本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種乳腺癌檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
：乳腺癌是一種全身性疾病、其發(fā)生和發(fā)展是一個涉及多因素、多環(huán)節(jié)的復(fù)雜過程，包括癌基因的激活以及抑癌基因的失活等。因此，基因突變在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起著非常重要的作用。乳腺癌是一個多因素遺傳變異性疾病，只有不足10％是由于單基因缺陷引起的。隨著高通量基因技術(shù)的發(fā)展，越來越多與乳腺癌相關(guān)基因被發(fā)現(xiàn)，這些基因上潛在的遺傳變異(單核苷酸多態(tài)和拷貝數(shù)變異)可能引起乳腺癌藥物治療效果的差異。由于遺傳變異的存在使抗腫瘤藥物的代謝途徑以及藥物作用的目標基因可能受到影響，進而影響療效以及預(yù)后。SNP(singlenucleotidepolymorphism,SNP，即單核苷酸多態(tài)性)是1996年由美國麻省理工學(xué)院的人類基因組研究中心學(xué)者Lander提出的一類分子遺傳標記，主要是指基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。SNP表現(xiàn)出的多態(tài)性僅涉及到單個堿基的變異，表現(xiàn)是有轉(zhuǎn)換、顛換、插入和缺失等。單核苷酸多態(tài)性為第三代遺傳標志，人體許多表型差異、對藥物或疾病的易感性等等都可能與SNP有關(guān)。目前對于不同分型乳腺癌預(yù)后、療效的預(yù)測性研究主要集中在SNP水平。SNP賦予個體對環(huán)境暴露、藥物治療等的不同反應(yīng)，從而產(chǎn)生不同的表型，因此SNP可能是導(dǎo)致個體疾病發(fā)生發(fā)展差異的重要遺傳基礎(chǔ)。利用疾病易感的SNP譜診斷疾病，具有快速、靈敏、準確等特點，因而應(yīng)用前景廣闊。近年來，利用SNP診斷疾病的發(fā)生發(fā)展已成為臨床和科研工作者的研究熱點。然而，目前還沒有將SNP應(yīng)用于乳腺癌診斷的報道，若能篩選出乳腺癌易感的SNP作為生物標志物，并研制相應(yīng)的診斷試劑盒，必將有力地推動我國乳腺癌早期診斷的現(xiàn)狀，并為其藥物篩選、藥效評價及靶向治療開辟新的途徑。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是針對上述技術(shù)問題，提出一種乳腺癌檢測試劑盒。發(fā)明人通過分離和研究乳腺癌患者及與其年齡匹配的健康女性對照外周血DNA中的單核苷酸多態(tài)性，尋找一組與乳腺癌高度相關(guān)的高特異性和敏感性的SNP，并研制出可便于臨床應(yīng)用的乳腺癌預(yù)后檢測試劑盒，為乳腺癌的檢測提供數(shù)據(jù)支持。本發(fā)明的目的是通過下列技術(shù)方案實現(xiàn)的：一種乳腺癌檢測試劑盒，其包括檢測樣本中TCHH基因易感SNP位點(1)和易感SNP位點(2)的基因型的試劑。所述TCHH基因易感SNP位點(1)具體信息為rs181128140，NM_007113:exon3:c.G4646C:p.R1549P；所述TCHH基因易感SNP位點(2)具體信息為NM_007113:exon3:c.G4678A:p.E1560K。本發(fā)明提供的兩個易感SNP位點都是位于人類第1染色體的NM_007113轉(zhuǎn)錄本上，其中，易感SNP位點(1)是第152081047位堿基由G到C的SNP位點錯義突變，易感SNP位點(2)是第152081015位堿基由G到A的SNP位點錯義突變。其中，TCHH(trichohyalin，毛透明蛋白)，NCBI數(shù)據(jù)庫RefSeq提供的信息顯示：由這個基因編碼的蛋白質(zhì)可形成交聯(lián)復(fù)合物，這個交聯(lián)復(fù)合物自身和角蛋白中間纖維可為毛囊內(nèi)根鞘提供機械支持強度。該編碼蛋白質(zhì)對保持舌絲狀乳頭的結(jié)構(gòu)完整性也起著重要的作用。這個基因的缺陷是導(dǎo)致不可融合頭發(fā)綜合癥的原因。(由,2017年2月)此外，由UniProt-GOA提供geneontology分析表明該基因參與許多生物學(xué)過程如角質(zhì)化等，具有鈣離子結(jié)合功能。進一步地，本發(fā)明還提供了分別包括兩個易感SNP位點的試劑盒。優(yōu)選的，所述試劑盒可以為采用本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)檢測SNP的試劑，只要其能夠檢出樣本中易感SNP位點(1)和/或易感SNP位點(2)是否存在等位基因突變。其包括但不限于下面列舉的各實施方式。在第一實施方式中，該試劑盒包括利用測序法檢測樣本中易感SNP位點(1)位點C等位基因存在，和/或易感SNP位點(2)位點A等位基因存在的試劑。測序法是本領(lǐng)域所公知的技術(shù)，所需的引物等試劑，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員均可根據(jù)需要自行選擇(參見ABI、Beckman等公司測序儀相關(guān)使用說明)，在此不再贅述。利用該試劑盒，通過測序法可以直接測得樣本中易感SNP位點(1)和/或易感SNP位點(2)的序列，從而判斷其是否攜帶相應(yīng)位點等位基因的變異，進而判斷其肥胖的易感性。在第二實施方式中，所述試劑盒包括利用Taqman探針SNP檢測法檢測樣本中易感SNP位點(1)和/或易感SNP位點(2)基因型的試劑。其中所用Taqman探針為針對易感SNP位點(1)和/或易感SNP位點(2)設(shè)計的探針，該探針可以使用試劑公司提供的探針；也可使用軟件自行設(shè)計，如PREMIERBiosoft公司的BeaconDesigner7.5。在第三實施方式中，所述試劑盒為利用PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性法檢測樣本中易感SNP位點(1)和/或易感SNP位點(2)基因型的試劑盒。該試劑盒中包括用于擴增易感SNP位點(1)和/或易感SNP位點(2)的引物，PCR試劑、對照樣本和檢測構(gòu)象的電泳所需試劑。所述電泳優(yōu)選非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。對照樣本中包括陰性或陽性純和對照樣本，此外還可以包括也可以不包括雜合子相應(yīng)雜合子的對照樣本。優(yōu)選同時包括上述三類對照樣本。待測樣本擴增產(chǎn)物與對照樣本的擴增產(chǎn)物同時電泳，比較其電泳結(jié)果可以得出待測樣本中是否攜帶相應(yīng)等位基因變異的檢測結(jié)果。上述第一、第二和第三實施方式的試劑盒中包括設(shè)計用于擴增易感SNP位點(1)和/或易感SNP位點(2)的引物，該引物具有如下特征：1)擴增產(chǎn)物長度在100-350bp之間；2)引物長度在15～30堿基之間；3)G+C含量在40％～60％之間；4)堿基隨機分布；5)引物自身不能有連續(xù)4個堿基的互補；和6)引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補。該引物可以采用軟件來設(shè)計，(如使用Primer5、Oligo6等)，例如，優(yōu)選的，本發(fā)明選用如SEQIDNO：1-2所示引物對能同時檢測出兩個易感位點的基因型。此外，本發(fā)明提供了所述引物對在制備乳腺癌檢測試劑盒中的用途，如果樣本中檢測到易感SNP位點(1)攜帶C等位基因和易感SNP位點(2)攜帶A等位基因的存在，則說明提供該樣本的個體乳腺癌預(yù)后不好。所制備試劑盒為上述試劑盒中的至少一種，也可以是利用其他本領(lǐng)域已知的技術(shù)鑒定該SNP存在的其他試劑盒。本發(fā)明有益效果：本發(fā)明研究SNP在乳腺癌檢測中的應(yīng)用前景，闡述SNP對于乳腺癌進展的影響，揭示其診斷價值。因此，本發(fā)明通過SNP基因型檢測試劑盒的研制和應(yīng)用，可使得乳腺癌的診斷更加方便易行，為臨床醫(yī)生快速準確掌握患者病情，為臨床治療效果評價奠定基礎(chǔ)，并為發(fā)現(xiàn)具有潛在治療價值的新型小分子藥物靶標提供幫助。具體實施方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。本發(fā)明的技術(shù)方案具體包括：采集符合標準的血液樣本，系統(tǒng)收集完整的人口學(xué)資料和臨床資料；基因型檢測：選擇乳腺癌病例、與乳腺癌病例年齡匹配的健康女性對照，利用外顯子測序，找出與乳腺癌相關(guān)的SNP；對篩選出的陽性關(guān)聯(lián)SNP，進一步采用基因分型進行檢測，驗證其應(yīng)用于臨床診斷的可重復(fù)性；乳腺癌輔助診斷試劑盒的研制：根據(jù)乳腺癌病例和健康女性對照中基因型分布頻率有顯著差異的SNP開發(fā)SNP輔助診斷試劑盒。數(shù)據(jù)分析中各數(shù)值表示如下：1、ljb23_sift：SIFT分值(version2.3)，表示該變異對蛋白序列的影響，包含三個值，一是SIFT初始分值，二是轉(zhuǎn)換后的值(1-SIFT)，三是T或者D。當該變異同時影響多個蛋白序列時，對每條蛋白序列有一個SIFT值，取最小值。SIFT分值越小越“有害”，表明該SNP導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)或功能改變的可能性大；D:Deleterious(sift<＝0.05)；T:tolerated(sift>0.05))；2、ljb23_pp2hvar：利用PolyPhen2基于HumanVar數(shù)據(jù)庫預(yù)測該變異對蛋白序列的影響，用于單基因遺傳病。該列包含兩個值，第一個是PolyPhen2分值，數(shù)值越大越“有害”，表明該SNP導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)或功能改變的可能性大；第二個是D或P或B(D:Probablydamaging(>＝0.909),P:possiblydamaging(0.447<＝pp2_hvar<＝0.909)；B:benign(pp2_hvar<＝0.446))；3、ljb23_pp2hdiv：利用PolyPhen2基于HumanDiv數(shù)據(jù)庫預(yù)測該變異對蛋白序列的影響，用于復(fù)雜疾病。該列包含兩個值，第一個是PolyPhen2分值，數(shù)值越大越“有害”，表明該SNP導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)或功能改變的可能性大；第二個是D或P或B(D:Probablydamaging(>＝0.957),P:possiblydamaging(0.453<＝pp2_hdiv<＝0.956)；B:benign(pp2_hdiv<＝0.452))；4、ljb23_mt：tionTaster分值(version2.3)，表示該變異對蛋白序列的影響，包含三個值，一是MutationTaster初始分值，二是轉(zhuǎn)換后的值，三是A、D、N或者P。第二個值越大越“有害”，表明該SNP導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)或功能改變的可能性大，其中"A"("diseasecausingautomatic")；"D"("diseasecausing")；"N"("polymorphism")；"P"("polymorphismautomatic")。具體來說研究的實驗方法主要包括以下幾個部分：1.研究樣本的選擇(1)經(jīng)病理學(xué)明確診斷的乳腺癌病例25例和與乳腺癌病例年齡匹配的健康女性10例作為對照，其中乳腺癌病例中有3例病人具有癌癥家族史；(2)采血前未接受過放療或化療、無既往腫瘤病史；(3)與病例年齡匹配的健康女性對照2.酚-氯仿法提取外周血基因組DNA，按常規(guī)方法操作。通常能得到20-50ng/μLDNA，純度(紫外2600D：2800D)在1.6-2.0。3.全外顯子芯片檢測(1)取受試者全基因組DNA樣本；(2)在全外顯子芯片(北京諾禾致源科技股份有限公司，下同)上進行掃描；(3)檢測并比較各基因型在乳腺癌病例與健康女性對照中的分別差異。4.單個SNP的基因分型(1)取受試者DNA樣本；(2)設(shè)計單個SNP的特異性擴增引物；(3)進行PCR反應(yīng)，回收產(chǎn)物進行測序；(4)比較乳腺癌病例與健康女性對照中不同基因型的分布差異。5.診斷試劑盒制備方法全外顯子芯片進行掃描和單個SNP檢測后確定乳腺癌病例與健康女性對照中基因型分布頻率有顯著差異的SNP，作為乳腺癌診斷的指標。篩選出的與乳腺癌預(yù)后有關(guān)的SNP輔助診斷試劑盒，其包括檢測位于TCHH基因兩個易感SNP位點基因型的試劑，診斷試劑盒還可以包括這些SNP的特異性擴增引物，以及Taq酶、dNTPs等試劑。6.臨床應(yīng)用例利用本發(fā)明人制備的乳腺癌檢測試劑盒檢測乳腺癌患者的情況并與實際臨床檢測相比較以確定了乳腺癌檢測試劑盒的有效性。具體包括測定受試者血標本cDNA中上述SNP的特異性擴增引物和其他檢測試劑，為臨床醫(yī)生快速準確掌握患者的疾病狀態(tài)和病情嚴重程度，及時采取更具個性化的防治方案提供支持。實施例1樣品的收集和樣品資料的整理發(fā)明人于2010年1月至2015年12月在深圳市第二人民醫(yī)院收集了大量的新發(fā)乳腺癌患者血標本，通過對樣品資料的整理，發(fā)明人從中選擇了25例符合下列標準的樣本，同時選擇10例年齡在25-55歲健康女性作對照進行全外顯子芯片檢測，樣本選擇標準如下：1、經(jīng)病理學(xué)明確診斷的乳腺癌病例，其中有3例病人具有癌癥家族史并分別標記為X1、X2、X3；2、采血前未接受過放療或化療、無既往腫瘤病史；3、與病例年齡匹配的健康女性對照并系統(tǒng)采集了這些樣本的人口學(xué)資料和臨床資料等情況。實施例2外周血DNA的提取和純化在上述符合條件的25例乳腺癌患者和10例健康女性對照中，兩組年齡均衡可比。具體步驟為：1、向儲存于2mL凍存管中的外周血加入溶血試劑(即裂解液，40份量配置方法如下：蔗糖219.72g、氯化鎂2.02g和曲拉通X-100(amresco0694)20mL混合后，用TrisHcl溶液定容至2000mL，下同)，顛倒混勻后完全轉(zhuǎn)入。2、去除紅細胞：用溶血試劑將5mL離心管補至4mL，顛倒混勻，4000rpm離心10分鐘，棄上清。向沉淀中加入4mL溶血試劑，再次顛倒混勻清洗一次，4000rpm離心10分鐘，棄上清。3、抽提DNA：向沉淀中加1mL抽提液(每300mL中含有122.5mL0.2M氯化鈉，14.4mL0.5M乙二胺四乙酸，15mL10％十二烷基硫酸鈉，148.1mL雙蒸水，下同)和8μL蛋白酶K，振蕩器上充分振蕩混勻，37℃水浴過夜。4、去除蛋白質(zhì)：加1mL飽和酚充分混勻(手輕搖15分鐘)，4000rpm離心10分鐘，取上清轉(zhuǎn)入新的5mL離心管中。在上清液中加入等體積氯仿與異戊醇混合液(氯仿：異戊醇＝24:1，v/v，下同)，充分混勻后(手搖15分鐘)，4000rpm離心10分鐘，取上清(分入兩個1.5mL的離心管)。5、DNA沉淀：在上清液中加入3M的醋酸鈉60μL，再加入與上清液等體積的冰無水乙醇，上下輕搖，可見白色絮狀沉淀物，再以12000rpm離心10min。6、DNA洗滌：在沉淀中加入冰無水乙醇1mL，12000rpm離心10min，棄上清后真空抽干或置于清潔干燥環(huán)境中蒸干。7、測量濃度：通常能得到20-50ng/μLDNA，純度(紫外2600D：2800D)在1.8-2.0。實施例3SNP的全外顯子組檢測將實施例2中兩組人群經(jīng)全外顯子芯片檢測獲得相關(guān)結(jié)果。1、文庫構(gòu)建北京諾禾致源科技股份有限公司采用Agilent的液相芯片捕獲系統(tǒng)，對人的全外顯子區(qū)域DNA進行高效富集，然后在IlluminaHiseq平臺上進行高通量、高深度測序。建庫和捕獲實驗采用AgilentSureSelectHumanAllExonV5試劑盒，嚴格使用說明書推薦的試劑和耗材，并參照最新的經(jīng)過優(yōu)化的實驗流程進行操作。實驗基本流程：將基因組DNA經(jīng)Covaris破碎儀隨機打斷成長度為180-280bp的片段，經(jīng)末端修復(fù)和加A尾后在片段兩端分別連接上接頭制備DNA文庫。帶有特異index的文庫pooling后與多達543,872個生物素標記的探針進行液相雜交，再使用帶鏈霉素的磁珠將20,965個基因的334,378個外顯子捕獲下來，經(jīng)PCR線性擴增后進行文庫質(zhì)檢，合格即可進行上機測序。2、庫檢文庫構(gòu)建完成后，先使用Qubit2.0進行初步定量，稀釋文庫至1ng/μL，隨后使用Agilent2100對文庫的insertsize進行檢測，insertsize符合預(yù)期后，使用Q-PCR方法對文庫的有效濃度進行準確定量(文庫有效濃度>2nM)，以保證文庫質(zhì)量。3、上機測序庫檢合格，根據(jù)文庫的有效濃度及數(shù)據(jù)產(chǎn)出需求進行IlluminaHiseq平臺測序。4、數(shù)據(jù)分析與處理經(jīng)過數(shù)據(jù)篩選、深度加工和生物信息學(xué)序列比對，最終確定“乳腺癌病例”組和“健康女性對照”組中發(fā)現(xiàn)的基因型分布頻率有顯著差異的53個SNP位點為優(yōu)選敏感級位點。其中，位于TCHH基因上的兩個SNP突變，該位點變異對蛋白影響值如表1所示：表1SNP突變位點變異對蛋白影響值編號ljb23_siftljb23_pp2hvarljb23_pp2hdivljb23_mt易感SNP位點(1)0.26,0.74,T0.519,P0.924,P1,0.0,N易感SNP位點(2)0.81,0.19,T0.766,P0.991,D1,0.0,N該位點經(jīng)過生物信息學(xué)分析，可以確認為乳腺癌候選標志物。實施例4利用危險度評分方法進一步分析SNP與乳腺癌的發(fā)病風險本發(fā)明人通過對2組樣品(“乳腺癌病例組”和“健康女性對照組”)基因型分布頻率的比較，選擇陽性關(guān)聯(lián)的SNP，以全外顯子掃描樣本中單個SNP回歸系數(shù)為權(quán)重，進一步求得危險分值，繪制ROC來評價診斷的靈敏性和特異性，進而診斷這些SNP對乳腺癌發(fā)病的判斷能力。對所有SNP標志物的聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)兩個易感SNP位點靈敏度和特異度都達到60％以上。因此，本發(fā)明人證明了該位點標志物能夠很好地將健康女性對照和乳腺癌患者區(qū)分。實施例5單個SNP的基因分型1、取5例乳腺癌患者和5例健康女性對照DNA樣本同實施例2；2、PCR擴增利用NCBI網(wǎng)站提供的在線引物設(shè)計軟件https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi？LINK_LOC＝BlastHomeAd對EME1:NM_001166131:exon9:c.G1738C設(shè)計單個SNP的特異性擴增引物如表2所示。表2引物序列PCR反應(yīng)體系如表3所示。PCR擴增程序為：95℃預(yù)變性10min，94℃變性15s，60℃退火15s，72℃延伸30s，進行30個循環(huán)，最后72℃延伸30min，于4℃保存，過夜需放置-20℃冷凍。表3反應(yīng)體系組分加入量2×mix25μL上游引物(10uM)3.0μL下游引物(10uM)3.0μL模板5μL加入滅菌蒸餾水至50μL3、測序PCR擴增結(jié)束后，取5μL擴增產(chǎn)物，1％瓊脂糖凝膠電泳，電泳30min，染色20min，然后將凝膠塊置于凝膠成像儀中觀察，根據(jù)比對Marker的片段大小情況，初步判斷擴增片段是否正確。進而對符合要求的擴增產(chǎn)物進行純化：采用Mag-BindOligonucleotidePurificationKit試劑盒，并按試劑盒要求進行操作。上樣測序：采用ABI公司BigDye3.1SequencingKit試劑盒，并按試劑盒要求進行操作；用ABI公司3730型測序儀進行測序。4、結(jié)果分析通過Chromas序列分析軟件，將測序結(jié)果與標準序列進行比對，尋找SNP位點，通過分析SNP位點處堿基的類型，就可以得到SNP位點的基因型。結(jié)果顯示該兩個位點的變異為真實存在的變異。從而進一步確認這兩個易感SNP位點可用于乳腺癌的檢測、治療、診斷、預(yù)后評估等輔助診斷。實施例6用于乳腺癌SNP試劑盒的制作基于實施例5得到的引物組，組裝本發(fā)明所述的用于乳腺癌的試劑盒，所述試劑盒包括特異擴增兩個易感SNP位點的引物對如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示。所述試劑盒還可以有相應(yīng)PCR技術(shù)所需的常用試劑，如：dNTPs，MgCl2，雙蒸水，Taq酶等，這些常用試劑都是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，另外還可以有標準品和對照(如確定基因型的標準品和空白對照等)。此試劑盒的價值在于只需要外周血而不需要其他組織樣品，通過最精簡和特異的引物對檢測SNP，再通過SNP譜輔助判斷乳腺癌，不僅穩(wěn)定，檢測方便，且精確，大大提高疾病診斷的敏感性和特異性，因此將此試劑盒投入實踐，可以幫助指導(dǎo)診斷和更有效的個體化治療。實施例7試劑盒的應(yīng)用2010年1月至2015年12月在深圳市第二人民醫(yī)院收集10例乳腺癌患者治療前和治療后的血液樣品，利用實施例6所述的試劑盒檢測TCHH基因的兩個易感SNP位點的基因型，考察該試劑盒用于檢測乳腺癌檢測的效果。結(jié)果如下：由表4可知，試劑盒用于乳腺癌檢測的結(jié)果與臨床評價結(jié)果的符合率達90％。表4SNP位點檢測用于胰腺癌療效評估患者編號易感SNP位點(1)易感SNP位點(2)臨床診斷結(jié)果1CA確診乳癌2CA確診乳癌3CA確診乳癌4CA確診乳癌5CA確診乳癌6CG未確診乳癌7CA確診乳癌8GG未確診乳癌9CA確診乳癌10CA確診乳癌雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。序列表<110>深圳市第二人民醫(yī)院<120>一種乳腺癌檢測試劑盒<130>P16rxa98<160>2<170>PatentInversion3.5<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>1tgcgcagtcaggaaccag18<210>2<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>2gttggccctcctggcg16當前第1頁1 2 3