本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及一種重組蛋白及藥物組合物與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：子宮頸癌是一種嚴(yán)重危害女性健康的惡性腫瘤，發(fā)病率在女性惡性腫瘤中排名第二，僅次于乳腺癌。全世界約26.45億的女性(大于15歲)面臨宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)，每年53萬(wàn)例宮頸癌新發(fā)病例，占所有女性腫瘤的12％，死亡病例達(dá)26.5萬(wàn)例。中國(guó)約有5.52億大于15歲的女性面臨發(fā)展為宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)，最新統(tǒng)計(jì)顯示，中國(guó)每年有61691名女性診斷為宮頸癌，其中29526名死亡，感染HPV16/18型的病例中，只有3.8％在一定時(shí)間顯示正常的細(xì)胞學(xué)特點(diǎn)，76.1％發(fā)展為侵潤(rùn)性宮頸癌。已知子宮頸癌主要由人乳頭瘤病毒(HPV)感染引起。70％以上HPV陽(yáng)性的宮頸癌病變中存在HPV基因組的整合，其中以HPV16型和HPVl8型為主，其中約60％的宮頸癌與HPV16感染相關(guān)，約10％的宮頸癌與HPV18相關(guān)。對(duì)HPV的致癌機(jī)理研究顯示：E6和E7基因是致癌型HPV的主要轉(zhuǎn)化基因,兩者共同具有鋅指結(jié)構(gòu)域的特征(zinc-bindingstructures)。HPVE6、E7蛋白分別可以與抑癌蛋白p53和pRb相結(jié)合，引起p53降解與pRb功能性滅活,這是HPVE6、E7癌蛋白干擾細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控功能的主要機(jī)制，能導(dǎo)致上皮細(xì)胞永生化，細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖失控，細(xì)胞凋亡異常。因此，在HPV中E6和E7蛋白對(duì)宮頸癌的發(fā)病起主要作用，從而成為制備用于治療和預(yù)防宮頸癌疫苗的主要靶抗原。宮頸癌的傳統(tǒng)治療方法如手術(shù)、放療、化療等只對(duì)早期患者有一定的療效，且治療創(chuàng)傷大，不能防止HPV再度感染。研究顯示，對(duì)于由病毒引起的腫瘤和傳染性疾病，免疫療法是一種有效的方法。重組蛋白疫苗純度高安全性好，但其免疫原性低，蛋白更傾向于刺激體液免疫，不能誘導(dǎo)強(qiáng)的細(xì)胞免疫。研究還表明，單獨(dú)使用原核表達(dá)的HPVE6或E7蛋白作為治療性疫苗有一定的防治效果，但使用野生型的E6或E7蛋白作為治療藥物，由于其治療效果不顯著而無(wú)應(yīng)用價(jià)值，且由于是未經(jīng)改造的野生型癌基因產(chǎn)物，具有腫瘤轉(zhuǎn)化活性，安全性受到人們的質(zhì)疑。含有E6和E7基因的病毒，或以質(zhì)粒為載體的DNA疫苗，由于可能整合到細(xì)胞基因組中，也存在安全性問(wèn)題。用合成的多肽作為疫苗，其免疫原性低且受MHC限制，使用范圍有限。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種重組蛋白及藥物組合物以應(yīng)用，以有效解決現(xiàn)在技術(shù)中重組蛋白疫苗免疫免疫原性低、不能誘導(dǎo)強(qiáng)的細(xì)胞免疫以及安全性問(wèn)題等技術(shù)缺陷。為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：一種重組蛋白，包括人乳頭瘤病毒E6和E7變形體的融合多肽；所述人乳頭瘤病毒為16型和/或18型。優(yōu)選的，所述人乳頭瘤病毒16型E6和E7變形體的融合多肽的氨基酸序列排列依次為HPV16型E6蛋白N端第1-83位氨基酸序列、HPV16型E7蛋白N端的第1-62位氨基酸序列、HPV16型E6蛋白C端的第69-151位氨基酸序列、HPV16型E7蛋白C端的第48-98位氨基酸序列，其中HPV16型E6的突變位點(diǎn)為F47R、L50G、C63G、C106R；HPV16E7的突變位點(diǎn)為Y23G、C24G、Y25G、C58G、C91G；優(yōu)選的，所述人乳頭瘤病毒18型E6和E7變形體的融合多肽的氨基酸序列排列依次為HPV18型E6蛋白N端第1-86位氨基酸序列、HPV18型E7蛋白N端的第1-67位氨基酸序列、HPV18型E6蛋白C端的第72-158位氨基酸序列、HPV18型E7蛋白C端的第53-105位氨基酸序列，其中HPV18型E6的突變位點(diǎn)為F49R、L52G、C65G、C108G；HPV18E7的突變位點(diǎn)為L(zhǎng)26G、C27G、H28G、C65G、C98G。進(jìn)一步的，在一些實(shí)施方案中，所述人乳頭瘤病毒16型E6和E7變形體的融合多肽的氨基酸序列具有如SEQIDNO.1所示氨基酸序列；或SEQIDNO.1所示氨基酸序列經(jīng)修飾、取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，且與SEQIDNO.1所示氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述人乳頭瘤病毒18型E6和E7變形體的融合多肽的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示氨基酸序列；或SEQIDNO.2所示氨基酸序列經(jīng)修飾、取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，且與SEQIDNO.2所示氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列。優(yōu)選的，所述重組蛋白還包括免疫刺激分子。其中，所述免疫刺激分子為fms樣酪氨酸激酶3配體、TNF-ɑ、IL-2、趨化因子巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-1ɑ和CD40配體、鈣網(wǎng)蛋白N端、熱休克蛋白、泛素中的至少一種。優(yōu)選的，所述免疫刺激分子為鈣網(wǎng)蛋白N端或fms樣酪氨酸激酶3配體。進(jìn)一步的，在一些實(shí)施方案中，所述鈣網(wǎng)蛋白N端具有如SEQIDNO.3所示氨基酸序列；或SEQIDNO.3所示氨基酸序列經(jīng)修飾、取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，且與SEQIDNO.3所示氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述fms樣酪氨酸激酶3配體具有如SEQIDNO.4所示氨基酸序列；或SEQIDNO.4所示氨基酸序列經(jīng)修飾、取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，且與SEQIDNO.4所示氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列。優(yōu)選的，所述免疫刺激分子與所述人乳頭瘤病毒E6和E7變形體的融合多肽以連接肽連接。在一些實(shí)施方案中，所述連接肽具有如SEQIDNo.9所示氨基酸序列。本發(fā)明還提供了編碼所述重組蛋白的核苷酸序列。優(yōu)選的，所述SEQIDNO.1所示重組蛋白具有如SEQIDNO.5所示核苷酸序列。優(yōu)選的，所述SEQIDNO.2所示重組蛋白具有如SEQIDNO.6所示核苷酸序列。優(yōu)選的，所述SEQIDNO.3所示鈣網(wǎng)蛋白N端具有如SEQIDNO.7所示核苷酸序列。優(yōu)選的，所述SEQIDNO.4所示fms樣酪氨酸激酶3配體具有如SEQIDNO.8所示核苷酸序列。本發(fā)明還提供了一種重組表達(dá)載體，含有所述核苷酸序列。本發(fā)明還提供了一種工程菌，含有所述重組表達(dá)載體。本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，包括所述的重組蛋白和佐劑。其中，優(yōu)選的，所述佐劑為油/水乳化劑ISA51、TLR3激動(dòng)劑polyI:C、表面活性劑類免疫刺激復(fù)合物ISCOMATRIX、CpG-ODN中的至少一種。進(jìn)一步，在一些實(shí)施方案中，所述藥物組合物還包括可藥用載體。優(yōu)選的，所述可藥用載體包括乳糖、蔗糖、葡萄糖、山梨糖醇、淀粉、阿拉伯膠、藻酸鹽、明膠、磷酸鈣、纖維素、甲基纖維素、微晶纖維素、水、羥基苯甲酸甲酯、滑石粉、硬脂酸鎂、礦物油中的至少一種。本發(fā)明還提供了所述的重組蛋白或/和所述的藥物組合物在制備提高針對(duì)人乳頭瘤病毒的體液免疫和細(xì)胞免疫免疫應(yīng)答的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了所述的重組蛋白或/和所述的藥物組合物在制備治療和/或預(yù)防人乳頭瘤病毒引起疾病的藥物中的應(yīng)用。其中，優(yōu)選的，所述人乳頭瘤病毒引起的疾病為子宮頸癌。由上述技術(shù)方案可知，本發(fā)明提供了一種重組蛋白及藥物組合物與應(yīng)用。本發(fā)明所述重組蛋白包括人乳頭瘤病毒E6和E7變形體的融合多肽具有特異的氨基酸序列，特異的空間結(jié)構(gòu)，因此，具有強(qiáng)免疫原性，尤其是細(xì)胞免疫，且通過(guò)點(diǎn)突變解決了人體安全性問(wèn)題。本發(fā)明所述藥物組合物包括所述重組蛋白和佐劑能激發(fā)和強(qiáng)化針對(duì)人乳頭瘤病毒E6、E7蛋白的特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答，有效的治療宮頸癌，具有良好的應(yīng)用前景。附圖說(shuō)明為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹。圖1示四種融合蛋白結(jié)構(gòu)圖，其中圖A為rm16E6E7蛋白結(jié)構(gòu)圖、圖B為rm18E6E7蛋白結(jié)構(gòu)圖、圖C為NCRT-RM16蛋白結(jié)構(gòu)圖、圖D為Flt3l-RM16蛋白結(jié)構(gòu)圖；圖2示四種融合蛋白純度鑒定圖，其中A圖為rm16E6E7蛋白純度檢測(cè)圖；B圖為rm18E6E7蛋白純度檢測(cè)圖；C圖為NCRT-RM16蛋白純度檢測(cè)圖；D圖為Flt3l-RM16蛋白純度檢測(cè)圖)；圖3示ELISPOT測(cè)試rm16E6E7蛋白、NCRT-RM16蛋白及Flt3l-RM16蛋白產(chǎn)生IFN-γ細(xì)胞免疫的應(yīng)答結(jié)果；圖4示ELISPOT測(cè)試rm16E6E7蛋白、NCRT-RM16蛋白及Flt3l-RM16蛋白產(chǎn)生IL-4細(xì)胞免疫的應(yīng)答結(jié)果；圖5示流式細(xì)胞測(cè)試rm16E6E7蛋白、NCRT-RM16蛋白及Flt3l-RM16蛋白產(chǎn)生IFN-γ+CD8+T細(xì)胞免疫的應(yīng)答結(jié)果；圖6示ELISA測(cè)試rm16E6E7蛋白、NCRT-RM16蛋白及Flt3l-RM16蛋白產(chǎn)生IgG抗體結(jié)果；圖7示ELISA測(cè)試rm16E6E7蛋白、NCRT-RM16蛋白及Flt3l-RM16蛋白產(chǎn)生IgG1抗體結(jié)果；圖8示ELISA測(cè)試rm16E6E7蛋白、NCRT-RM16蛋白及Flt3l-RM16蛋白產(chǎn)生IgG2a抗體結(jié)果；圖9示腫瘤治療實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；圖10示ELISPOT測(cè)試rm18E6E7蛋白、rm16E6E7+rm18E6E7蛋白的免疫應(yīng)答的結(jié)果圖。具體實(shí)施方式本發(fā)明公開(kāi)了一種重組蛋白及藥物組合物與應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。一方面，本發(fā)明涉及一種重組蛋白，包括人乳頭瘤病毒E6和E7變形體的融合多肽。本發(fā)明中所述人乳頭瘤病毒(HPV)E6/E7變形體的融合多肽可以源于HPV16型、18型、31型、33型、45型、51型、52型和58型。優(yōu)選的，所述E6和E7變形體融合多肽源于16型人乳頭瘤病毒(HPV16)和/或18型人乳頭瘤病毒(HPV18)。本發(fā)明所述的“人乳頭瘤病毒(HPV)E6/E7變形體的融合多肽”指對(duì)E6和E7的天然氨基酸序列進(jìn)行點(diǎn)突變后重新排列融合形成新的多肽序列。其中“點(diǎn)突變”指氨基酸序列中堿基對(duì)發(fā)生改變而使其與天然氨基酸序列產(chǎn)生差異。其中“重新排列”指將點(diǎn)突變的E6、E7的N端和C端分別融合后再連接形成E6N-E7N-E6C-E7C的融合多肽序列。本發(fā)明中E6、E7的點(diǎn)突變和重新排列氨基酸序列只改變其三維結(jié)構(gòu)去除轉(zhuǎn)化細(xì)胞活性，并不改變免疫原性，并且在重排的連接處有15個(gè)氨基酸的重疊，保證所有的抗原表位不丟失，使其仍然具有與天然氨基酸序列相同的免疫原性。本發(fā)明所述的一種重組蛋白可為氨基酸序列被突變并重排的人乳頭瘤病毒16型E6/E7融合多肽。更為具體地，該突變重排HPV16E6/E7融合多肽具有多個(gè)突變位點(diǎn)：E6蛋白中第47位的苯丙氨酸(F)突變?yōu)榫彼?R)、第50位的亮氨酸(L)突變?yōu)楦拾彼?G)、第63位的半胱氨酸(C)突變?yōu)楦拾彼?G)、第106位的半胱氨酸(C)突變?yōu)榫彼?R)，所述HPV16型E7蛋白中第23位的酪氨酸(Y)突變?yōu)楦拾彼?G)、第24位的半胱氨酸(C)突變?yōu)楦拾彼?G)、第25位的酪氨酸(Y)突變?yōu)楦拾彼?G)、第58位的半胱氨酸(C)突變?yōu)楦拾彼?G)、第91位的半胱氨酸(C)突變?yōu)楦拾彼?G)肽，重排情況如下：由點(diǎn)突變的HPV16E6蛋白N端第1-83位氨基酸、HPV16E7蛋白的N端第1-62位氨基酸、HPV16E6蛋白C端第69-151位氨基酸、HPV16E7蛋白C端第48-98位氨基酸依次連接，最為具體的，所述的突變重排的HPV16E6E7融合多肽的氨基酸序列具有如SEQIDNO.1所示氨基酸序列；或SEQIDNO.1所示氨基酸序列經(jīng)修飾、取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，且與SEQIDNO.1所示氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列。其中，所述具有如SEQIDNO.1所示氨基酸序列的突變重排的HPV16E6E7融合多肽命名為rm16E6E7。本發(fā)明所述的另一種重組蛋白可為氨基酸序列被突變并重排的人乳頭瘤病毒18型E6/E7融合多肽。更為具體地，該突變重排HPV18E6/E7融合多肽具有多個(gè)突變位點(diǎn)：HPV18E6蛋白中第49位的苯丙氨酸(F)突變?yōu)榫彼?R)、第52位的亮氨酸(L)突變?yōu)楦拾彼?G)、第65位的半胱氨酸(C)突變?yōu)楦拾彼?G)、第108位的半胱氨酸(C)突變?yōu)楦拾彼?G)；HPV18型E7蛋白中第26位的亮氨酸(L)突變?yōu)楦拾彼?G)、第27位的半胱氨酸(C)突變?yōu)楦拾彼?G)、第28位的組氨酸(H)突變?yōu)楦拾彼?G)、第65位的半胱氨酸(C)突變?yōu)楦拾彼?G)、第98位的半胱氨酸(C)突變?yōu)楦拾彼?G)。該突變重排HPV18E6/E7融合多肽重排情況如下：由點(diǎn)突變的HPV18E6蛋白N端第1-86位氨基酸、HPV18E7蛋白的N端第1-67位氨基酸、HPV18E6蛋白C端第72-158位氨基酸、HPV18E7蛋白C端第53-105位氨基酸依次連接。最為具體的，所述的突變重排的HPV18E6E7融合多肽的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示氨基酸序列；或SEQIDNO.2所示氨基酸序列經(jīng)修飾、取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，且與SEQIDNO.2所示氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列。其中，所述具有如SEQIDNO.2所示氨基酸序列的突變重排的HPV18E6E7融合多肽命名為rm18E6E7。作為優(yōu)選，所述取代幾個(gè)中的幾個(gè)為2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)、11個(gè)、12個(gè)。本發(fā)明對(duì)HPV16/18E6、E7蛋白中與腫瘤抑制蛋白p53和pRb的結(jié)合區(qū)域進(jìn)行了氨基酸點(diǎn)突變，并且E6、E7氨基酸序列的重排破壞了其本身的二聚化，則使突變重排后的E6、E7蛋白失去轉(zhuǎn)化正常細(xì)胞的能力。需要說(shuō)明的是，本發(fā)明僅在幾處關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行了點(diǎn)突變并且重排序列交接處有15個(gè)氨基酸重合，所以突變重排的HPV16E6/E7融合抗原仍具有全部的抗原表位，不影響抗原性。本發(fā)明涉及的重組蛋白，可不僅含有人乳頭瘤病毒(HPV)E6和E7變形體融合多肽，還可包括免疫刺激分子。其中“免疫刺激分子”指刺激參與免疫應(yīng)答的細(xì)胞以增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答的分子。其中，所述免疫刺激分子為fms樣酪氨酸激酶3配體(Flt3L)、TNF-ɑ、IL-2、趨化因子巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-1ɑ(MIP-1ɑ)和CD40配體(CD40L)、鈣網(wǎng)蛋白N端(NCRT)、熱休克蛋白(Hsp)、泛素(ubiquitin)中的至少一種，但不限于此。優(yōu)選的，所述免疫刺激分子為鈣網(wǎng)蛋白N端或fms樣酪氨酸激酶3配體。鈣網(wǎng)蛋白(calreticulin，CRT)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)主要的鈣結(jié)合蛋白，由3個(gè)功能區(qū)組成：N端的保守區(qū)、C端的鈣結(jié)合區(qū)及中間的富含脯氨酸并有兩段重復(fù)序列的P區(qū)。鈣網(wǎng)蛋白N端可以與MHC-I類分子異二聚體(MHC-β2m)相互作用維持二聚體的穩(wěn)定性，輔助抗原加工遞呈，而且能通過(guò)產(chǎn)生特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)和抗腫瘤血管生成達(dá)到更強(qiáng)的抗腫瘤效果。進(jìn)一步的，在一些實(shí)施方案中，所述鈣網(wǎng)蛋白N端具有如SEQIDNO.3所示氨基酸序列；或SEQIDNO.3所示氨基酸序列經(jīng)修飾、取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，且與SEQIDNO.3所示氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列。Flt3L(fms-liketyrosinekinase3ligand)是一種可以促進(jìn)多種干細(xì)胞、血細(xì)胞及前體細(xì)胞生成、分化的細(xì)胞因子，對(duì)細(xì)胞的形態(tài)和細(xì)胞表型都沒(méi)有影響，是一種良好的擴(kuò)增劑，對(duì)于DC的前體細(xì)胞增殖具有重要意義。Flt3配體能夠誘導(dǎo)DC細(xì)胞增殖與成熟，可增強(qiáng)免疫應(yīng)答，而且在與腫瘤抗原融合時(shí)具有能非常有效的減少腫瘤的效果。在一些實(shí)施方案中，所述fms樣酪氨酸激酶3配體具有如SEQIDNO.4所示氨基酸序列；或SEQIDNO.4所示氨基酸序列經(jīng)修飾、取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，且與SEQIDNO.4所示氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列。本發(fā)明所述的另一種重組蛋白可為氨基酸序列被突變并重排的人乳頭瘤病毒E6、E7融合多肽進(jìn)一步與免疫刺激分子融合形成的融合氨基酸序列。優(yōu)選的，所述免疫刺激分子與所述人乳頭瘤病毒E6和E7變形體的融合多肽以連接肽連接。在一些實(shí)施方案中，所述連接肽具有如SEQIDNo.9所示氨基酸序列(GGGGS)。在本發(fā)明中所述的人乳頭瘤病毒(HPV)E6、E7變形體融合多肽與免疫刺激分子通過(guò)一段序列為GGGGS的linker將免疫刺激分子蛋白的C端與人乳頭瘤病毒(HPV)E6、E7變形體融合多肽的N端連接，以減小融合蛋白的空間位阻，使其表達(dá)時(shí)構(gòu)象能夠正確折疊。在一些實(shí)施例中，所述免疫刺激分子為鈣網(wǎng)蛋白N端(NCRT)；所述rm16E6E7與NCRT連接時(shí)，重組蛋白命名為NCRT-RM16；所述rm18E6E7重組蛋白與NCRT連接時(shí)重組蛋白命名為NCRT-RM18。在一些實(shí)施例中，所述免疫刺激分子為fms樣酪氨酸激酶3配體(Flt3L)；所述rm16E6E7重組蛋白與Flt3L連接時(shí)重組蛋白命名為Flt3l-RM16；所述rm18E6E7重組蛋白與Flt3L連接時(shí)重組蛋白命名為Flt3l-RM18。另外，本發(fā)明所提供的重組蛋白不限于只包含一種所述的融合多肽。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述重組蛋白包括16型人乳頭瘤病毒(HPV)E6和E7融合多肽和18型人乳頭瘤病毒(HPV)E6和E7融合多肽的融合蛋白。另一方面，本發(fā)明還涉及編碼所述重組蛋白的核苷酸序列。優(yōu)選的，所述編碼SEQIDNO.1所示人乳頭瘤病毒16型E6/E7變形體融合多肽具有如SEQIDNO.5所示核苷酸序列。優(yōu)選的，所述編碼SEQIDNO.2所示人乳頭瘤病毒18型E6/E7變形體融合多肽具有如SEQIDNO.6所示核苷酸序列。優(yōu)選的，所述編碼SEQIDNO.3所示免疫刺激分子鈣網(wǎng)蛋白N端具有如SEQIDNO.7所示核苷酸序列。優(yōu)選的，所述編碼SEQIDNO.4所示免疫刺激分子fms樣酪氨酸激酶3配體具有如SEQIDNO.8所示核苷酸序列。另一方面，本發(fā)明涉及一種重組表達(dá)載體，含有本發(fā)明所述的核苷酸序列。在本發(fā)明中，“重組表達(dá)載體”指包括外源DNA的遺傳結(jié)構(gòu)，所述重組蛋白的核苷酸序列被插入于所述重組表達(dá)載體編碼多肽的表達(dá)框中。本發(fā)明所述的“重組表達(dá)載體”可為質(zhì)粒載體、粘粒載體、酵母載體或噬菌體載體，其中優(yōu)選為質(zhì)粒載體。優(yōu)選的，所述重組蛋白為rm16E6E7、rm18E6E7、Flt3l-RM16、Flt3l-RM18、NCRT-RM16或NCRT-RM18。另一方面，本發(fā)明涉及一種工程菌，含有本發(fā)明所述的表達(dá)載體。在本發(fā)明中，“工程菌”通過(guò)將重組表達(dá)載體熱激轉(zhuǎn)化進(jìn)入宿主細(xì)胞所獲得。本發(fā)明中所表達(dá)的“宿主細(xì)胞”包括原核或真核細(xì)胞。所述宿主細(xì)胞選自大腸桿菌、酵母、昆蟲(chóng)或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌。進(jìn)一步優(yōu)選的，所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌BL21。在一些實(shí)施例中，所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌BL21(DE3)。此外，本發(fā)明的重組表達(dá)載體包含的所述核苷酸可用在宿主細(xì)胞中具有高表達(dá)頻率的遺傳密碼子優(yōu)化。本發(fā)明中所表達(dá)的“有高表達(dá)頻率的遺傳密碼子優(yōu)化”指，根據(jù)宿主細(xì)胞內(nèi)DNA轉(zhuǎn)錄或翻譯成蛋白過(guò)程中存在的更高偏愛(ài)性的遺傳密碼子，將核苷酸編碼氨基酸的遺傳密碼子替換成具有宿主細(xì)胞更高偏愛(ài)性的遺傳密碼子，從而增強(qiáng)核苷酸編碼蛋白的表達(dá)效率。本發(fā)明還涉及一種藥物組合物，包括所述的重組蛋白和佐劑。所述重組蛋白作為活性成分可以由所述宿主細(xì)胞表達(dá)得到。其中，本發(fā)明所述“佐劑”指與抗原共同免疫后可非特異性的提高機(jī)體的免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類型的物質(zhì)。優(yōu)選的，所述佐劑為油/水乳化劑ISA51、TLR3激動(dòng)劑polyI:C、表面活性劑類免疫刺激復(fù)合物ISCOMATRIX、CpG-ODN(非甲基化的胞嘧啶核苷酸和鳥(niǎo)嘌呤核苷酸為基元的寡聚體)中的至少一種，但不限于此。在一些實(shí)施方案中，所述佐劑為ISA51佐劑或CpG-ODN佐劑。其中，CpG基序(CpGmotifs)是指一類以非甲基化的CpG為核心的寡聚脫氧核糖核苷酸(oligodeoxynucleotides,ODN)，這種序列可激活多種免疫效應(yīng)細(xì)胞，能夠促進(jìn)DC細(xì)胞成熟，增強(qiáng)抗凋亡能力,上調(diào)MHC分子和共刺激分子(CD86，CD80和CD40)，促進(jìn)Th1型免疫反應(yīng)的趨化因子和細(xì)胞因子的分泌，還可以介導(dǎo)DC通過(guò)MHC-I途徑交叉遞呈外源蛋白，對(duì)提高細(xì)胞免疫應(yīng)答具有重大意義。而MONTANIDEISA油包水佐劑不僅對(duì)抗原具有緩釋作用，還能產(chǎn)生炎癥反應(yīng)并促進(jìn)抗原遞呈細(xì)胞(APC)的募集(如巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞)，通過(guò)表面活性劑與細(xì)胞膜的相互作用抗原被胞吞進(jìn)APC，促進(jìn)MHCII類分子表達(dá)和交叉遞呈能誘導(dǎo)強(qiáng)的MHCI類分子的遞呈，因此，可同時(shí)誘導(dǎo)抗原特異性的CD8+和CD4+細(xì)胞免疫應(yīng)答和B細(xì)胞活化。在一些實(shí)施例中，所述藥物組合物包含有效成分為人乳頭瘤病毒16型E6、E7變形體融合多肽rm16E6E7重組蛋白和CpG佐劑。在一些實(shí)施例中，所述藥物組合物包含有效成分為人乳頭瘤病毒18型E6、E7變形體融合多肽rm18E6E7和ISA51佐劑。在一些實(shí)施例中，所述藥物組合物包含人乳頭瘤病毒16型E6、E7變形體融合多肽進(jìn)一步融合Flt3l免疫刺激分子形成的重組蛋白Flt3l-RM16和CpG佐劑。在一些實(shí)施例中，所述藥物組合物包含人乳頭瘤病毒16型E6、E7變形體融合多肽進(jìn)一步融合NCRT免疫刺激分子形成的重組蛋白NCRT-RM16和CpG佐劑。在一些實(shí)施方案中，所述藥物組合物還包括可藥用載體。優(yōu)選的，所述可藥用載體包括但不限于乳糖、蔗糖、葡萄糖、山梨糖醇、淀粉、阿拉伯膠、藻酸鹽、明膠、磷酸鈣、纖維素、甲基纖維素、微晶纖維素、水、羥基苯甲酸甲酯、滑石粉、硬脂酸鎂、礦物油中的至少一種。ELISPOT和流式結(jié)果表明，本發(fā)明所述的融合多肽免疫小鼠均能產(chǎn)生一定的細(xì)胞免疫，且融合了Flt3l免疫刺激分子和人乳頭瘤病毒16型E6、E7變形體融合多肽的重組蛋白能產(chǎn)生最強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答。依據(jù)現(xiàn)有對(duì)小鼠腫瘤模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，人乳頭瘤病毒16型E6、E7變形體融合多肽、融合了Flt3l免疫刺激分子和人乳頭瘤病毒16型E6、E7變形體融合多肽的重組蛋白、融合了NCRT免疫刺激分子和人乳頭瘤病毒16型E6、E7變形體融合多肽的重組蛋白，均能完全抑制TC-1腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。表明這些疫苗在人體內(nèi)也能激發(fā)和強(qiáng)化針對(duì)人乳頭瘤病毒E6、E7蛋白的特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答，從而對(duì)HPV感染細(xì)胞及宮頸癌病變細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)大的殺傷作用，因此此類疫苗可用于治療HPV感染所致的宮頸癌。因此本發(fā)明還提供了所述的重組蛋白或/和所述的藥物組合物在制備提高針對(duì)人乳頭瘤病毒的體液免疫和細(xì)胞免疫免疫應(yīng)答的藥物中的應(yīng)用。同時(shí)，本發(fā)明還提供了所述的重組蛋白或/和所述的藥物組合物在制備治療和/或預(yù)防人乳頭瘤病毒引起疾病的藥物中的應(yīng)用。優(yōu)選的，所述人乳頭瘤病毒引起的疾病為子宮頸癌。優(yōu)選的，所述藥物為預(yù)防性或治療性疫苗。本發(fā)明所述重組蛋白或所述藥物組合物可通過(guò)靜脈內(nèi)、肌肉、口服、經(jīng)皮、粘膜內(nèi)、鼻內(nèi)、氣管內(nèi)、皮下等的任何途徑給藥。作為優(yōu)選，所述給藥途徑為皮下給藥或肌肉注射。下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明，如無(wú)特征說(shuō)明實(shí)施例中所用原料及試劑均可由市場(chǎng)購(gòu)得。本發(fā)明所述的重組蛋白可通過(guò)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，優(yōu)選為大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，但不限于此。本發(fā)明所涉及的用于編碼重組蛋白的核苷酸序列可在用在宿主細(xì)胞中具有高表達(dá)頻率的密碼子替換之后使用，根據(jù)不同的宿主細(xì)胞使用不同的偏愛(ài)密碼子優(yōu)化進(jìn)行序列優(yōu)化，本發(fā)明使用大腸桿菌偏愛(ài)密碼子進(jìn)行優(yōu)化，但不限于此。本發(fā)明所述重組蛋白可用于如人、猴、鼠、豬和兔的哺乳動(dòng)物，但不限于此。實(shí)施例1：DNA結(jié)構(gòu)與質(zhì)粒構(gòu)建人乳頭瘤病毒(HPV)16/18型E6/E7蛋白是主要的致癌蛋白，具有轉(zhuǎn)化活性，為了消除E6、E7蛋白的致癌性，在HPV16和HPV18的E6、E7蛋白的重要位點(diǎn)進(jìn)行了點(diǎn)突變。HPV16型E6中第47位的苯丙氨酸(F)突變?yōu)榫彼?R)、第50位的亮氨酸(L)突變?yōu)楦拾彼?G)、第63位的半胱氨酸(C)突變?yōu)楦拾彼?G)、第106位的半胱氨酸(C)突變?yōu)榫彼?R)；HPV16E7中第23位的酪氨酸(Y)突變?yōu)楦拾彼?G)、第24位的半胱氨酸(C)突變?yōu)楦拾彼?G)、第25位的酪氨酸(Y)突變?yōu)楦拾彼?G)、第58位的半胱氨酸(C)突變?yōu)楦拾彼?G)、第91位的半胱氨酸(C)突變?yōu)楦拾彼?G)。HPV18型E6中第49位的苯丙氨酸(F)突變?yōu)榫彼?R)、第52位的亮氨酸(L)突變?yōu)楦拾彼?G)、第65位的半胱氨酸(C)突變?yōu)楦拾彼?G)、第108位的半胱氨酸(C)突變?yōu)楦拾彼?G)；HPV18E7中第26位的亮氨酸(L)突變?yōu)楦拾彼?G)、第27位的半胱氨酸(C)突變?yōu)楦拾彼?G)、第28位的組氨酸(H)突變?yōu)楦拾彼?G)、第65位的半胱氨酸(C)突變?yōu)楦拾彼?G)、第98位的半胱氨酸(C)突變?yōu)楦拾彼?G)。以大腸桿菌的表達(dá)適應(yīng)性對(duì)點(diǎn)突變?cè)O(shè)計(jì)后的HPV16E6、HPV16E7、HPV18E6、HPV18E7，鈣網(wǎng)蛋白(CRT)N端(N-terminaldomainofCRT，NCRT)和Fms-liketyrosinekinase-3ligand(Flt3L)的氨基酸序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，并由武漢金開(kāi)瑞生物工程有限公司合成。為進(jìn)一步消除E6、E7轉(zhuǎn)化細(xì)胞活性及提高其表達(dá)量，將E6、E7序列用overlapPCR方法進(jìn)行重排連接，即以HPV16型E6、HPV16型E7的合成基因?yàn)槟０?，設(shè)計(jì)引物分別PCR獲得編碼HPV16型E6N端1-83氨基酸的核苷酸序列、編碼HPV16E7N端的1-62氨基酸的核苷酸序列、編碼HPV16型E6C端的69-151氨基酸的核苷酸序列、編碼HPV16E7C端的48-98氨基酸的核苷酸序列，通過(guò)overlapPCR方法將這四段序列依次連接，獲得重排突變的HPV16型E6E7序列，稱為rm16E6E7，核酸序列如SEQIDNo.5；以HPV18型E6、HPV18型E7的合成基因?yàn)槟０?，設(shè)計(jì)引物分別PCR獲得編碼HPV18型E6N端1-86氨基酸的核苷酸序列、編碼HPV18型E7N端的1-67氨基酸的核苷酸序列、編碼HPV18型E6C端的72-158氨基酸的核苷酸序列、編碼HPV18型E7C端的53-105氨基酸的核苷酸序列，通過(guò)overlapPCR方法將這四段序列依次連接，獲得重排突變的HPV18型E6E7序列，稱為rm18E6E7，核酸序列如SEQIDNO.6。經(jīng)PCR方法在NCRT和Flt3l核酸序列后加一段連接肽(SEQIDNO.9)，再通過(guò)overlapPCR方法將加入linker的NCRT和Flt3l片段分別與rm16E6E7連接得到新的序列稱為NCRT-RM16和Flt3l-RM16，其中NCRT和Flt3l核酸序列如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8。rm16E6E7、rm18E6E7、NCRT-RM16和Flt3l-RM16四種蛋白結(jié)構(gòu)如圖1。同時(shí)在rm16E6E7和rm18E6E7序列兩端加入NdeI/HindIII酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基，在NCRT-RM16和Flt3l-RM16兩端加入NdeI/XhoI酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基。用NdeI/HindIII限制性內(nèi)切酶(Takara)酶切pET26b載體質(zhì)粒和rm16E6E7/rm18E6E7片段，用NdeI/XhoI限制性內(nèi)切酶(Takara)酶切pET28a通用載體質(zhì)粒和NCRT-RM16/Flt3l-RM16片段，最后用T4DNA連接酶(Takara)分別連接pET26b和rm16E6E7/rm18E6E7片段構(gòu)建pET26b-rm16E6E7與pET26b-rm18E6E7表達(dá)載體，用T4DNA連接酶分別連接pET28a和NCRT-RM16/Flt3l-RM16片段構(gòu)建pET28a-NCRT-RM16與pET28a-Flt3l-RM16表達(dá)載體。實(shí)施例2：重組蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)與制備pET28a-Flt3l-RM16重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化BL21(DE3)大腸桿菌感受態(tài)，涂kana抗性平板，通過(guò)菌落PCR鑒定獲得可表達(dá)重組蛋白的大腸桿菌。LB培養(yǎng)基37℃擴(kuò)培工程菌(成功表達(dá)Flt3l-RM16重組蛋白的大腸桿菌)，待OD600＝0.6～0.8時(shí)加入0.4mMIPTG，16℃誘導(dǎo)16h。誘導(dǎo)完成后7500g離心5min收集菌體，PBS(PH7.4)清洗菌體2次。取20g工程菌用100mlPBS(PH7.4)重懸并加入終濃度為1mM的PMSF(Beyotime)和EDTA(國(guó)藥集團(tuán))，高壓勻漿機(jī)1000bar破菌1次，收集破菌液15000g離心30min分離上清與沉淀。沉淀用30ml洗滌液(50mMTris-HCl+50mMNaCl，PH8.5)洗滌一次，15000g離心10min；沉淀再用30ml洗滌液(50mMTris-HCl+50mMNaCl+2M尿素+1％TritonX-100，PH8.5)洗一次，15000g離心10min，所得沉淀即為包涵體。取20ml包涵體用變性劑(50mMTris-HCl+50mMNaCl+6M尿素+50mMDTT+0.5％SDS，PH8.5)重懸并上下顛倒直到包涵體幾乎被全部溶解，15000g離心10min去除不溶物，收集上清為包涵體溶解液。取5ml包涵體溶解液裝入透析袋中，1L3M尿素+50mMTris-HCl(PH8.5)+50mMNaCl室溫透析2h，1L1M尿素+50mMTris-HCl(PH8.5)+50mMNaCl室溫透析2h，1L50mMTris-HCl(PH8.5)+50mMNaCl室溫透析2h，1LPBS(PH8.0)室溫透析4h后換液再過(guò)夜。透析后15000g離心10min去除不溶物。用去內(nèi)毒素試劑盒(HighCapacityEndotoxinRemovalSpinColumn，Thermo)處理蛋白去除內(nèi)毒素，0.22μm濾膜過(guò)濾即得純化后的Flt3l-RM16重組蛋白；以同樣方法制得rm16E6E7、rm18E6E7和NCRT-RM16重組蛋白。上述步驟制備的rm16E6E7、rm18E6E7、NCRT-RM16和Flt3l-RM16重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)后在預(yù)期位置出現(xiàn)目的條帶如圖2。表1相關(guān)序列名稱編號(hào)序列(方向?yàn)椋?’-3’)CpG-ODNSEQIDNO.10TCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT實(shí)施例3：ELISPOT檢測(cè)細(xì)胞免疫水平由于rm16E6E7與rm18E6E7；Flt3l-RM16、NCRT-RM16與Flt3l-RM18、NCRT-RM18結(jié)構(gòu)功能類似，因此，以下實(shí)施例3～6以rm16E6E7、Flt3l-RM16、NCRT-RM16為例。CpG-ODN制備：使用的CpG-ODN序列如表1所示。利用固相亞磷酰胺三酯法化學(xué)合成制備CpG-ODN，由3’端開(kāi)始，1)脫保護(hù)基：先用三氯乙酸脫去連接在CpG上的核苷酸的保護(hù)基團(tuán)DMT(二甲氧基三苯甲基)，獲得游離的5’羥基，以供下一步縮合反應(yīng)使用；2)活化：將亞磷酰胺保護(hù)的核苷酸單體與四氮唑活化劑混合并進(jìn)入合成柱，形成亞磷酰胺四唑活性中間體，此中間體與CpG上已脫保護(hù)基的核苷酸發(fā)生縮合反應(yīng)；3)連接：亞磷酰胺四唑活性中間體遇到CpG上已脫保護(hù)基的核苷酸時(shí)，將與其5’羥基發(fā)生親和反應(yīng)，縮合并脫去四唑，此時(shí)寡核苷酸鏈向前延長(zhǎng)一個(gè)堿基；4)氧化：縮合反應(yīng)時(shí)核苷酸單體是通過(guò)亞磷酯鍵與連在CpG上的寡核苷酸連接，而亞磷酯鍵不穩(wěn)定，易被酸或堿水解，此時(shí)使用硫代試劑將亞磷酰胺氧化為硫磷雙鍵的磷酸三酯，從而得到穩(wěn)定的寡核苷酸；5)封閉：縮合反應(yīng)后為了防止連在CpG上的未參與反應(yīng)的5’羥基在隨后的循環(huán)反應(yīng)中被延伸，常通過(guò)乙酰化來(lái)封閉此端羥基；經(jīng)過(guò)以上五個(gè)步驟后，一個(gè)脫氧核苷酸就連到CpG的核苷酸上；重復(fù)以上的脫保護(hù)基、活化、連接、氧化、封閉過(guò)程即可得到一個(gè)DNA片段粗品；最后對(duì)其進(jìn)行切割、脫保護(hù)基、純化、定量等合成后處理即可得到符合的CpG-ODN；-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?。ELISPOT檢測(cè)步驟如下：使用C57BL/6小鼠，雌性，6-8周(上海斯萊克)。使用的抗原通過(guò)實(shí)施例2的方法制備，將雌性C57BL/6小鼠分為四組(5只/組)，分別腹部皮下注射100μgrm16E6E7+100μgCpG-ODN、100μgNCRT-RM16+100μgCpG-ODN、100μgFlt3l-RM16+100μgCpG-ODN和PBS(Gibco)，共免疫兩次，時(shí)間間隔兩周，二免10天后處死小鼠分離脾臟制備脾細(xì)胞。具體如下：無(wú)菌操作取脾臟：用無(wú)菌鑷子及剪刀剪取脾臟，放于70μm尼龍網(wǎng)篩(BD)中，置于含有5ml預(yù)冷處理的2％FBS(GIBCO)-PBS的平皿中；用研磨棒研磨脾臟，脾臟細(xì)胞通過(guò)篩目進(jìn)入平皿中，得到細(xì)胞懸液，用巴氏吸管將懸液放入經(jīng)40μm尼龍網(wǎng)篩過(guò)濾(BD公司)的50ml無(wú)菌離心管；500g，4℃離心5分鐘；棄去上清，加入5ml1×破紅劑(BD)重懸細(xì)胞，室溫作用10分鐘，以破碎紅細(xì)胞；加入5ml2％FBS-PBS終止破紅反應(yīng)；500g，4℃離心5分鐘；棄去上清，加入5ml2％FBS-PBS洗滌細(xì)胞；500g，4℃離心5分鐘；棄去上清，加入1ml2％FBS-PBS重懸細(xì)胞備用。用PBS稀釋MouseIFN-γ/IL-4(1：200稀釋，BD)，100μl/孔加至ELISPOT板，4℃包被過(guò)夜；棄去包被抗體，用封閉液(含10％FBSRPMI-1640培養(yǎng)液)洗孔1次，加入封閉液200μl/孔，室溫孵育2h；采用10％FBS-1640培養(yǎng)基稀釋肽至4μg/ml；采用10％FBS-1640培養(yǎng)基稀釋ConA至20μg/ml；棄去封閉液，將1×107細(xì)胞/ml的脾淋巴細(xì)胞懸液與配置好的刺激物按100μl/孔分別加入96孔板中；于37℃5％CO2培養(yǎng)箱孵育48h；棄去細(xì)胞懸液，用去離子水洗板2次，3-5m/次，用PBST洗滌3次，200μl/孔，加入用10％FBS-PBS稀釋的MouseIFN-γ/IL-4ELISPOTdetectionAntibody(1：250稀釋，BD)，100μl/孔，室溫孵育2h；棄去檢測(cè)抗體，用PBST洗板4次，200μl/孔，加入用10％FBS-PBS稀釋Streptavidian-HRP(1：100稀釋，BD)，100μl/孔，室溫孵育1h；棄去酶結(jié)合物，用PBST洗4次，再用PBS洗3次，加入AEC底物100μl/孔顯色，肉眼觀察斑點(diǎn)形成，加去離子水終止反應(yīng)；在ImmunoSPOTSeries3自動(dòng)讀板機(jī)上讀取斑點(diǎn)數(shù)；結(jié)果顯示在圖3和圖4中。如圖3和圖4所示，ELISPOT結(jié)果表明，免疫rm16E6E7、NCRT-RM16和Flt3l-RM16重組蛋白的實(shí)驗(yàn)組中分泌IFN-r和IL-4的細(xì)胞數(shù)量都高于免疫PBS的對(duì)照組，并且免疫Flt3l-RM16實(shí)驗(yàn)組比免疫rm16E6E7和NCRT-RM16實(shí)驗(yàn)組具有更高的分泌IFN-r、IL-4細(xì)胞數(shù)量，說(shuō)明rm16E6E7、NCRT-RM16和Flt3l-RM16重組蛋白都可以刺激小鼠產(chǎn)生一定強(qiáng)度的細(xì)胞免疫應(yīng)答，同時(shí)Flt3l-RM16比rm16E6E7和NCRT-RM16能產(chǎn)生更強(qiáng)的細(xì)胞免疫，免疫效果更好。除去PBS組，在各免疫組間比較，E6、E7兩個(gè)肽庫(kù)刺激產(chǎn)生的強(qiáng)弱趨勢(shì)基本相同，但E7肽庫(kù)刺激產(chǎn)生各指標(biāo)的絕對(duì)數(shù)值比E6刺激的要高很多，說(shuō)明在小鼠中E7蛋白激發(fā)的細(xì)胞免疫應(yīng)答強(qiáng)度要遠(yuǎn)高于E6蛋白所激發(fā)的強(qiáng)度。實(shí)施例4：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)免疫水平流式細(xì)胞術(shù)步驟：所用C57BL/6小鼠、抗原和CpG-ODN佐劑均與實(shí)施例3相同。使用C57BL/6小鼠，雌性，6-8周(上海斯萊克)。使用的抗原通過(guò)實(shí)施例2的方法制備，將雌性C57BL/6小鼠分為四組(5只/組)，分別腹部皮下注射100μgrm16E6E7+100μgCpG-ODN、100μgNCRT-RM16+100μgCpG-ODN、100μgFlt3l-RM16+100μgCpG-ODN和PBS(Gibco)，共免疫兩次，時(shí)間間隔兩周，二免10天后處死小鼠分離脾臟制備脾細(xì)胞；5×107cells/mL的脾淋巴細(xì)胞懸液100μl/well鋪于96孔板中，設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)組加入10％FBS-1640稀釋的10μg/mlHPV16型E6E7FACS肽庫(kù)100μl，陽(yáng)性對(duì)照組加入10％FBS-1640稀釋的20μg/mlconA100μl，陰性對(duì)照組補(bǔ)加100μl10％FBS-1640培養(yǎng)液，37℃5％CO2培養(yǎng)箱孵育3h后各加入3μlGolgiStop(BD)和4μlGolgiPlus(BD)，之后繼續(xù)孵育3h，300g，4℃離心5min，棄上清，然后進(jìn)行CD4、CD8和IFN-r細(xì)胞因子染色。具體情況如下：100μlstainingbuffer(1％BSA-PBS)中分別加入0.1μg/test的Anti-mouse-CD4-PEantibody(BD)和Anti-mouse-CD8α-FITCantibody(Biolegend)，混勻后于4℃避光靜置30min；加200μlstainingbuffer洗滌1次；各加入200μl/孔fixationbuffer(BioLegend)，室溫，避光20min；300g，離心5min，棄上清；各加入200μl/孔Cyto-lastbuffer(BioLegend)，混勻后于4℃避光保存(可保存2星期)；300g，4℃離心5min，棄上清；加入1×Perm/Wash(BD)液100μl，室溫放置15min，300g4℃離心5min，棄上清；100μl的1×Perm/Wash中加入Anti-IFN-r-APCantibody(Biolegen，0.1μg/test)，室溫避光靜置30min；300g4℃離心5min，棄上清；加入1×Perm/Wash液200μL，洗滌1次；細(xì)胞重懸于150μL的1×Perm/Wash中，流式細(xì)胞儀測(cè)定，Cellquest軟件分析；結(jié)果顯示在圖5中。流式的檢測(cè)結(jié)果與ELISPOT的結(jié)果相同，如圖5所示，三個(gè)免疫組相對(duì)于對(duì)照組來(lái)說(shuō)均能產(chǎn)生一定的細(xì)胞免疫，且免疫Flt3l-RM16實(shí)驗(yàn)組能產(chǎn)生的CD8+，IFN-r+細(xì)胞數(shù)比免疫rm16E6E7和NCRT-RM16實(shí)驗(yàn)組更高，細(xì)胞免疫更強(qiáng)。綜上所訴，加了功能性片段的Flt3l-RM16重組蛋白比rm16E6E7和NCRT-RM16重組蛋白能產(chǎn)生更強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答。實(shí)施例5：ELISA檢測(cè)免疫水平本實(shí)施例所用C57BL/6小鼠、抗原和CpG-ODN佐劑均與實(shí)施例3相同。將雌性C57BL/6小鼠分為四組(5只/組)，分別腹部皮下注射100ugrm16E6E7+100ugCpG-ODN、100ugNCRT-RM16+100ugCpG-ODN、100ugFlt3l-RM16+100ugCpG-ODN和PBS(Gibco)，共免疫兩次，間隔兩周，在免前、一免二周和二免后十天進(jìn)行眼眶采血；采出的血37℃放置40min后1000rpm離心10min分離出上層血清，用ELISA方法檢測(cè)小鼠血清中的抗體水平。用包被液將rm16E6E7重組蛋白稀釋至0.5μg/ml，50μl/孔包被96孔酶標(biāo)板(Nunc)，4℃過(guò)夜；PBST(0.05％Tween20-PBS)洗滌2次后加入5％milk，200μl/孔，37℃封閉1h；PBST洗滌2次后，加入2％脫脂奶以3倍梯度稀釋的待檢血清，50μl/孔，37℃反應(yīng)1h；PBST洗滌3次后分別加入酶標(biāo)二抗：1:30000稀釋的HRP-羊抗小鼠IgG抗體(SIGMA)、1:20000稀釋的HRP-羊抗小鼠IgG1抗體(SouthernBiotech)、1:6000稀釋的HRP-羊抗小鼠IgG2a抗體(SouthernBiotech)，每孔50μl，37℃作用40分鐘；PBST洗滌3次后加入50μl/孔TMB顯色液(Thermo)顯色10min；每孔50μl的2MH2SO4終止反應(yīng)；用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處吸光值OD450(以O(shè)D630校正)，并確定終點(diǎn)滴度。結(jié)果顯示在圖6、圖7、圖8中。由體液免疫結(jié)果可知，如圖6、圖7、圖8所示，rm16E6E7和Flt3l-RM16免疫組產(chǎn)生的IgG、IgG1和IgG2a抗體水平都明顯高于NCRT-RM16免疫組和PBS對(duì)照組，說(shuō)明rm16E6E7和Flt3l-RM16重組蛋白在小鼠體內(nèi)均能產(chǎn)生HPV16E6E7特異性抗體，且二免后的抗體水平相對(duì)于一免來(lái)說(shuō)有大幅度提高，具有顯著性差異。但NCRT-RM16免疫組產(chǎn)生的IgG、IgG1和IgG2a抗體水平相對(duì)于PBS對(duì)照組來(lái)說(shuō)沒(méi)有顯著提高，說(shuō)明NCRT-RM16重組蛋白不能夠有效的刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫。Flt3l-RM16和rm16E6E7兩組間產(chǎn)生的抗體水平差不多，在此劑量下無(wú)法區(qū)分兩重組蛋白產(chǎn)生體液免疫水平的差異。綜上所述，NCRT-RM16重組蛋白不能夠有效的刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫，F(xiàn)lt3l-RM16和rm16E6E7重組蛋白可以刺激機(jī)體產(chǎn)生較高的HPV16E6E7特異性抗體，但免疫100μg的劑量無(wú)法區(qū)分Flt3l-RM16和rm16E6E7兩重組蛋白產(chǎn)生體液免疫水平的差異。實(shí)施例6：腫瘤抑制試驗(yàn)本實(shí)施例所使用的C57BL/6小鼠、抗原和CpG-ODN佐劑與實(shí)施例3相同。TC-1腫瘤細(xì)胞購(gòu)買于ATTC。C57BL/6小鼠于腹部皮下接種1×104TC-1細(xì)胞建立腫瘤模型，接種一天后在小鼠腹部腫瘤接種位置皮下注射100μgrm16E6E7+100μgCpG-ODN、100μgNCRT-RM16+100μgCpG-ODN、100μgFlt3l-RM16+100μgCpG-ODN和100μlPBS(Gibco)，兩周后同樣的劑量和方法加強(qiáng)免疫一次。從腫瘤接種后開(kāi)始觀察小鼠腫瘤生長(zhǎng)情況，每周測(cè)量?jī)纱文[瘤大小，測(cè)量腫瘤相互垂直的長(zhǎng)徑和短徑，并通過(guò)公式(長(zhǎng)徑×短徑2÷2)計(jì)算腫瘤體積；腫瘤生長(zhǎng)情況展示在圖9中。如圖9所示，可以看出抗原對(duì)腫瘤的抑制情況，免疫組均沒(méi)有腫瘤生長(zhǎng)，腫瘤抑制率為100％，PBS對(duì)照組平均腫瘤體積可達(dá)到將近4000mm3。說(shuō)明rm16E6E7、NCRT-RM16和Flt3l-RM16在100μg的免疫劑量下都能夠完全抑制腫瘤生長(zhǎng)，均有較好的抑瘤效果，但在此劑量下無(wú)法區(qū)分各重組蛋白間腫瘤抑制作用的差異。實(shí)施例7：ELISPOT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HPV18特異性細(xì)胞免疫水平本實(shí)施例所使用的抗原rm16E6E7和rm18E6E7由實(shí)施例2中的方法制得，所用C57BL/6小鼠與實(shí)施例3相同，ISA51佐劑購(gòu)于(SEPPIC)。將雌性C57BL/6小鼠分為3組，分別右大腿肌肉注射10μgrm18E6E7+ISA51、10μgrm16E6E7+10μgrm18E6E7+ISA51和100μlPBS(Gibco)，共免疫兩次，間隔兩周，二免十天后處死小鼠分離脾臟制備脾細(xì)胞。根據(jù)實(shí)施例3所述的ELISPOT方法，測(cè)定本實(shí)施例中各免疫組細(xì)胞免疫情況；結(jié)果展示在圖10中。由圖10可知，rm18E6E7和rm16E6E7+rm18E6E7免疫組相對(duì)于PBS對(duì)照組來(lái)說(shuō)均能產(chǎn)生一定的細(xì)胞免疫應(yīng)答?？傮w來(lái)說(shuō)rm16E6E7+rm18E6E7共同免疫產(chǎn)生的細(xì)胞免疫水平要高于rm18E6E7單獨(dú)免疫所產(chǎn)生的細(xì)胞免疫水平。其中rm16E6E7+rm18E6E7免疫組比rm18E6E7免疫組產(chǎn)生的HPV18型E6特異性細(xì)胞免疫要強(qiáng)很多，具有顯著性差異，說(shuō)明rm16E6E7能顯著增強(qiáng)rm18E6E7產(chǎn)生的HPV18E6特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答，提高免疫效果。但在兩免疫組中，HPV18型E6肽庫(kù)刺激產(chǎn)生指標(biāo)的絕對(duì)數(shù)值比HPV18型E7刺激的要高很多，這是因?yàn)槭褂昧瞬煌淖魟?，ISA51佐劑較CpG-ODN佐劑來(lái)說(shuō)更能刺激機(jī)體產(chǎn)生E6特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。SEQUENCELISTING<110>蘇州遠(yuǎn)康生物醫(yī)藥有限公司<120>一種重組蛋白及藥物組合物與應(yīng)用<130>MP1624487<160>10<170>PatentInversion3.3<210>1<211>279<212>PRT<213>人工序列<400>1MetPheGlnAspProGlnGluArgProArgLysLeuProHisLeuCys151015ThrGluLeuGlnThrThrIleHisAspIleIleLeuGluCysValTyr202530CysLysGlnGlnLeuLeuArgArgGluValTyrAspPheAlaArgArg354045AspGlyCysIleValTyrArgAspGlyAsnProTyrAlaValGlyAsp505560LysCysLeuLysPheTyrSerLysIleSerGluTyrArgTyrTyrCys65707580TyrSerValMetHisGlyAspThrProThrLeuHisGluTyrMetLeu859095AspLeuGlnProGluThrThrAspLeuGlyGlyGlyGluGlnLeuSer100105110AspSerSerGluGluGluAspGluIleAspGlyProAlaGlyGlnAla115120125GluProAspArgAlaHisTyrAsnIleValThrPheGlyCysLysCys130135140AspPheTyrSerLysIleSerGluTyrArgTyrTyrCysTyrSerVal145150155160TyrGlyThrThrLeuGluGlnGlnTyrAsnLysProLeuCysAspLeu165170175LeuIleArgCysIleAsnArgGlnLysProLeuCysProGluGluLys180185190GlnArgHisLeuAspLysLysGlnArgPheHisAsnIleArgGlyArg195200205TrpThrGlyArgCysMetSerCysCysArgSerSerArgThrArgArg210215220GluThrGlnLeuAspArgAlaHisTyrAsnIleValThrPheGlyCys225230235240LysCysAspSerThrLeuArgLeuCysValGlnSerThrHisValAsp245250255IleArgThrLeuGluAspLeuLeuMetGlyThrLeuGlyIleValGly260265270ProIleCysSerGlnLysPro275<210>2<211>293<212>PRT<213>人工序列<400>2MetAlaArgPheGluAspProThrArgArgProTyrLysLeuProAsp151015LeuCysThrGluLeuAsnThrSerLeuGlnAspIleGluIleThrCys202530ValTyrCysLysThrValLeuGluLeuThrGluValPheGluPheAla354045ArgLysAspGlyPheValValTyrArgAspSerIleProHisAlaAla505560GlyHisLysCysIleAspPheTyrSerArgIleArgGluLeuArgHis65707580TyrSerAspSerValTyrMetTyrGlyProLysAlaThrLeuGlnAsp859095IleValLeuHisLeuGluProGlnAsnGluIleProValAspLeuGly100105110GlyGlyGluGlnLeuSerAspSerGluGluGluAsnAspGluIleAsp115120125GlyValAsnHisGlnHisLeuProAlaArgArgAlaGluProGlnArg130135140HisThrMetLeuCysMetGlyCysLysTyrSerArgIleArgGluLeu145150155160ArgHisTyrSerAspSerValTyrGlyAspThrLeuGluLysLeuThr165170175AsnThrGlyLeuTyrAsnLeuLeuIleArgCysLeuArgGlyGlnLys180185190ProLeuAsnProAlaGluLysLeuArgHisLeuAsnGluLysArgArg195200205PheHisAsnIleAlaGlyHisTyrArgGlyGlnCysHisSerCysCys210215220AsnArgAlaArgGlnGluArgLeuGlnArgArgArgGluThrGlnVal225230235240ArgAlaGluProGlnArgHisThrMetLeuCysMetGlyCysLysCys245250255GluAlaArgIleGluLeuValValGluSerSerAlaAspAspLeuArg260265270AlaPheGlnGlnLeuPheLeuSerThrLeuSerPheValGlyProTrp275280285CysAlaSerGlnGln290<210>3<211>180<212>PRT<213>人工序列<400>3GluProAlaValTyrPheLysGluGlnPheLeuAspGlyAspGlyTrp151015ThrSerArgTrpIleGluSerLysHisLysSerAspPheGlyLysPhe202530ValLeuSerSerGlyLysPheTyrGlyAspGluGluLysAspLysGly354045LeuGlnThrSerGlnAspAlaArgPheTyrAlaLeuSerAlaSerPhe505560GluProPheSerAsnLysGlyGlnThrLeuValValGlnPheThrVal65707580LysHisGluGlnAsnIleAspCysGlyGlyGlyTyrValLysLeuPhe859095ProAsnSerLeuAspGlnThrAspMetHisGlyAspSerGluTyrAsn100105110IleMetPheGlyProAspIleCysGlyProGlyThrLysLysValHis115120125ValIlePheAsnTyrLysGlyLysAsnValLeuIleAsnLysAspIle130135140ArgCysLysAspAspGluPheThrHisLeuTyrThrLeuIleValArg145150155160ProAspAsnThrTyrGluValLysIleAspAsnSerGlnValGluSer165170175GlySerLeuGlu180<210>4<211>156<212>PRT<213>人工序列<400>4ThrGlnAspCysSerPheGlnHisSerProIleSerSerAspPheAla151015ValLysIleArgGluLeuSerAspTyrLeuLeuGlnAspTyrProVal202530ThrValAlaSerAsnLeuGlnAspGluGluLeuCysGlyGlyLeuTrp354045ArgLeuValLeuAlaGlnArgTrpMetGluArgLeuLysThrValAla505560GlySerLysMetGlnGlyLeuLeuGluArgValAsnThrGluIleHis65707580PheValThrLysCysAlaPheGlnProProProSerCysLeuArgPhe859095ValGlnThrAsnIleSerArgLeuLeuGlnGluThrSerGluGlnLeu100105110ValAlaLeuLysProTrpIleThrArgGlnAsnPheSerArgCysLeu115120125GluLeuGlnCysGlnProAspSerSerThrLeuProProProTrpSer130135140ProArgProLeuGluAlaThrAlaProThrAlaPro145150155<210>5<211>837<212>DNA<213>人工序列<400>5atgtttcaggatccgcaagaacgtccgcgtaaactgccgcatctgtgtaccgaactgcag60accaccattcatgatatcattctggaatgcgtgtattgcaaacagcaactgctgcgtcgt120gaagtttatgattttgcacgtcgtgatggttgcattgtttatcgtgatggcaatccgtat180gcagttggtgataaatgcctgaaattctatagcaaaatcagcgagtatcgctactattgc240tatagcgttatgcatggtgataccccgaccctgcatgaatatatgctggatctgcagccg300gaaaccaccgatctgggtggtggtgaacagctgagcgatagcagcgaagaagaggacgaa360attgacggtccggcaggtcaggcagaaccggatcgtgcacattacaacattgttaccttt420ggttgtaaatgcgatttctatagcaaaatcagcgagtatcgctactattgctatagcgtt480tatggcaccaccctggaacagcagtataacaaaccgctgtgtgatctgctgattcgttgt540attaatcgtcagaaacctctgtgtccggaagaaaaacagcgtcatctggataaaaaacaa600cgctttcataatattcgtggtcgttggaccggtcgttgtatgagctgttgtcgtagcagc660cgtacccgtcgtgaaacccagctggatcgtgcacattacaacattgttacctttggttgt720aaatgcgatagcaccctgcgtctgtgtgttcagagcacccatgttgatattcgtaccctg780gaagatctgctgatgggcaccctgggtattgttggtccgatttgtagccagaaaccg837<210>6<211>879<212>DNA<213>人工序列<400>6atggcacgttttgaagatccgacccgtcgtccgtataaactgccggatctgtgtaccgaa60ctgaataccagcctgcaggatattgaaattacctgcgtttattgcaaaaccgttctggaa120ctgaccgaagtttttgaatttgcacgcaaagatggctttgtggtttatcgtgatagcatt180ccgcatgcagcaggtcataaatgcattgatttctatagccgtattcgtgaactgcgccat240tattcagatagcgtttatatgtatggtccgaaagcaaccctgcaggatattgttctgcat300ctggaaccgcagaatgaaattccggttgatctgggtggtggtgaacagctgagcgatagc360gaagaagaaaacgacgaaattgatggtgtgaatcatcagcatctgcctgcacgtcgtgcc420gaaccgcagcgtcataccatgctgtgtatgggttgtaaatatagccgta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