本發(fā)明涉及一種穩(wěn)定高效篩選耐鹽性棉花苗的方法，涉及電生理學(xué)、分子生物學(xué)和植物遺傳育種領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

當(dāng)前，土壤鹽漬化已經(jīng)成為一個全球性的問題，全球土地鹽堿化呈現(xiàn)越來越嚴(yán)重的趨勢(馬晨等,2010)。而我國是世界鹽堿地大國之一，鹽漬土面積約有3.3×10⁷hm²，嚴(yán)重的阻礙了農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展(趙可夫和李法曾,1999)。鹽漬土作為一種土地資源，有著巨大的潛力和特殊的利用價值，如何積極的利用和開發(fā)地球表面大面積鹽堿地，這是國內(nèi)外亟待解決的重大課題，也是21世紀(jì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中十分迫切和重要的任務(wù)。

棉花是一種中等抗鹽的作物，其鹽脅迫的臨界濃度是7.7dsm^-1，它以其較好的耐鹽性逐漸成為鹽堿地一種改良鹽堿旱地的先鋒作物(ashrafandahmad,2000；zhangetal,2014)。然而，棉花雖然是一種比較耐鹽的農(nóng)作物，但棉花的耐鹽能力仍然有限，當(dāng)土壤鹽分濃度大于0.3％時，也會對棉花產(chǎn)生危害，尤其是其幼苗對鹽分仍然比較敏感(leidietal,1997；lietal,2013)。提高和改良棉花品種的抗鹽堿能力已經(jīng)成為棉花育種中重點(diǎn)目標(biāo)，而建立簡便快速的耐鹽性鑒定方法則是棉花耐鹽品種選擇和育種研究的基礎(chǔ)。

據(jù)takahashietal(2007)報道，許多植物能夠忍耐土壤中高濃度的鹽分，主要與植物自身在鹽漬環(huán)境中可將na⁺外排到胞質(zhì)外維持細(xì)胞質(zhì)中較低的na⁺含量有關(guān)；孫小芳等(2000)的報道也指出，耐鹽棉花品種根系具有一定的截留na⁺作用。在鹽脅迫下，由于植株吸收和積累大量鈉離子，進(jìn)而影響植物對其他營養(yǎng)元素的吸收，尤其是影響了k⁺的吸收，打破了植物體內(nèi)離子平衡的穩(wěn)態(tài)，造成一定程度的單鹽毒害(zhangetal,2014)；植物獲得耐鹽能力的另一個重要策略是離子穩(wěn)態(tài)的重建，保持細(xì)胞質(zhì)內(nèi)高k⁺低na⁺的平衡狀態(tài)是植物抵御鹽害的重要手段(dingetal,2010)。shabala和cuin(2008)也指出，維持組織中較高的k⁺/na⁺比值比單純維持較低的na⁺含量更重，這種選擇性運(yùn)輸是棉花耐鹽性的一個重要特點(diǎn)。因此，如何快速有效的鑒別不同棉花材料間‘保鉀排鈉’能力，對于我國棉花種質(zhì)資源的篩選、棉花材料的耐鹽性鑒定具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供一種穩(wěn)定高效篩選耐鹽性棉花苗的方法。

本發(fā)明技術(shù)方案如下：

一種穩(wěn)定高效篩選耐鹽性棉花苗的方法，包括利用非損傷微測技術(shù)測定鹽脅迫下棉花幼苗根系和葉片組織中na⁺離子流和k⁺離子流，同時結(jié)合鹽脅迫下棉花根系和葉片組織中g(shù)hakt1和ghsos1基因的表達(dá)情況，從而區(qū)分耐鹽性差異的棉花種質(zhì)材料。

本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫下，棉花材料的耐鹽性與根系中和葉片中k⁺離子流的外排呈負(fù)相關(guān)，與根系中和葉片中na⁺離子流呈顯著的正相關(guān)；在鹽脅迫6～18h內(nèi)，不同材料間ghakt1和ghsos1的表達(dá)水平較高且差異較大；棉花材料的耐鹽性與根系中g(shù)hakt1、ghsos1以及葉片中g(shù)hsos1的表達(dá)情況呈正相關(guān)，與葉片中g(shù)hakt1表達(dá)情況呈負(fù)相關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)，在本發(fā)明條件下，以棉花品種中49為對照，當(dāng)待測棉花種質(zhì)材料‘保鉀排鈉’能力高于中49，即根系中和葉片中k⁺離子流的外排低于中49，且na⁺離子的外排高于中49時，棉花種質(zhì)材料為耐鹽品種；反之，棉花種質(zhì)材料則為不耐鹽品種。

本發(fā)明所述‘保鉀排鈉’是指：在鹽脅迫下，植物通過鉀離子運(yùn)輸系統(tǒng)提高k⁺離子吸收和通過鈉離子運(yùn)輸系統(tǒng)增強(qiáng)na⁺離子外排的能力。

研究發(fā)現(xiàn)，棉花材料的耐鹽性與根中g(shù)hakt1基因、ghsos1基因以及葉片中g(shù)hsos1基因的表達(dá)情況呈正相關(guān)，與葉片中g(shù)hakt1基因表達(dá)情況呈負(fù)相關(guān)。

本發(fā)明所述棉花種質(zhì)材料包括但不限于中49(中等耐鹽型)、中571(敏感型)、中棉所44和新陸中61。

本發(fā)明所述方法中，鹽脅迫處理在棉花苗三葉期進(jìn)行，可按常規(guī)方法進(jìn)行鹽脅迫處理。

較佳的鹽脅迫處理方法包括將棉花苗培養(yǎng)至三葉期，進(jìn)行鹽脅迫處理，使其土壤終含鹽量為0.3％；鹽脅迫處理9天后，測定不同處理?xiàng)l件下各指標(biāo)。為保持土壤中的水分及營養(yǎng)，每隔兩天澆100ml的水，每隔五天澆100ml的hoagland營養(yǎng)液。

一般地，可將棉花種子經(jīng)消毒處理，用水漂洗后，在水中浸種催芽直至露白，然后播種于沙壤土中培養(yǎng)至三葉期，再進(jìn)行鹽脅迫處理。優(yōu)選地，培養(yǎng)條件包括：光照培養(yǎng)溫度為(30±2)℃，黑暗培養(yǎng)問題為(20±2)℃；光照/黑暗時間為14h/10h，光照強(qiáng)度為400μmolm^-2s^-1。

本發(fā)明所述方法中，優(yōu)選地，所用棉花幼苗根系為中部根系，具體為切取中部完整的根系(約3cm)作為根系樣品；所用葉片為第三片葉，具體為切取第三葉片的中間部位(約5×5mm)作為葉肉組織樣品。

本發(fā)明所述非損傷微測技術(shù)(nmt)可采用本領(lǐng)域常規(guī)方法進(jìn)行，例如采用美國揚(yáng)格youngerusasci非損傷微測系統(tǒng)(bio-001a,youngerusasci.&tech.corp.,amherst,ma,usa)。

所述na⁺離子流和k⁺離子流的檢測方法包括：將待測定的樣品(鹽脅迫下棉花幼苗根系和葉片組織)用去離子水沖洗干凈，并將其浸沒在蒸餾水15min，浸入100ml測試液中平衡15min，再轉(zhuǎn)入新的100ml測試液中開始測試。測試液配方：0.1mmoll^-1kcl、0.1mmoll^-1cacl2、0.3mmol·l^-1mes，ph6.0；每處理測定8株幼苗，測試部位距根系分生區(qū)(距根尖約200μm處)和葉片樣品位置300μm處；測試持續(xù)7～10min(達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài))，計算時舍棄前2～3min的數(shù)據(jù)。

本發(fā)明可應(yīng)用qrt-pcr技術(shù)檢測棉花苗脅迫后根系和葉片中g(shù)hakt1和ghsos1基因表達(dá)水平?？蓞⒄彰掀G艷等(2011)改良的ctab法提取總rna，逆轉(zhuǎn)錄合成cdna。采用primerexpress3.0軟件設(shè)計qrt-pcr引物以棉花中的ghubq7基因(genbank登錄號：dq116441)作為內(nèi)參，ghakt1(genbank登錄號：kf294166)和ghsos1(genbank登錄號：km986873)設(shè)計熒光定量pcr特異性引物。

引物序列分別為：

a)ghubq7-f：5′-gaaggcattccacctgaccaac-3′，

ghubq7-r：5′-cttgaccttcttcttcttgtgcttg-3′；

b)ghakt1-f：5′-caattgcctcctcgcctact-3′，

ghakt1-r：5′-atgctcgatcggatggcttt-3′；

c)ghsos1-f：5′-cccttccttctagtgtccgc-3′，

ghsos1-r：5′-aagcccaacgtactcccatg-3′。

采用sybrgreenⅱ熒光染料(takara,japan)法進(jìn)行熒光定量rt-pcr分析，擴(kuò)增條件為95℃30s，95℃5s，60℃35s，40個循環(huán)，結(jié)果采用2^-δδct對基因相對表達(dá)量進(jìn)行分析(livaketal.2001)。

為了更好地提高篩選結(jié)果的準(zhǔn)確性，本發(fā)明方法還包括檢測檢測鹽脅迫處理前后棉花幼苗葉片(優(yōu)選幼苗第三片葉)的電導(dǎo)率和丙二醛含量。

本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，上述電導(dǎo)率和丙二醛含量的增加幅度與耐鹽性呈負(fù)相關(guān)，即在鹽脅迫前后，電導(dǎo)率和丙二醛含量增加幅度越高，棉花材料的耐鹽性越低。

本發(fā)明所述電導(dǎo)率和丙二醛含量均可采用現(xiàn)有技術(shù)常規(guī)方法進(jìn)行。例如，取0.5g新鮮的上述鹽脅迫處理前后幼苗第三片葉，分別參照nayyaretal(2005)的方法應(yīng)用電導(dǎo)儀(ec215,hannainstruments,usa)測定相對電導(dǎo)率；參照stewart和bewley(1980)的硫代巴比妥酸(tba)方法測定丙二醛(mda)的含量。

為了進(jìn)一步地提高篩選結(jié)果的準(zhǔn)確性，本發(fā)明方法還包括檢測鹽脅迫處理前后棉花幼苗鮮重及干物質(zhì)。

本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，棉花幼苗鮮重及干物質(zhì)的降低幅度與耐鹽性呈負(fù)相關(guān)，即在鹽脅迫前后，鮮重及干物質(zhì)降低幅度越高，棉花材料的耐鹽性越低。

所述棉花幼苗鮮重及干物質(zhì)可用本領(lǐng)域常規(guī)方法進(jìn)行，例如檢測方法包括取待測棉花幼苗植株，先用去離子水浸泡10min后，再用蒸餾水沖洗干凈，并用吸水紙吸去表面附著的水分，稱量鮮重；將整株幼苗或?qū)⒂酌绺暗厣喜?莖和葉)分開，分別于105℃殺青30min后，80℃下烘直至恒重，稱量干物質(zhì)。

為了更進(jìn)一步地提高篩選結(jié)果的準(zhǔn)確性，本發(fā)明方法還包括檢測鹽脅迫處理前后棉花幼苗根系中和/或葉片中na⁺、k⁺。

本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，上述棉花幼苗葉片中na⁺含量的增加幅度與耐鹽性呈負(fù)相關(guān)，即在鹽脅迫前后，幼苗葉片中na⁺含量的增加幅度越高，棉花材料的耐鹽性越低；上述棉花幼苗葉片中k⁺含量的降低幅度與耐鹽性呈負(fù)相關(guān)，即在鹽脅迫前后，幼苗葉片中k⁺含量降低幅度越高，棉花材料的耐鹽性越低。

棉花幼苗根系中和葉片中na⁺、k⁺可用本領(lǐng)域常規(guī)方法進(jìn)行，例如將烘干后的植株粉碎過篩，用1moll^-1hcl浸提12h并振蕩30min后過濾，用原子吸收分光光度計(spectaa-50/55,varian,australia)測定k⁺和na⁺含量。

具體地，一種穩(wěn)定高效篩選耐鹽性棉花苗的方法，包括：

1)將棉花種子用9％的雙氧水消毒30min，用水漂洗數(shù)次后用去離子水浸種催芽直至露白，播種于滅菌的沙壤土中培養(yǎng)至三葉期，進(jìn)行鹽脅迫處理，使其土壤終含鹽量為0.3％；為保持土壤中的水分及營養(yǎng)，每隔兩天澆100ml水，每隔5天澆100mlhoagland營養(yǎng)液；

培養(yǎng)條件包括：光照培養(yǎng)溫度為(30±2)℃，黑暗培養(yǎng)問題為(20±2)℃；光照/黑暗時間為14h/10h，光照強(qiáng)度為400μmolm^-2s^-1；

2)檢測檢測鹽脅迫處理前后棉花幼苗第三片葉的電導(dǎo)率和丙二醛含量；

3)檢測鹽脅迫處理前后棉花幼苗鮮重及干物質(zhì)；

4)檢測鹽脅迫處理前后棉花幼苗根系中和葉片中na⁺、k⁺；

5)鹽脅迫處理9天后，利用非損傷微測技術(shù)測定鹽脅迫下棉花幼苗根系和第三葉片組織中na⁺離子流和k⁺離子流；

具體包括：將待測定的樣品用去離子水沖洗干凈，并將其浸沒在蒸餾水15min，浸入100ml測試液中平衡15min，再轉(zhuǎn)入新的100ml測試液中開始測試；測試液配方：0.1mmoll^-1kcl、0.1mmoll^-1cacl2、0.3mmol·l^-1mes，ph6.0；每處理測定8株幼苗，測試部位距根系分生區(qū)(距根尖約200μm處)和葉片樣品位置300μm處；測試持續(xù)7～10min；計算時舍棄前2～3min的數(shù)據(jù)；

6)鹽脅迫處理9天后，應(yīng)用qrt-pcr技術(shù)檢測棉花苗脅迫后根系和葉片中g(shù)hakt1和ghsos1基因表達(dá)水平；

以棉花中的ghubq7基因作為內(nèi)參，設(shè)計的特異性引物分別為：

a)ghubq7-f：5′-gaaggcattccacctgaccaac-3′，

ghubq7-r：5′-cttgaccttcttcttcttgtgcttg-3′；

b)ghakt1-f：5′-caattgcctcctcgcctact-3′，

ghakt1-r：5′-atgctcgatcggatggcttt-3′；

c)ghsos1-f：5′-cccttccttctagtgtccgc-3′，

ghsos1-r：5′-aagcccaacgtactcccatg-3′；

反應(yīng)體系為：2×ultrasybrmixture(withrox1)10μl，正向引物0.4μl，反向引物0.4μl，dna模板0.8μl，rnase-freewater8.4μl。

采用sybrgreenⅱ熒光染料(takara,japan)法進(jìn)行熒光定量rt-pcr分析，擴(kuò)增條件為95℃30s，95℃5s，60℃35s，40個循環(huán)，結(jié)果采用2^-δδct對基因相對表達(dá)量進(jìn)行分析；

7)根據(jù)步驟2)至步驟6)的分析結(jié)果，區(qū)分出耐鹽性差異的棉花種質(zhì)材料。

本發(fā)明進(jìn)一步提供上述方法在篩選耐鹽性棉花品種中的應(yīng)用。

本發(fā)明通過測定鹽脅迫下棉花幼苗根系及葉片中k⁺和na⁺離子流，同時結(jié)合k⁺和na⁺運(yùn)轉(zhuǎn)基因ghakt1和ghsos1的表達(dá)情況，提供了一種快速鑒定鹽脅迫下棉花幼苗‘保鉀排鈉’能力的方法，從而可以區(qū)分耐鹽性遺傳背景差異的棉花種質(zhì)材料。以選用2個耐鹽性差異顯著的棉花品種材料為例，利用沙壤土為培養(yǎng)基質(zhì)，種植在人工培養(yǎng)箱中，研究鹽協(xié)迫下各品種的干物質(zhì)累積、電導(dǎo)率、丙二醛含量以及不同部位的k⁺/na⁺濃度；同時采用非損傷微測技術(shù)(nmt)和qrt-pcr技術(shù)，測定鹽脅迫條件下k⁺和na⁺離子流、ghakt1和ghsos1的變化情況。結(jié)果表明，鹽脅迫下不同耐鹽性棉花材料在k⁺和na⁺吸收動態(tài)、ghakt1和ghsos1的表達(dá)變化趨勢上具有明顯差異，可以利用離子流以及相關(guān)基因的差異，快速、準(zhǔn)確的鑒定棉花材料‘保鉀排鈉’的能力，建立起一種穩(wěn)定高效的棉花苗期耐鹽性鑒定的方法，具有一定的實(shí)用價值。

本發(fā)明有益效果：在鹽量為0.3％的鹽脅迫條件處理9天后，通過測定根系及葉片中k⁺和na⁺離子流的實(shí)時變化7～10min，便可以鑒定出不同棉花材料‘保鉀排鈉’的能力，具有快速、便捷等特點(diǎn)。棉花材料的耐鹽性與根中g(shù)hakt1、ghsos1以及葉片中g(shù)hsos1的表達(dá)情況呈正相關(guān)，與葉片中g(shù)hakt1表達(dá)情況呈負(fù)相關(guān)。在鹽脅迫6～18h內(nèi)，不同材料間ghakt1和ghsos1的表達(dá)水平較高且差異較大，可以通過ghakt1和ghsos1表達(dá)水平的比較，從基因?qū)用嫔线M(jìn)一步有效的區(qū)分耐鹽性遺傳背景差異的棉花種質(zhì)材料。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例中鹽脅迫下不同棉花幼苗的鮮重、干物質(zhì)以及葉片中丙二醛(mda)和電導(dǎo)率變化情況；標(biāo)以不同字母的柱值在p<0.05水平上差異顯著；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例中鹽脅迫下不同棉花幼苗的根及葉片中k⁺和na⁺濃度變化情況；標(biāo)以不同字母的柱值在p<0.05水平上差異顯著；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例中鹽脅迫下不同棉花幼苗的根及葉片中k⁺離子流和na⁺離子流變化情況；

圖4為本發(fā)明實(shí)施例中鹽脅迫下不同棉花幼苗的根及葉片中g(shù)hakt1和ghsos1基因的變化情況。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件，如sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(sambrookj&russelldw，molecularcloning:alaboratorymanual，2001)，或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可通過正規(guī)渠道商購買得到的常規(guī)產(chǎn)品。

1研究方法

供試品種和鹽脅迫處理；以鹽敏感型中571、耐鹽型中49為研究對象，在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所光照培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行，光照培養(yǎng)室溫度為(30±2)℃/(20±2)℃，光照/黑暗時間為14h/10h，光照強(qiáng)度為400μmolm^-2s^-1。種子用9％的雙氧水消毒30min，清水漂洗數(shù)次后用去離子水浸種催芽直至露白，均勻播于高溫滅菌過的沙壤土中，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)到三葉期，進(jìn)行鹽脅迫處理，使其土壤終含鹽量為0.3％；鹽脅迫處理9天后，測定不同處理?xiàng)l件下各指標(biāo)。為保持土壤中的水分及營養(yǎng)，每隔兩天澆100ml的水，每隔五天澆100ml的hoagland營養(yǎng)液。

電導(dǎo)率和丙二醛含量的測定；取0.5g新鮮的幼苗第三片葉，分別參照nayyaretal(2005)的方法應(yīng)用電導(dǎo)儀(ec215,hannainstruments,usa)測定相對電導(dǎo)率，參照stewart和bewley(1980)的硫代巴比妥酸(tba)方法測定丙二醛(mda)的含量。

鮮重、干物質(zhì)量、na⁺和k⁺含量的測定；取盆中待測植株，先用去離子水浸泡10min后，再用蒸餾水沖洗干凈，并用吸水紙吸去表面附著的水分，稱量鮮重。將幼苗根及地上部(莖和葉)分開，分別于105℃殺青30min后，80℃下烘直至恒重，稱其干物質(zhì)重。將烘干后的植株粉碎過篩，用1moll^-1hcl浸提12h并振蕩30min后過濾，用原子吸收分光光度計(spectaa-50/55,varian,australia)測定k⁺和na⁺濃度。

測定離子流速；在旭月(北京)科技有限公司采用非損傷微測技術(shù)(nmt,bio-001a,youngerusasci.&tech.corp.,amherst,ma,usa)測定幼苗根系及葉片na⁺離子流速；選生長整齊的棉花幼苗，用刀片從幼苗根中切除完整的根系作為根部樣品，切取第三葉片的中間部位(～5×5mm)作為葉肉組織樣品；將測定的樣品用去離子水沖洗干凈，并將其浸沒在蒸餾水15min，浸入100ml測試液中平衡15min，再轉(zhuǎn)入新的100ml測試液中開始測試。測試液配方：0.1mmoll^-1kcl、0.1mmoll^-1cacl2、0.3mmol·l^-1mes，ph6.0；每處理測定8株幼苗，測試部位距樣品位置300μm處；測試持續(xù)7～10min(達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài))，計算時舍棄前2～3min的數(shù)據(jù)。

離子運(yùn)轉(zhuǎn)體表達(dá)；應(yīng)用qrt-pcr技術(shù)研究鹽脅迫0、3、6、12、24和48h后，根系和葉片中g(shù)hakt1和ghsos1基因表達(dá)水平。參照孟艷艷等(2011)改良的ctab法提取總rna，逆轉(zhuǎn)錄合成cdna。采用primerexpress3.0軟件設(shè)計qrt-pcr引物以棉花中的ghubq7基因(genbank登錄號：dq116441)作為內(nèi)參，ghakt1(genbank登錄號：kf294166)和ghsos1(genbank登錄號：km986873)設(shè)計熒光定量pcr特異性引物。

引物序列分別為：

a)ghubq7-f：5′-gaaggcattccacctgaccaac-3′，

ghubq7-r：5′-cttgaccttcttcttcttgtgcttg-3′；

b)ghakt1-f：5′-caattgcctcctcgcctact-3′，

ghakt1-r：5′-atgctcgatcggatggcttt-3′；

c)ghsos1-f：5′-cccttccttctagtgtccgc-3′，

ghsos1-r：5′-aagcccaacgtactcccatg-3′；

反應(yīng)體系為：2×ultrasybrmixture(withrox1)10μl，正向引物0.4μl，反向引物0.4μl，dna模板0.8μl，rnase-freewater8.4μl。

采用sybrgreenⅱ熒光染料(takara,japan)法進(jìn)行熒光定量rt-pcr分析，擴(kuò)增條件為95℃30s，95℃5s，60℃35s，40個循環(huán)，結(jié)果采用2^-δδct對基因相對表達(dá)量進(jìn)行分析(livaketal.2001)。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計；所有實(shí)驗(yàn)至少獨(dú)立重復(fù)3次，各次結(jié)果趨勢一致，取其中具有代表性的數(shù)值進(jìn)行統(tǒng)計分析。采用spss16.0(spssinc.chicago,usa)處理數(shù)據(jù)，以duncan’s多重比較進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)(p<0.05)。

2結(jié)果部分

鹽脅迫顯著的降低了棉花幼苗的鮮重及干物重，但中49受鹽脅迫影響較小(見圖1)。在鹽脅迫下，中49和中571的鮮重分別降低了36.4％和48.9％，干物重分別降低了17.1％和28.5％。鹽脅迫顯著的增加了葉片中電導(dǎo)率和mda的含量，中49和中571的電導(dǎo)率分別增加了65.7％和105.5％，mda含量分別增加了84.3％和129.6％。上述結(jié)果表明了，中49的耐鹽性較強(qiáng)，而中571對鹽脅迫較為敏感。

鹽脅迫影響了棉花組織中k⁺和na⁺的分配，且不同棉花材料間表現(xiàn)出明顯的差異(見圖2)。其中，鹽脅迫顯著的降低了中49和中571葉片中k⁺的濃度，分別降低了23.1％和36.8％；鹽脅迫顯著的增加了根系中k⁺的濃度以及組織中(根系和葉片)na⁺的濃度；鹽脅迫下，中49根系中k⁺的濃度、na⁺的濃度以及葉片中na⁺濃度分別增加了30.9％、6.6倍和2.1倍，而中571中上述指標(biāo)分別增加了42.2％、7.7倍和3.1倍。這些結(jié)果說明了中49根系對na⁺具有較強(qiáng)的截留能力，對k⁺具有較強(qiáng)的吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)能力，從而保持了其地上部低na⁺高k⁺的環(huán)境，減輕了過多的na⁺對葉片等器官的毒害作用。

為了進(jìn)一步明確鹽脅迫對棉花幼苗離子吸收的影響，通過nmt測定鹽處理?xiàng)l件下幼苗根中k⁺和na⁺離子的動態(tài)變化。如圖3所示，正常條件下，棉花幼苗的根系呈現(xiàn)輕微的k⁺內(nèi)流，葉片中呈較低的外排，但鹽脅迫顯著的增加了根系和葉片中k⁺外流。在鹽脅迫條件下，中49的k⁺外流速率較低，根系和葉片中k⁺外流分別為263pmolcm^-2s^-1和787pmolcm^-2s^-1，而中571的根系和葉片中k⁺外流分別為393pmolcm^-2s^-1和1525pmolcm^-2s^-1，比中49的外排速率分別高49.2％和93.9％。鹽脅迫也顯著的增加了根系和葉片中na⁺的外流；中49根系和葉片中的na⁺外流速率均較高，分別比中571高494pmolcm^-2s^-1和807pmolcm^-2s^-1。

鹽脅迫顯著的影響根系和葉片中g(shù)hakt1和ghsos1的表達(dá)，且不同材料間差異明顯(見圖4)。隨著鹽脅迫處理的延長，根系中g(shù)hakt1和葉片中g(shù)hsos1的表達(dá)呈先增加后降低的單峰曲線變化，且中49中的表達(dá)量均高于中571。鹽脅迫處理顯著的抑制了中49葉片中g(shù)hakt1的表達(dá)，但增加了中571葉片中g(shù)hakt1的表達(dá)。與之相反，鹽脅迫處理顯著的增加了中49根中g(shù)hsos1的表達(dá)，但降低了中571根中g(shù)hsos1的表達(dá)。

3總結(jié)部分

本研究通過電生理和分子技術(shù)的相結(jié)合，建立了一種高效準(zhǔn)確的室內(nèi)鑒定棉花幼苗‘保鉀排鈉’能力的方法。鹽脅迫下，棉花材料的耐鹽性與根中和葉片中k⁺離子流的外排呈負(fù)相關(guān)，與根中和葉片中na⁺離子流呈顯著的正相關(guān)。在鹽脅迫6～18h內(nèi)，不同材料間ghakt1和ghsos1的表達(dá)水平較高且差異較大；棉花材料的耐鹽性與根中g(shù)hakt1、ghsos1以及葉片中g(shù)hsos1的表達(dá)情況呈正相關(guān)，與葉片中g(shù)hakt1表達(dá)情況呈負(fù)相關(guān)。本研究證實(shí)，利用電生理技術(shù)和qrt-pcr技術(shù)，測定棉花種質(zhì)根系和葉片中k⁺和na⁺離子流、ghakt1和ghsos1的表達(dá)水平，可以快速有效的區(qū)分和篩選‘保鉀排鈉’能力較強(qiáng)的耐鹽性棉花種質(zhì)材料。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

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