本發(fā)明涉及一種通過光調(diào)控精確檢測(cè)線粒體內(nèi)H₂S₂的熒光探針及其制備方法和應(yīng)用，屬于有機(jī)熒光探針領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

硫化氫是繼NO與CO之后的第三個(gè)被確認(rèn)的人體氣體信號(hào)分子，在神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)過程中起著十分重要的調(diào)節(jié)作用。同時(shí)硫化氫還被發(fā)現(xiàn)在心血管系統(tǒng)中也具有許多重要的生理功能，如調(diào)節(jié)血管平滑肌的舒張、抗氧化、抑制發(fā)炎、降低新陳代謝速率等。硫化氫水平異常還被認(rèn)為與阿爾茲海默氏癥、唐氏綜合癥、糖尿病和肝硬化等密切相關(guān)。硫化氫的生理學(xué)和病理學(xué)功能研究已經(jīng)成為目前化學(xué)與生物學(xué)研究的熱點(diǎn)，而發(fā)展準(zhǔn)確快捷的硫化氫檢測(cè)方法成為該領(lǐng)域的關(guān)鍵課題之一。

由于硫化氫的pKa1約為7.04，在生理(pH 7.40)條件下硫化氫會(huì)發(fā)生脫質(zhì)子解離作用，胞內(nèi)H₂S與HS^-的比例約為1∶2(nH₂S∶nHS^-)。因此文獻(xiàn)中常以NaHS或Na₂S作為H₂S供體進(jìn)行探針響應(yīng)性能的研究,本文也同樣使用Na₂S₂作為H₂S₂供體進(jìn)行探針響應(yīng)性能的研究。

線粒體在生命中的重要角色，促使它一直作為科學(xué)研究中的重中之重。在線粒體的研究中，多以熒光探針主，一個(gè)理想的熒光探針是無數(shù)個(gè)科學(xué)家的夢(mèng)想，至今已經(jīng)報(bào)道出來了很多熒光探針，如檢測(cè)活性氧簇、活性氮簇、金屬離子，生物小分子等的熒光探針，但是這些熒光探針都存在一個(gè)致命的缺點(diǎn)就是在經(jīng)過細(xì)胞質(zhì)靶向線粒體的過程中不能避免來自細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的被檢測(cè)物的干擾，造成研究結(jié)果缺乏說服力。為了解決這一存在已久的問題，急需研發(fā)一種可以定位線粒體又能避免細(xì)胞質(zhì)內(nèi)被檢測(cè)物的熒光探針。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明解決的技術(shù)問題是：提出一種可定位活細(xì)胞中線粒體，并通過光調(diào)控精確檢測(cè)線粒體內(nèi)H₂S₂的熒光探針及其制備方法和應(yīng)用。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提出的技術(shù)方案是：一種通過光調(diào)控精確檢測(cè)線粒體內(nèi)H₂S₂的熒光探針，其特征在于，所述的熒光探針為Mito-H₂S₂熒光探針，Mito-H₂S₂熒光探針的結(jié)構(gòu)式如(Ⅰ)所示：

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提出的技術(shù)方案是：所述的通過光調(diào)控精確檢測(cè)線粒體內(nèi)的H₂S₂熒光探針的制備方法所述的Mito-H₂S₂熒光探針的制備方法包括如下步驟：將熒光素衍生化合物和4-疊氮丁基三苯基膦依次加入到乙腈中，常溫?cái)嚢?-12h，冷卻抽濾，除去溶劑，經(jīng)硅膠柱層析提純得到目標(biāo)產(chǎn)物Mito-H₂S₂熒光探針，反應(yīng)式如下：

優(yōu)選的，所述熒光素衍生化合物和4-疊氮丁基三苯基膦的摩爾比值為0.8-1:1。

優(yōu)選的，所述的熒光素衍生物的制備方法如下：

(1)將熒光素溶解在N,N-二甲基甲酰胺DMF中，然后加入K₂CO₃和溴丙基炔，其中溴丙基炔有80％的體積比在甲苯中，溴丙基炔然后在60℃下攪拌1-3h，用水沖淡反應(yīng)混合物，然后萃取旋干，經(jīng)過膠柱層析提純得到熒光素單溴丙炔，

(2)在冰浴中將1-乙基-3(3-二甲基丙胺)碳二亞胺EDCI加入二氯甲烷中，然后加入光保護(hù)基團(tuán)和4-二甲氨基吡啶DMAP攪拌10-30min，熒光素單溴丙炔最后加入，攪拌20-28h，然后過濾，用二氯甲烷沖洗，濾液被選干，然后經(jīng)硅膠柱層析提純得到光保護(hù)熒光素單溴丙炔。

優(yōu)選的，所述步驟(1)中熒光素與溴丙基炔的摩爾比值為1:1-1.2，溴丙基炔不能過多，會(huì)產(chǎn)生過多雜點(diǎn)。

優(yōu)選的，所述步驟(2)中熒光素單溴丙炔、光保護(hù)基團(tuán)的摩爾比為1:1-1.3，其中注意光保護(hù)基團(tuán)的羧基注意活化，有利于光保護(hù)熒光素單溴丙炔的產(chǎn)率。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提出的技術(shù)方案是：所述的通過光調(diào)控精確檢測(cè)線粒體內(nèi)H₂S₂熒光探針的應(yīng)用，所述的熒光探針可應(yīng)用于生理體系中精確檢測(cè)線粒體內(nèi)的H₂S₂。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明的熒光探針具有較好的線粒體靶向性、化學(xué)穩(wěn)定性、生物兼容性和H₂S₂選擇性。激光共聚焦成像實(shí)驗(yàn)表明該探針具有較好的細(xì)胞通透性，對(duì)細(xì)胞和生物體無毒副作用。

本發(fā)明的熒光探針在可應(yīng)用于細(xì)胞體系中通過光調(diào)控精確檢測(cè)線粒體內(nèi)的H₂S₂而避免來自細(xì)胞質(zhì)中H₂S₂的干擾的應(yīng)用。

本發(fā)明的精確測(cè)線粒體內(nèi)H₂S₂的熒光探針可用于活細(xì)胞線粒體H₂S₂的精確檢測(cè)，主要用的活細(xì)胞為Hela細(xì)胞株。

激光共聚焦成像實(shí)驗(yàn)表明該探針具有較好的細(xì)胞通透性，對(duì)細(xì)胞和生物體無毒副作用,可以實(shí)現(xiàn)亞細(xì)胞水平活性氧水平的檢測(cè)，并進(jìn)一步應(yīng)用于神經(jīng)退行性疾病及癌癥的研究。

附圖說明

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的作進(jìn)一步說明。

圖1是實(shí)施例1制備的Mito-H₂S₂(10uM)在UV光照150秒后對(duì)40um的Na₂S₂濃度的PBS的緩沖溶液的不同響應(yīng)時(shí)間的熒光光譜圖。

圖2是實(shí)施例1制備的Mito-H₂S₂(10uM)光照150秒后對(duì)100um的各種離子的PBS的緩沖溶液的響應(yīng)的熒光光譜圖。

圖3是實(shí)施例1制備的Mito-H₂S₂(10uM)在細(xì)胞線粒體中的共聚焦顯微成像。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

通過光調(diào)控精確檢測(cè)線粒體內(nèi)H₂S₂的熒光探針的制備方法如下：

(1)將0.8g熒光素溶解在N,N-二甲基甲酰胺DMF中，然后加入0.93g的K₂CO₃和0.18ml的溴丙基炔，其中溴丙基炔有80％的體積比在甲苯中，然后在60℃下攪拌1h，用水沖淡反應(yīng)混合物，然后萃取旋干，經(jīng)硅膠柱層析提純得到熒光素單溴丙炔。1H NMR(300MHz,CDCl₃):δ10.14(s,1H),8.02(t,J＝6Hz,1H),7.82(t,J＝7.5Hz,1H),7.75(t,J＝7.5Hz,1H),7.30(d,J＝6Hz,1H),7.01(d,J＝3Hz,1H),6.74(m,3H)6.58(s,1H),4.89(d,J＝1.5Hz,2H),3.62(d,J＝1.5Hz,1H)。

(2)在冰浴中將106mg的N,N-二甲基甲酰胺EDCI加入10ml的二氯甲烷中，然后加入193.9mg的光保護(hù)基團(tuán)和7mg的4-二甲氨基吡啶DMAP攪拌10min，250mg的熒光素單溴丙炔最后加入攪拌22h，然后過濾，用二氯甲烷沖洗，濾液被選干，然后經(jīng)硅膠柱層析提純得到光保護(hù)熒光素單溴丙炔。1H NMR(300MHz,CDCl₃):δ8.07(t,J＝7.5Hz,2H),7.96(d,J＝4.5Hz,1H),7.71(dd,J₁＝3.8Hz,J₂＝7.5Hz,2H),7.59(t,J＝7.9Hz,1H),7.35(m,5H),7.19(d,J＝7.2Hz,1H),7.10(s,1H),6.89(s,1H),6.80(s,2H),6.76(t,J＝5.7Hz,2H),5.07(s,2H),4.74(s,2H),4.84(s,2H),3.65(d,J＝1.5Hz,1H)。

(3)將71.11mg的熒光素衍生化合物和50mg的4-疊氮丁基三苯基膦依次加入到3ml的乙腈中，常溫?cái)嚢?小時(shí)，冷卻抽濾，除去溶劑，經(jīng)硅膠柱層析提純得到目標(biāo)產(chǎn)物Mito-H₂S₂熒光探針，1H NMR(300MHz,CDCl₃):δ8.25(t,J＝4.5Hz,2H),8.16(d,J＝4.5Hz,1H),8.07(d,J＝4.5Hz,1H),7.90(m,3H),7.84(m,14H),7.36(t,J＝1.8Hz,2H),7.31(dd,J₁＝4.5Hz,J₂＝3.9Hz,3H),7.26(t,J＝4.0Hz,3H),7.15(d,J＝1.5Hz,1H),7.07(dd,J₁＝2.6Hz,J₂＝2.6Hz,1H),6.91(d,J＝5Hz,1H),6.84(dd,J₁＝2.7Hz,J₂＝2.7Hz,1H),6.76(d,J＝5.1Hz,1H),5.24(s,2H),4.99(s,2H),4.45(s,4H),2.03(m,2H),1.60(m,2H),1.53(m,2H)。

實(shí)施例2

通過光調(diào)控精確測(cè)線粒體內(nèi)H₂S₂的熒光探針的制備方法如下：

(1)將1g熒光素溶解在4.5ml的N,N-二甲基甲酰胺DMF溶液中，然后加入1.16g的K₂CO₃和0.244ml的溴丙基炔，其中溴丙基炔有80％的體積比在甲苯中，然后在60℃下攪拌3h，用水沖淡反a應(yīng)混合物，然后萃取旋干，經(jīng)硅膠柱層析提純得到熒光素單溴丙炔；

(2)在冰浴中將53.75mg的N,N-二甲基甲酰胺EDCI加入5ml的二氯甲烷中，然后加入114mg的光保護(hù)基團(tuán)和3.42mg的4-二甲氨基吡啶DMAP攪拌20min，128mg的熒光素單溴丙炔最后加入攪拌26h，然后過濾，用二氯甲烷沖洗，濾液被選干，然后經(jīng)硅膠柱層析提純得到光保護(hù)熒光素單溴丙炔。

(3)將156.8mg的熒光素衍生化合物和100mg的4-疊氮丁基三苯基膦依次加入到4ml的乙腈中，常溫?cái)嚢?0小時(shí)，冷卻抽濾，除去溶劑，經(jīng)硅膠柱層析提純得到目標(biāo)產(chǎn)物Mito-H₂S₂熒光探針。

實(shí)施例3

通過光調(diào)控精確測(cè)線粒體內(nèi)H₂S₂的熒光探針的制備方法如下：

(1)將1.8g熒光素溶解在9ml的N,N-二甲基甲酰胺DMF溶液中，然后加入2.33g的K₂CO₃和0.455ml的溴丙基炔，其中溴丙基炔有80％的體積比在甲苯中，然后在60℃下攪拌4h，用水沖淡反應(yīng)混合物，然后萃取旋干，經(jīng)硅膠柱層析提純得到熒光素單溴丙炔；

(2)在冰浴中將107.5mg的N,N-二甲基甲酰胺EDCI加入10ml的二氯甲烷中，然后加入236mg的光保護(hù)基團(tuán)和6.85mg的4-二甲氨基吡啶DMAP攪拌30min，249.06mg的熒光素單溴丙炔最后加入攪拌20h，然后過濾，用二氯甲烷沖洗，濾液被選干，然后經(jīng)硅膠柱層析提純得到光保護(hù)熒光素單溴丙炔。

(3)將400mg的熒光素衍生化合物和225mg的4-疊氮丁基三苯基膦依次加入到10ml的乙腈中，常溫?cái)嚢?1小時(shí)，冷卻抽濾，除去溶劑，經(jīng)硅膠柱層析提純得到目標(biāo)產(chǎn)物Mito-H₂S₂熒光探針。

實(shí)施例4

通過光調(diào)控精確測(cè)線粒體內(nèi)H₂S₂的熒光探針的制備方法如下：

(1)將8.6g熒光素溶解在45ml的N,N-二甲基甲酰胺DMF溶液中，然后加入11.65g的K₂CO₃和2.4ml的溴丙基炔，其中溴丙基炔有80％的體積比在甲苯中，然后在60℃下攪拌4h，用水沖淡反應(yīng)混合物，然后萃取旋干，經(jīng)硅膠柱層析提純得到熒光素單溴丙炔；

(2)在冰浴中將537.5mg的N,N-二甲基甲酰胺EDCI加入50ml的二氯甲烷中，然后加入1246mg的光保護(hù)基團(tuán)和34mg的4-二甲氨基吡啶DMAP攪拌25min，1236mg的熒光素單溴丙炔最后加入攪拌28h，然后過濾，用二氯甲烷沖洗，濾液被旋干，然后經(jīng)硅膠柱層析提純得到光保護(hù)熒光素單溴丙炔；

(3)將1.56g的熒光素衍生化合物和1g的4-疊氮丁基三苯基膦依次加入到30ml的乙腈中，常溫?cái)嚢?2小時(shí)，冷卻抽濾，除去溶劑，經(jīng)硅膠柱層析提純得到目標(biāo)產(chǎn)物Mito-H₂S₂熒光探針。

實(shí)施例5

通過光調(diào)控精確測(cè)線粒體內(nèi)H₂S₂的熒光探針對(duì)H₂S₂的響應(yīng)檢測(cè)：

1、Mito-H₂S₂對(duì)10當(dāng)量Na₂S₂不同響應(yīng)時(shí)間的熒光響應(yīng)(圖1)：

用緩沖溶液配制10uM Mito-H₂S₂的H₂S₂探針，UV光照150秒后,加入10當(dāng)量的Na₂S₂，用熒光分光光度法分別測(cè)試響應(yīng)60分鐘、80分鐘、100分鐘、120分鐘的熒光強(qiáng)度，并繪制Mito-H₂S₂對(duì)4當(dāng)量的Na₂S₂不同響應(yīng)時(shí)間的熒光光譜圖。結(jié)果描述：這里說明Mito-H₂S₂的探針再響應(yīng)120分鐘后會(huì)達(dá)到反應(yīng)的最大值。

2、Mito-H₂S₂對(duì)10當(dāng)量不同金屬離子的熒光響應(yīng)(圖2)：

用緩沖溶液配制10uM Mito-H₂S₂的H₂S₂探針，UV光照150秒后,加入10當(dāng)量的不同金屬離子，用熒光分光光度法分別測(cè)試，并繪制Mito-H₂S₂的Na₂S₂探針對(duì)不同金屬離子的熒光光譜圖。結(jié)果描述：這里說明Mito-H₂S₂的探針對(duì)除Na₂S₂有響應(yīng)外，對(duì)其它離子都沒有響應(yīng)，說明了我們的探針對(duì)H₂S₂的高度特異性。

3、Mito-H₂S₂在細(xì)胞線粒體中的共聚焦顯微成像(圖3)：

向含有Hela細(xì)胞的培養(yǎng)皿中加Mito-H₂S₂DMSO溶液，與細(xì)胞培養(yǎng)液混合均勻后，使Mito-H₂S₂在培養(yǎng)液中的濃度為5uM，染色2個(gè)小時(shí)后，用pH＝7.35的緩沖溶液沖洗3次，將該培養(yǎng)皿在共聚焦顯微鏡下成像，取出培養(yǎng)皿，UV光照150秒后，靜置1個(gè)小時(shí)，再次將該培養(yǎng)皿在共聚焦顯微鏡下成像。結(jié)果描述：(1)是有細(xì)胞的明場(chǎng)圖，(2)是有細(xì)胞的只加探針H-1的暗場(chǎng)圖，(3)是有細(xì)胞的加探針H-1和光照150秒的暗場(chǎng)圖，(4)是有細(xì)胞的加探針H-1和Na₂S₂的暗場(chǎng)圖，(5)是有細(xì)胞的加探針H-1和Na₂S₂，且光照150秒的暗場(chǎng)圖，從幾個(gè)圖中可以發(fā)現(xiàn)探針只有在光照條件和Na₂S₂都存在的條件下，才可以實(shí)現(xiàn)對(duì)Na₂S₂的檢測(cè)，這樣就實(shí)現(xiàn)了光可控的對(duì)線粒體內(nèi)Na₂S₂的檢測(cè)，而避免了細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Na₂S₂的影響。

本發(fā)明的不局限于上述實(shí)施例所述的具體技術(shù)方案，凡采用等同替換形成的技術(shù)方案均為本發(fā)明要求的保護(hù)范圍。