽真空-通氬氣3次，在氬氣保護(hù)下加入單體ε-CL(5.7g，50mmol)，用液氮進(jìn)行三次冷凍-抽氣-升溫循環(huán)后，在氬氣保護(hù)下置于110℃油浴中加熱反應(yīng)36h后，用液氮冷卻終止反應(yīng)，并且用40mL THF溶解后，加入到冷甲醇/水(1:1)(加攪拌子攪拌)沉淀，抽濾得到固體，40℃真空干燥24h。M_n＝5934g/mol，M_w/M_n＝1.40。

實(shí)施例3：大分子引發(fā)劑PCL-SS-iBuBr制備(x＝60)

將含有攪拌子的50mL干燥反應(yīng)瓶用酒精燈烘烤5min，再將引發(fā)劑HO-SS-iBuBr(304mg，1mmol)加入反應(yīng)瓶中，滴加入Sn(Oct)₂(8.1mg，0.02mmol)。密封后抽真空-通氬氣3次，在氬氣保護(hù)下加入單體ε-CL(6.84g，60mmol)，用液氮進(jìn)行三次冷凍-抽氣-升溫循環(huán)后，在氬氣保護(hù)下置于120℃油浴中加熱反應(yīng)24h后，用液氮冷卻終止反應(yīng)，并且用60mL THF溶解后，加入到冷甲醇/水(1:1)(加攪拌子攪拌)沉淀，抽濾得到固體，40℃真空干燥24h。M_n＝7074g/mol，M_w/M_n＝1.37。

實(shí)施例4：兩親性嵌段聚合物PCL-SS-PDMAEMA制備(x:y＝40:40)

裝有攪拌子的50mL茄形瓶，取PCL-SS-iBuBr(4794g/mol，0.95g，0.2mmol)，CuBr₂(9mg，0.04mmol)于茄形瓶中，密封反應(yīng)瓶，抽真空-通氮?dú)馊?，然后依次將單體DMAEMA(1.26g，8mmol)、無水甲苯、配體HMTETA(110μL，0.4mmol)加入反應(yīng)瓶中，攪拌10min使得催化劑配合物Cu/HMTETA形成。隨后將還原劑Sn(Oct)₂(130μL，0.4mmol)溶于甲苯中加入反應(yīng)瓶中，10min后，轉(zhuǎn)入90℃油浴反應(yīng)，反應(yīng)16h后冷卻至室溫，然后將反應(yīng)溶液暴露于空氣中，加入40mL THF并攪拌溶解，然后過中性氧化鋁柱子出去氧化劑。得到的反應(yīng)液濃縮，冷乙醚中沉淀三次，40℃、35mbar下真空干燥24h。合成反應(yīng)式見公式(2)。利用核磁和GPC對(duì)分子結(jié)構(gòu)和組成進(jìn)行分析，結(jié)果見圖3和圖4，M_n＝11082g/mol，M_w/M_n＝1.45。

實(shí)施例5：兩親性嵌段聚合物PCL-SS-PDMAEMA制備(x:y＝50:60)

裝有攪拌子的50mL茄形瓶，取PCL-SS-iBuBr(5934g/mol，1.2g，0.2mmol)，CuBr₂(4.5mg，0.02mmol)于茄形瓶中，密封反應(yīng)瓶，抽真空-通氮?dú)馊?，然后依次將單體DMAEMA(1.89g，12mmol)、無水甲苯、配體HMTETA(55μL，0.2mmol)加入反應(yīng)瓶中，攪拌10min使得催化劑配合物Cu/HMTETA形成。隨后將還原劑Sn(Oct)₂(65μL，0.2mmol)溶于甲苯中加入反應(yīng)瓶中，10min后，轉(zhuǎn)入60℃油浴反應(yīng)，反應(yīng)8h后冷卻至室溫，然后將反應(yīng)溶液暴露于空氣中，加入40mL THF并攪拌溶解，然后過中性氧化鋁柱子出去氧化劑。得到的反應(yīng)液濃縮，冷乙醚中沉淀三次，40℃、35mbar下真空干燥12h。M_n＝15366g/mol，M_w/M_n＝1.57。

實(shí)施例6：兩親性嵌段聚合物PCL-SS-PDMAEMA制備(x:y＝60:70)

裝有攪拌子的50mL茄形瓶，取PCL-SS-iBuBr(7074g/mol，1.4g，0.2mmol)，CuBr₂(6.75mg，0.03mmol)于茄形瓶中，密封反應(yīng)瓶，抽真空-通氮?dú)馊?，然后依次將單體DMAEMA(2.2g，14mmol)、無水甲苯、配體HMTETA(82.5μL，0.3mmol)加入反應(yīng)瓶中，攪拌10min使得催化劑配合物Cu/HMTETA形成。隨后將還原劑Sn(Oct)₂(97.5μL，0.3mmol)溶于甲苯中加入反應(yīng)瓶中，10min后，轉(zhuǎn)入80℃油浴反應(yīng)，反應(yīng)12h后冷卻至室溫，然后將反應(yīng)溶液暴露于空氣中，加入50mL THF并攪拌溶解，然后過中性氧化鋁柱子出去氧化劑。得到的反應(yīng)液濃縮，冷乙醚中沉淀三次，40℃、35mbar下真空干燥12h。M_n＝22008g/mol，M_w/M_n＝1.33。

實(shí)施例7：兩親性嵌段聚合物膠束的制備

采用透析法制備PCL-SS-PDMAEMA嵌段聚合物膠束。將兩親性嵌段聚合物溶于DMSO中攪拌6h后，轉(zhuǎn)入透析(M_w＝3500Da)中用去離子水透析24h，每2h換一次水，最后通過0.45μm濾膜過濾后凍干。

圖5和圖6分別為聚合物膠束的DLS和TEM圖，聚合物膠束粒徑分布在149nm左右，TEM圖顯示了粒徑分布均勻，約為90nm左右。

實(shí)施例8：載金聚合物膠束的制備

室溫下，將HAuCl₄滴入到實(shí)施例7中得到的聚合物膠束溶液中，避光攪拌48h，待反應(yīng)結(jié)束后通過0.45μm濾膜過濾后凍干。

圖7為載金聚合物膠束的DLS圖，聚合物膠束粒徑分布在166nm左右，圖8為載金聚合物膠束的TEM圖，顯示了納米金顆粒的分布較為均勻(約為9nm左右)，由于聚合物膠束的組成元素為C、H、O等序數(shù)較低原子，相對(duì)于Ag的反射信號(hào)非常弱，因此，載金聚合物膠束的TEM圖中只能看到金納米顆粒的輪廓而看不到膠束的形貌。圖9為載金聚合物膠束溶液的UV-vis譜圖，可以看出溶液在528nm處存在最大吸收峰，這是因?yàn)榍蛐谓鸺{米顆粒特有的等離子共振吸收峰，說明了金納米顆粒成功的通過原位還原法制備得到。圖10為載金聚合物膠束的XRD表征譜圖，在38.5°、44.8°、64.2°和78.0°四處分別對(duì)應(yīng)著金標(biāo)準(zhǔn)衍射圖中的(111)、(200)、(220)和(311)四個(gè)晶面，這也從另一個(gè)方面證明了GNPs的成功合成。

實(shí)施例9：載藥/載金兩親性聚合物膠束的制備

將載金聚合物膠束和水難溶性藥物阿霉素溶于同一溶劑DMSO，攪拌4h后轉(zhuǎn)入透析袋(M_w＝3500Da)中，然后用去離子水(pH7.4)透析12h，每2h換一次水，最后通過0.45μm濾膜過濾后凍干，最終得到載藥/載金聚合物膠束。

圖11為載藥/載金聚合物膠束的DLS圖，膠束粒徑分布較為均勻，約為192nm，說明負(fù)載藥物和納米金顆粒后，膠束依然有良好的形態(tài)分布。圖12為不同藥物投料比例下膠束的載藥量和包封率，從圖中可以看出，膠束載藥量隨著投料比例的增大而增大，而藥物包封率則在投料比例為1/3時(shí)具有最大的藥物包封率，約為48.4％。

實(shí)施例10：載藥/載金聚合物膠束的穩(wěn)定性測(cè)試

取2mL實(shí)施例9中制備的載藥/載金聚合物膠束溶液(1mg/mL)，室溫下，分別將溶液調(diào)至不同的環(huán)境：(1)pH 7.4，(2)pH 5.0，(3)pH 7.4，10mM GSH，(4)pH 5.0，10mM GSH，用DLS測(cè)試12h后膠束的粒徑分布變化。

圖13為在不同pH及GSH濃度環(huán)境中的粒徑分布。如圖所示，在正常生理環(huán)境中(pH 7.4)，膠束粒徑并未發(fā)生明顯變化，而在pH 5.0環(huán)境中，膠束粒徑增大，平均粒徑達(dá)到254nm，這可能是因?yàn)槿跛嵝詶l件下膠束外殼PDMAEMA質(zhì)子化導(dǎo)致膠束的溶脹，進(jìn)而粒徑增大。當(dāng)10mM還原劑GSH存在時(shí)，聚合物膠束發(fā)生了明顯的聚集，粒徑高達(dá)1000nm，這說明了細(xì)胞內(nèi)部的高濃度的GSH可以引起膠束結(jié)構(gòu)的失穩(wěn)降解。這有利于膠束內(nèi)核藥物的快速釋放，實(shí)現(xiàn)短時(shí)間內(nèi)高濃度藥物累積進(jìn)而克服腫瘤細(xì)胞的抗藥性，達(dá)到較好的腫瘤治療效果。

實(shí)施例11：載藥/載金聚合物膠束體外藥物釋放實(shí)驗(yàn)

兩親性嵌段聚合物載藥/載金膠束在不同環(huán)境中的釋放實(shí)驗(yàn)通過藥物溶出儀測(cè)試完成。具體步驟如下：分別取3份3mg實(shí)施例9中制備的兩親性嵌段聚合物載藥/載金膠束分散于3mL PBS(pH 7.4)、醋酸緩沖液(pH 5.0)、醋酸緩沖液(pH 5.0，10mM GSH)中，并轉(zhuǎn)入透析袋中，置于47mL對(duì)應(yīng)的緩沖液中后，放入藥物溶出儀中，在37℃，100rpm轉(zhuǎn)速下進(jìn)行體外釋放，定時(shí)取樣4mL溶液測(cè)試其吸光度，同時(shí)補(bǔ)充4mL新鮮緩沖液。利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)所取溶液中的阿霉素濃度，繪制阿霉素的體外釋放曲線。

圖14為不同環(huán)境中的36h藥物體外釋放曲線。從圖中可以看出，在正常的生理環(huán)境中(pH 7.4)，藥物釋放非常緩慢，前12h只釋放了22.1％的DOX，36h的累積DOX釋放量?jī)H為29.9％。這也從側(cè)面說明了負(fù)載藥物需要克服同疏水內(nèi)核間的疏水-疏水作用才能順利釋放出來。當(dāng)pH降低至pH 5.0時(shí)，膠束外殼PDMAEMA側(cè)鏈的叔氨基幾乎全部質(zhì)子化，引起了膠束較大程度的溶脹，疏松的結(jié)構(gòu)引起了DOX的釋放加速。這種條件下，12h后的DOX累積釋放量相對(duì)于pH 7.4的增加了30％，36h增加了43％。在模擬的腫瘤細(xì)胞內(nèi)部弱酸和強(qiáng)還原性的微環(huán)境中(pH 5.0，10mM GSH)，DOX幾乎呈線性速度快速釋放，12h的DOX累積釋放量高達(dá)78.8％，并在36h后達(dá)到了96％。這說明腫瘤細(xì)胞內(nèi)高濃度的GSH破壞了膠束間親疏水鏈段間的二硫鍵節(jié)點(diǎn)，PDMAEMA從疏水內(nèi)核PCL上脫離，造成膠束解體，極大的促進(jìn)了DOX的釋放。

實(shí)施例12：細(xì)胞毒性測(cè)試

以1×10⁴細(xì)胞/孔的細(xì)胞濃度將100μL HepG2肝癌細(xì)胞培養(yǎng)基接種于96孔板中，放置于37℃中，飽和濕度并且含有5％CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。再將載金聚合物膠束(實(shí)施例8產(chǎn)物)、載藥/載金聚合物膠束(實(shí)施例9產(chǎn)物)和游離阿霉素用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋成不同的濃度，加入孔板中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。加入新鮮培養(yǎng)基一組作為對(duì)照組。培養(yǎng)48h后，用PBS沖洗細(xì)胞，然后分別加入MTT并置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h。培養(yǎng)結(jié)束后再次用PBS溶液沖洗細(xì)胞，然后每個(gè)孔中加入DMSO，搖床振蕩15min后利用酶標(biāo)儀測(cè)定57nm處每個(gè)孔的吸光度OD570。細(xì)胞活性計(jì)算公式如下：

Cell viability(％)＝(OD_test/OD_control)×100％

圖15是載金聚合物膠束的細(xì)胞毒性測(cè)試結(jié)果，如圖所示，載金聚合物膠束材料細(xì)胞毒性較低。在較高濃度時(shí)，細(xì)胞依然具有高于80％的活性，這說明了載金聚合物膠束具有良好的生物相容性。圖16是載藥/載金聚合物膠束的細(xì)胞毒性測(cè)試結(jié)果。經(jīng)過48h的培養(yǎng)后，載藥/載金聚合物膠束有著明顯的細(xì)胞毒性，在較低的濃度(0.01μg/mL)時(shí)就對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖有著顯著的抑制作用，并且隨著濃度的增大，載藥/載金聚合物膠束對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性隨之增強(qiáng)，這說明了實(shí)施例9中制備的載藥/載金聚合物膠束具有優(yōu)良的抗癌活性。

實(shí)施例13：載藥/載金聚合物膠束的X-射線衍射實(shí)驗(yàn)

載藥載金聚合物膠束的X-射線衍射性能測(cè)試步驟如下：取實(shí)施例9中制備得到的載藥/載金聚合物膠束溶于PBS緩沖液中，配置成不同金納米粒子濃度的溶液，0.01M、0.02M、0.03M、0.06M、0.08M和0.10M各200μL。納米金溶液于離心管(1.5mL)掃描，測(cè)量各濃度下的CT信號(hào)值。另外，各金溶液以相同碘濃度的非離子型造影劑歐乃派克(Omnipaque)溶液作為對(duì)照。

圖17為載藥/載金聚合物膠束的X-射線吸收性效果圖，測(cè)試中HU值表明了X射線穿過物質(zhì)被吸收后的衰減值，反映了組織的密度，HU值大小也代表了測(cè)試材料的CT成像效果。從圖中可以看出，X-射線衰減性能(HU值)隨著金濃度的增大而逐漸升高，呈線性關(guān)系，并且亮度逐漸增強(qiáng)。相比于傳統(tǒng)造影劑歐乃派克，實(shí)施例9中制備得到的載藥/載金聚合物膠束的X-射線衰減性能更強(qiáng)，這有利于其作為良好的CT造影劑并在腫瘤組織處成像的應(yīng)用。

實(shí)施例14：載藥/載金聚合物膠束的體外細(xì)胞CT成像

將一系列金濃度為0μM、50μM、100μM、200μM、300μM、500μM的載藥/載金聚合物膠束溶液250μL。將HepG2細(xì)胞接種于六孔板中，每孔2×10⁶個(gè)。培養(yǎng)過夜后除去培養(yǎng)基，加入新鮮培養(yǎng)基3mL和上述復(fù)合膠束溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h。除去培養(yǎng)基，PBS潤(rùn)洗，胰蛋白酶消化，2min后加入DMEM終止消化，離心，除去上層液，再分散于0.2mL PBS溶液中，轉(zhuǎn)入離心管(1.5mL)中，然后CT掃描測(cè)試各濃度處理的細(xì)胞溶液的X-射線吸收值的高低和成像效果。

圖18為載藥/載金聚合物膠束的體外細(xì)胞CT成像效果圖，CT值隨著金濃度的增大而升高，并且比歐乃派克的HU值高，這說明了載藥/載金聚合物膠束的造影效果較好，是一種潛在的CT成像造影劑。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。