本發(fā)明涉及血管疾病的診斷和治療領(lǐng)域，具體涉及一種新的主動(dòng)脈瘤靶向分子以及用于早期診斷并靶向治療胸主動(dòng)脈瘤夾層和腹主動(dòng)脈瘤發(fā)生的方法和試劑。

背景技術(shù)：

主動(dòng)脈瘤(aorticaneurysm)，是指主動(dòng)脈壁局部或彌漫性的異常擴(kuò)張超過(guò)正常直徑50％以上。一旦發(fā)生，破裂率高達(dá)80％以上。主動(dòng)脈瘤好發(fā)于大動(dòng)脈，包括升主動(dòng)脈主動(dòng)脈弓、胸部降主動(dòng)脈、胸腹主動(dòng)脈和腹主動(dòng)脈。由于大動(dòng)脈血壓以及流速過(guò)快，極容易在應(yīng)激情況下迅速擴(kuò)張，甚至撕裂形成夾層，威脅病人生命。傳統(tǒng)的主動(dòng)脈瘤的診斷依靠影像學(xué)與臨床癥狀相結(jié)合的方法，其中cta和mri更是作為診斷的金標(biāo)準(zhǔn)在臨床中廣泛應(yīng)用。

近年來(lái)流行病大數(shù)據(jù)的研究發(fā)現(xiàn)在主動(dòng)脈瘤極早期臨床癥狀隱匿，且管腔并未出現(xiàn)明顯擴(kuò)張；但此時(shí)管壁內(nèi)皮及中層已經(jīng)出現(xiàn)明顯病生理改變，此時(shí)若發(fā)生應(yīng)激、突然血壓升高，則容易撕裂出現(xiàn)夾層，而流行病數(shù)據(jù)也證實(shí)管腔直徑與破裂風(fēng)險(xiǎn)之間無(wú)線性關(guān)系，一些管徑較小的動(dòng)脈瘤反而具有更高的破裂風(fēng)險(xiǎn)。由于主動(dòng)脈夾層發(fā)生破裂后高致死率以及發(fā)病年齡的前移，迫切需要一種在早期特異、靈敏的方法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，從而提高患者的生存率和生活質(zhì)量。

隨著對(duì)動(dòng)脈瘤發(fā)病機(jī)制的深入研究，發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈瘤形成過(guò)程中存在多種比直徑變化更早更特異的病理改變，如內(nèi)皮的活化，平滑肌細(xì)胞的凋亡，中層彈力板的降解和炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)。在此過(guò)程中，最先出現(xiàn)的是內(nèi)皮細(xì)胞的活化，包括細(xì)胞間隙的擴(kuò)大，細(xì)胞皺縮和內(nèi)皮的脫落。四型膠原是一種內(nèi)皮下基底膜的主要成分，在內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)活化后可以暴露，從而被檢測(cè)；在正常情況下四型膠原主要參與基底膜的形成與穩(wěn)定性，而在病理過(guò)程中則促進(jìn)細(xì)胞的遷移。分子病理學(xué)的發(fā)展為微觀檢測(cè)提供了可能性，可以通過(guò)選取病理過(guò)程中合適的分子作為靶點(diǎn)，通過(guò)與其特異性結(jié)合，特異性監(jiān)測(cè)該病理過(guò)程的發(fā)生發(fā)展；并且可以通過(guò)靶向載藥這一方式，提高病變部分的血藥濃度，并且降低其他器官的毒性。

熒光成像技術(shù)作為一種優(yōu)秀的檢測(cè)和示蹤手段被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域。熒光成像技術(shù)一般通過(guò)設(shè)計(jì)合理有效的熒光分子，輔以功能化的修飾，從而實(shí)現(xiàn)在細(xì)胞或者動(dòng)物體內(nèi)發(fā)光成像。其具備可選擇性強(qiáng)，靈敏度高，可視化效果強(qiáng)，重復(fù)性較好等特點(diǎn)，現(xiàn)被充分的利用于疾病的檢測(cè)和診斷，納米材料的示蹤，新型藥物效果的評(píng)價(jià)等方面。通常的熒光探針需要具備一定的優(yōu)異的生物相容性和光學(xué)特性，即需要有較高的熒光量子產(chǎn)率和摩爾消光系數(shù)，同時(shí)，其又要規(guī)避與生物基質(zhì)有同樣激發(fā)波長(zhǎng)的情況下能有被有效的在細(xì)胞或者動(dòng)物體內(nèi)檢測(cè)。現(xiàn)有的大部分熒光探針基本分為生物熒光探針和化學(xué)合成探針，其中生物熒光探針一般為固有的生物蛋白如基因編碼的熒光蛋白等等，而化學(xué)熒光探針，包括人工合成的異硫氰酸熒光素，羅丹明b，花青染料熒光標(biāo)記等等，都被廣泛的使用于現(xiàn)在科學(xué)的研究中。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有診療技術(shù)的問(wèn)題，研究四型膠原作為分子靶點(diǎn)，是否可作為診斷標(biāo)志物應(yīng)用于動(dòng)脈瘤的精準(zhǔn)診斷中。

本發(fā)明首先涉及四型膠原(coliv)作為診斷檢測(cè)靶標(biāo)，在早期診斷主動(dòng)脈夾層/瘤中的應(yīng)用。

本發(fā)明還涉及四型膠原(coliv)作為診斷檢測(cè)靶標(biāo)，在研發(fā)/篩選主動(dòng)脈夾層/瘤早期診斷標(biāo)識(shí)物中的應(yīng)用。

進(jìn)一步的，本發(fā)明還涉及靶向四型膠原的多肽(coliv-peptide)，所述的多肽的序列如seqidno.1所示，

seqidno.1：cgggkplvwlk。

本發(fā)明還涉及編碼所述靶向四型膠原的多肽的核苷酸片段。

進(jìn)一步的，本發(fā)明還涉及所述靶向四型膠原的多肽(coliv-peptide)或其衍生物在制備主動(dòng)脈夾層/瘤早期診斷標(biāo)志物中的應(yīng)用，所述的診斷包括但不限于，經(jīng)超聲下檢測(cè)、經(jīng)mri下檢測(cè)、經(jīng)cta下檢測(cè)、經(jīng)熒光成像下檢測(cè)中的任意一種或幾種。

本發(fā)明還涉及所述靶向四型膠原多肽(coliv-peptide)或其衍生物在制備治療或預(yù)防主動(dòng)脈夾層/瘤藥物中的應(yīng)用，所述的藥物包括但不限于，經(jīng)胃腸消化道道給藥的藥物、經(jīng)靜脈注射給藥的藥物、經(jīng)皮下包埋給藥方式給藥的藥物。

所述的靶向四型膠原的多肽的衍生物包括但不限于，所述的靶向四型膠原的多肽被熒光標(biāo)識(shí)物，mri標(biāo)識(shí)物或其他可用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)的標(biāo)記物或電信號(hào)檢測(cè)的標(biāo)記物中的一種或多種修飾/絡(luò)合/共價(jià)偶聯(lián)后的產(chǎn)物。。

優(yōu)選的，所述靶向四型膠原的多肽(coliv-peptide)的衍生物為所述的靶向四型膠原的多肽被羅丹明b通過(guò)共價(jià)鍵修飾得到的coliv-rhb，所述的衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)如下式1所示：

更優(yōu)選的，所述靶向四型膠原的多肽(coliv-peptide)的衍生物為所述的靶向四型膠原的多肽被兩分子的1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1,,4,7,10-四羧酸釓?fù)ㄟ^(guò)酰胺鍵偶聯(lián)得到的coliv-gb，其結(jié)構(gòu)如式2所示：

最優(yōu)選的，所述的靶向四型膠原的多肽(coliv-peptide)的衍生物為所述的多肽被羅丹明b通過(guò)共價(jià)鍵修飾后進(jìn)一步被兩分子的1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1,,4,7,10-四羧酸釓?fù)ㄟ^(guò)酰胺鍵偶聯(lián)的產(chǎn)物(collageniv-targetedcontrastagent,c4tca)，其結(jié)構(gòu)如式2所示

更進(jìn)一步的，本發(fā)明還涉及所述的coliv-rhb、coliv-gb、c4tca在制備早期診斷主動(dòng)脈瘤的制劑中的應(yīng)用。

更進(jìn)一步的，本發(fā)明還涉及所述的c4tca的制備方法，其步驟包括，

(1)充分鹽化n-羥基琥珀酰亞胺活化過(guò)的1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1,4,7,10-四羧酸(nhs-dota)的羧基；

(2)使用n-羥基琥珀酰亞胺修飾過(guò)的1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1,,4,7,10-四羧酸(nhs-dota，化合物1)和六水合氯化釓絡(luò)合，獲得用n-羥基琥珀酰亞胺修飾過(guò)的1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1,,4,7,10-四羧酸釓(nhs-dota-gd，化合物2)；

(2)使用coliv-rhb(化合物3)和nhs-dota-gd反應(yīng)，獲得c4tca(化合物4)。

優(yōu)選的，所述的合成步驟為：

(1)取12.7mg的n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)活化過(guò)的1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1,4,7,10-四羧酸(dota)，即nhs-dota，溶解于1ml的去離子水中，向其中加入8mg的碳酸氫鈉，室溫磁力攪拌10-20分鐘，使其羧基充分鹽化。

(2)取9.4mg的六水合氯化釓溶解于200μl的去離子水中，將所得的溶液緩慢的滴加入實(shí)例4(1)的溶液中，室溫磁力攪拌12小時(shí)，使其充分絡(luò)合。

(3)取20mg的羅丹明b修飾的四型膠原的靶向多肽(rhb-coliv)在避光的環(huán)境下溶解于800μl的水中，將所得的溶液加入實(shí)例4(2)最終得到的溶液里，避光環(huán)境下室溫磁力攪拌12小時(shí)，所得的混合液通過(guò)1000mw的透析膜超濾提純，最終溶液通過(guò)凍干的方式得到紅色絮狀固體，所有的后處理全程避光。

所述的合成路線為

附圖說(shuō)明

圖1、動(dòng)脈瘤進(jìn)程中內(nèi)皮細(xì)胞活化與中層彈力板斷裂出現(xiàn)的時(shí)間圖

圖2、四型膠原在正常/病理下血管的表達(dá)部位示意圖

圖3、c4tca在小鼠主動(dòng)脈瘤早期mri及熒光成像檢測(cè)效果圖

具體實(shí)施方式

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

胸主動(dòng)脈夾層/主動(dòng)脈瘤模型：3周齡雄性野生型小鼠(c57bl/6)；apoe-/-小鼠(c57bl/6j)均購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司。所有動(dòng)物均在北京市心肺血管疾病研究所spf級(jí)環(huán)境動(dòng)物房進(jìn)行飼養(yǎng)繁殖。野生小鼠需為達(dá)到3周齡，體重在10g左右的雄性小鼠。apoe-/-小鼠要求6w左右，體重在20～22g左右的雄性小鼠。所有實(shí)驗(yàn)操作均根據(jù)nih與1996年制定的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理及使用指南》和首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)規(guī)定的實(shí)驗(yàn)流程進(jìn)行。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按照隨機(jī)方法進(jìn)行分組。

實(shí)施例1、胸主動(dòng)脈夾層/主動(dòng)脈瘤小鼠模型(小鼠tad模型)的構(gòu)建

bapn喂水組小鼠tad模型的構(gòu)建及評(píng)價(jià)

取3周齡c57bl/6背景雄性小鼠給予正常飲食，

bapn喂水組(n＝16)：將bapn以1g/kg/day劑量溶于飲水中。

喂bapn第14天，隨機(jī)選擇5只小鼠進(jìn)行胸主動(dòng)脈超聲，判斷是否已經(jīng)存在胸主動(dòng)脈的增寬/夾層。經(jīng)多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，14天時(shí)部分小鼠已經(jīng)形成主動(dòng)脈夾層/主動(dòng)脈瘤，并開(kāi)始陸續(xù)死亡。

實(shí)施例2、小鼠tad模型組織切片檢測(cè)

1.冰凍切片：

在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)用戊巴比妥(100mg/kg)麻醉處死小鼠，采用肝素化生理鹽水進(jìn)行心臟灌流，去除心臟殘留血液。用4％多聚甲醛繼續(xù)灌注，使血管組織形態(tài)原位固定。在體視顯微鏡下分離剪取主動(dòng)脈弓部和降部，在4％多聚甲醛中浸泡固定2小時(shí)，后轉(zhuǎn)移至30％蔗糖溶液中4℃過(guò)夜，充分脫水。第二天從蔗糖溶液中取出血管，用濾紙充分吸干組織水分，將血管豎直包埋于oct包埋劑中，錫箔紙包繞后于液氮中緩慢凍凝，可貯存于-80℃冰箱。進(jìn)行連續(xù)冰凍組織切片，厚度5μm，用多聚賴氨酸涂層玻片貼片。

2.石蠟切片：

在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)用戊巴比妥(100mg/kg)麻醉處死小鼠，采用肝素化生理鹽水進(jìn)行心臟灌流，去除心臟殘留血液。在體視顯微鏡下分離剪取主動(dòng)脈弓部，放于10％甲醛溶液中固定；將正常主動(dòng)脈和tad組織放于10％甲醛溶液中固定。至少24小時(shí)后取出血管進(jìn)行脫水處理，并用石蠟包埋組織(血管豎直向下)。切片時(shí)采用連續(xù)切片，厚度5μm，用多聚賴氨酸涂層玻片貼片。

實(shí)施例3、小鼠tad模型組織病理學(xué)檢測(cè)：

i.通過(guò)彈力纖維染色觀察彈力板情況，

具體操作如下：

1.1.冰凍切片：

(1)冰凍切片pbs中洗去oct；

(2)加入1滴(100μl)lugol碘液(試劑a)孵育5分鐘，稍加水洗；

(3)加入1滴(100μl)硫代酸鈉(試劑b)處理5分鐘；

(4)用流水沖洗5分鐘，70％酒精稍洗；

(5)加入1滴(100μl)醛品紅染液(試劑c)，進(jìn)行染色10分鐘，用70％酒精浸洗2次(每次約30秒，至切片不再脫色為止)，稍水洗；

(6)加入1滴(100μl)橙黃g染液(試劑d)染色10秒，稍水洗；

(7)95％酒精脫水5min；

(8)無(wú)水酒精脫水5min；

(9)二甲苯透明5min，封片；

2.石蠟切片：

(1)石蠟切片常規(guī)用二甲苯脫蠟，經(jīng)各級(jí)不同濃度的乙醇將石蠟切片脫蠟至水：二甲苯i(20min)→二甲苯ii(20min)→二甲苯iii(20min)→100％酒精(5min)→95％酒精(5min)→80％酒精(5min)→自來(lái)水洗去酒精。

(2)加入1滴(100μl)lugol碘液(試劑a)孵育5分鐘，稍加水洗；

(3)加入1滴(100μl)硫代酸鈉(試劑b)處理5分鐘；

(4)用流水沖洗5分鐘，70％酒精稍洗；

(5)加入1滴(100μl)醛品紅染液(試劑c)，進(jìn)行染色10分鐘，用70％酒精浸洗2次(每次約30秒，至切片不再脫色為止)，稍水洗；

(6)加入1滴(100μl)橙黃g染液(試劑d)染色10秒，稍水洗；

(7)95％酒精脫水5min；

(8)無(wú)水酒精脫水5min；

(9)二甲苯透明5min，封片；

采用nikoneclipse90i顯微鏡觀察，彈力纖維呈藍(lán)紫色，背景呈不同程度黃色。彈力板內(nèi)側(cè)為新生內(nèi)膜部分。

結(jié)果顯示，bapn誘導(dǎo)后，小鼠tad模型在2周后已經(jīng)出現(xiàn)內(nèi)皮損傷，而在三周時(shí)候雖然已出現(xiàn)夾層，但是大體上仍無(wú)明顯變化。我們對(duì)比大體情況，彈力蛋白和內(nèi)皮損傷后發(fā)現(xiàn)，相比于前者，內(nèi)皮損傷出現(xiàn)最早也最靈敏(圖1)，提示我們關(guān)注內(nèi)皮下結(jié)構(gòu)，從而為早期診斷提供潛在靶點(diǎn)。

ii.通過(guò)免疫熒光染色染色觀察血管壁結(jié)構(gòu)，具體如下：

1.檢測(cè)不同膠原的管壁定位：

(1)冰凍切片pbs中洗去oct；

(2)4％的多聚甲醛固定10min，pbs洗3遍。

(3)血清封閉30min

(4)一抗固定，過(guò)夜。

(coli，兔，1：500，圖2上，左1)

(coliii，兔，1：500，圖2上，左2)

(coliv，兔，1：500，圖2上，左3)

(ec，大鼠，1：500，圖2上全部)

(5)室溫平衡30min，pbs洗三遍。

(6)二抗40min，pbs洗三遍。

(抗兔，紅色，1：1000)

(抗大鼠，綠色，1：1000)

(7)dapi封片。

(8)顯微鏡下觀察標(biāo)本形態(tài)。

2.檢測(cè)造模不同時(shí)期coliv表達(dá)量的變化：

(1)冰凍切片pbs中洗去oct；

(2)4％的多聚甲醛固定10min，pbs洗3遍。

(3)血清封閉30min

(4)一抗固定，過(guò)夜。

(coliv，兔，1：500，圖2中)

(a-sma,，鼠，1：500，圖2中)

(5)室溫平衡30min，pbs洗三遍。

(6)二抗40min，pbs洗三遍。

(抗兔，綠色，1：1000)

(抗鼠，紅色，1：1000)

(7)dapi封片。

(8)顯微鏡下觀察標(biāo)本形態(tài)。

3.天狼星紅(siriusred)苦味酸染色，輔助定位各型膠原

(1)石蠟切片厚4～6μm，脫蠟至水。

(2)入天青石藍(lán)液5～10min。

(3)蒸餾水沖洗3次。

(4)天狼星紅飽和苦味酸液15～30min；(可用harris蘇木素液淡染細(xì)胞核)。

(5)直接用無(wú)水乙醇分化與脫水。

(6)二甲苯透明、光學(xué)樹(shù)膠封固。

偏振光顯微鏡下觀察：

ⅰ型膠原纖維：紅色或黃色，排列緊密，具強(qiáng)雙折光性。

ⅱ型膠原纖維：多種色彩，疏松網(wǎng)狀、弱雙折光性。

ⅲ型膠原纖維：綠色、細(xì)纖維、弱雙折光性。

ⅳ型膠原纖維：淡黃色、弱雙折光性(基膜成分)。

結(jié)果顯示，相比于其他兩種血管中含量豐富的膠原(coli，coliii)，coliv特異性定位于血管內(nèi)皮下基底膜，是血管損傷后第一層暴露的部分，可以在極早期發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈損傷；此外，在sham,bapn1w,2w,3w,4w這幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別對(duì)coliv進(jìn)行染色發(fā)現(xiàn)，coliv內(nèi)皮下表達(dá)量隨著模型時(shí)間而逐漸增加(圖2)，以上證明coliv可以作為早期胸主動(dòng)脈夾層/主動(dòng)脈瘤的分子靶點(diǎn)。

實(shí)施例4、四型膠原靶向材料c4tca的構(gòu)建

為進(jìn)一步在活體的情況下檢測(cè)早期胸主動(dòng)脈夾層/主動(dòng)脈瘤，使用mri核磁標(biāo)記物進(jìn)一步標(biāo)記coliv-rhb，合成c4tca，所述的c4tca的合成步驟為：

(1)取12.7mg的n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)活化過(guò)的1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1,4,7,10-四羧酸(dota)，即nhs-dota溶解于1ml的去離子水中，向其中加入8mg的碳酸氫鈉，室溫磁力攪拌10-20分鐘，使其羧基充分鹽化。

(2)取9.4mg的六水合氯化釓溶解于200μl的去離子水中，將所得的溶液緩慢的滴加入實(shí)例4(1)的溶液中，室溫磁力攪拌12小時(shí)，使其充分絡(luò)合。

(3)取20mg的羅丹明b修飾的四型膠原的靶向多肽(rhb-coliv)在避光的環(huán)境下溶解于800μl的水中，將所得的溶液加入實(shí)例4(2)最終得到的溶液里，避光環(huán)境下室溫磁力攪拌12小時(shí)，所得的混合液通過(guò)1000mw的透析膜超濾提純，最終溶液通過(guò)凍干的方式得到紅色絮狀固體c4tca，所有的后處理全程避光。

實(shí)施例5、靶向材料c4tca在mri在體條件和病理切片下早期診斷主動(dòng)脈瘤

使用如上所述bapn喂水2周小鼠進(jìn)行試驗(yàn)。

1)將小鼠氣麻下眶靜脈注射實(shí)施例4制備的c4tca材料1.5mg。

2)靜置30min，使材料充分經(jīng)過(guò)血液循環(huán)后再次進(jìn)行氣麻

3)接入心電、呼吸門控，放入7tmri儀器

4)使用tise序列對(duì)于整段主動(dòng)秒弓降部，腹主動(dòng)脈腎上部進(jìn)行斷層掃描。

5)將小鼠血管病變部分提取并制成冰凍切片，晾干后直接dapi封片，鏡下觀察材料熒

光并與mri結(jié)果比對(duì)分析，確定mri信號(hào)增強(qiáng)部分是否確實(shí)出現(xiàn)病生理改變。

結(jié)果顯示，在動(dòng)脈瘤模型第14天，部分小鼠出現(xiàn)主動(dòng)脈弓降部信號(hào)增強(qiáng)，而在病理切片下正是此時(shí)血管確實(shí)出現(xiàn)內(nèi)皮損傷；而那些并未出現(xiàn)信號(hào)增強(qiáng)的血管并未看到內(nèi)皮/中層病生理改變(圖3)，說(shuō)明基于coliv為靶點(diǎn)的mri、熒光雙探針c4tca可以在早期特異性發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮損傷，從而監(jiān)測(cè)tad的發(fā)生。

實(shí)施例6、coliv-gb在mri在體條件下早期診斷主動(dòng)脈瘤

使用如上所述bapn喂水2周小鼠進(jìn)行試驗(yàn)。

1)將小鼠氣麻下眶靜脈注射實(shí)施例4制備的coliv-gb材料1.3mg。

2)靜置30min，使材料充分經(jīng)過(guò)血液循環(huán)后再次進(jìn)行氣麻

3)接入心電、呼吸門控，放入7tmri儀器

4)使用tise序列對(duì)于整段主動(dòng)秒弓降部，腹主動(dòng)脈腎上部進(jìn)行斷層掃描。

結(jié)果顯示，針對(duì)同樣的小鼠bapn模型在單獨(dú)使用coliv-gb時(shí)，在在體mri診斷條件下，能夠取得和c4tca相似的診斷結(jié)果，表明coliv-gb和c4tca一樣，也能夠在早期特異性發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮損傷，從而監(jiān)測(cè)tad的發(fā)生。

最后需要說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用作幫助本領(lǐng)域技術(shù)人員理解本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)，不用做對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。

sequencelisting

<110>北京市心肺血管疾病研究所

<120>四型膠原作為靶點(diǎn)在早期診斷主動(dòng)脈瘤/夾層中的應(yīng)用

<160>1

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>11

<212>prt

<213>coliv-peptide

<400>1

cysglyglyglylysproleuvaltrpleulys

1510