本發(fā)明涉及美拉德反應(yīng)領(lǐng)域，特別是一種利用聚能式超聲加快多肽-糖類體系美拉德反應(yīng)進(jìn)程的方法。

背景技術(shù)：

美拉德反應(yīng)又稱為“非酶棕色化反應(yīng)”，是法國(guó)化學(xué)家l.c.maillard在1912年提出的。目前美拉德反應(yīng)廣泛存在于食品工業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域，由羰基化合物（還原糖類）和氨基化合物（氨基酸、蛋白質(zhì)）在一定溫度下接枝結(jié)合，經(jīng)過(guò)一系列復(fù)雜的反應(yīng)最終生成棕色甚至是黑色的大分子物質(zhì)——類黑精，所以美拉德反應(yīng)又稱羰氨反應(yīng)，整個(gè)反應(yīng)過(guò)程不需要酶類參與就可逐步進(jìn)行。

美拉德反應(yīng)在食品領(lǐng)域很普遍。食品加工過(guò)程中美拉德反應(yīng)，會(huì)造成氨基酸消耗、糖及蛋白質(zhì)損失，致使食品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值下降，但該過(guò)程會(huì)賦予食品濃郁的香味和愉悅的色澤，同時(shí)研究表明美拉德反應(yīng)生成的主要產(chǎn)物（類黑精、還原酮類及一系列含氮、硫的揮發(fā)性雜環(huán)化合物）具有良好的抗氧化性、抗突變、抗癌、抗衰老、抗菌性、溶解性和乳化性等功能特性（美拉德反應(yīng)研究進(jìn)展，李亞麗，2012），如何合理利用和改進(jìn)美拉德反應(yīng)值得研究。

目前，美拉德反應(yīng)主要采用濕法反應(yīng)，以蛋白、氨基酸、肽等含氨基化合物和葡萄糖、木糖等含羰基化合物進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)溫度一般在90~130℃，反應(yīng)時(shí)間從1h到8h不等。在食品加工過(guò)程中美拉德反應(yīng)溫度高、時(shí)間長(zhǎng)，然而長(zhǎng)時(shí)間的高溫處理，不僅降低食品品質(zhì)、破壞食品營(yíng)養(yǎng)、消耗大量能源，也更容易產(chǎn)生大量具有神經(jīng)毒性、遺傳毒性和潛在致癌性的對(duì)人體有害的化合物，如丙烯酰胺等（丙烯酰胺與類黑精生成量的相關(guān)性及其體外代謝初探，王亞君，2009）。如何縮短反應(yīng)時(shí)間、降低反應(yīng)溫度是改進(jìn)美拉德反應(yīng)的一個(gè)重要方向。

早在20世紀(jì)人們就發(fā)現(xiàn)超聲波可用于催化化學(xué)反應(yīng)，其加快化學(xué)反應(yīng)并非靠聲場(chǎng)與反應(yīng)物的直接作用，而是通過(guò)超聲過(guò)程中產(chǎn)生的空化作用及其引起的沖擊波和微射流（超聲波在催化過(guò)程中的應(yīng)用，于鳳文，2001）?？栈饔檬侵冈嬖谟谝后w中的氣泡受到聲場(chǎng)作用而振蕩、生長(zhǎng)、崩潰、閉合的過(guò)程，氣泡崩潰瞬間可以在局部形成高溫和高壓，使局部原本緩慢的化學(xué)反應(yīng)被瞬時(shí)催化而加快進(jìn)程。氣泡崩潰產(chǎn)生高溫高壓的同時(shí)也會(huì)帶來(lái)強(qiáng)烈的沖擊波和微射流，加快分子運(yùn)動(dòng)、強(qiáng)化傳質(zhì)過(guò)程，進(jìn)而加快化學(xué)反應(yīng)的進(jìn)程。因此，利用超聲波有助于加快反應(yīng)進(jìn)程、降低反應(yīng)溫度，有望彌補(bǔ)美拉德反應(yīng)溫度高、時(shí)間長(zhǎng)的缺點(diǎn)。目前已有超聲輔助美拉德反應(yīng)的研究，主要集中于超聲輔助蛋白質(zhì)-糖類體系美拉德反應(yīng)，用于蛋白質(zhì)改性等研究，對(duì)提升美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化能力效果顯著（酪蛋白-葡聚糖接枝改性研究，劉娟，2008）。多肽參與的美拉德反應(yīng)與蛋白質(zhì)-糖類體系有很大的區(qū)別，多肽相比大分子蛋白反應(yīng)活性更高，美拉德反應(yīng)過(guò)程中能生成更多的類黑精物質(zhì)，但是關(guān)于超聲輔助多肽-糖類體系美拉德反應(yīng)，用以降低反應(yīng)溫度和減少反應(yīng)時(shí)間方面的研究目前還未見(jiàn)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了克服美拉德反應(yīng)溫度高、反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)的缺點(diǎn)，提供一種利用聚能式超聲技術(shù)加快美拉德反應(yīng)進(jìn)程、降低反應(yīng)溫度的方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，技術(shù)方案如下：

聚能式超聲設(shè)備，主要由聚能式超聲探頭、超聲發(fā)生器、超聲作用室、控制器等組成。超聲探頭是超聲儀器與樣品的接觸界面，超聲發(fā)生器產(chǎn)生超聲，超聲作用室是樣品接受超聲作用的場(chǎng)所，控制器控制超聲發(fā)生器和超聲作用室，其中控制器通過(guò)線纜分別與超聲發(fā)生器和超聲作用室連接，超聲探頭通過(guò)線纜與超聲發(fā)生器連接。

一種加快多肽-糖類體系美拉德反應(yīng)進(jìn)程的方法，按照下述步驟進(jìn)行：取燒杯加蒸餾水并調(diào)ph到6~8，90~100℃預(yù)熱整個(gè)超聲作用室和蒸餾水。升溫到位后，將草魚(yú)肉水解多肽和葡萄糖按7:1（質(zhì)量比）加入各燒杯，迅速混勻后把燒杯放入超聲作用室，將超聲探頭浸沒(méi)于美拉德反應(yīng)容器中，設(shè)置功率密度800~1200w/l、超聲頻率28khz后開(kāi)動(dòng)超聲發(fā)生器進(jìn)行超聲作用。美拉德反應(yīng)進(jìn)行60min后取出燒杯，迅速冰浴降溫以終止美拉德反應(yīng)，取樣以備測(cè)定。

草魚(yú)肉水解多肽干燥粉末的制備方法，按照下述步驟進(jìn)行：

將草魚(yú)肉用絞肉機(jī)絞成魚(yú)糜，取草魚(yú)魚(yú)糜按液固比4ml/g用蒸餾水溶解，在50℃、ph7.0條件下按酶與底物（e/s）質(zhì)量比1:100加入風(fēng)味蛋白酶，酶解7.8h，酶解物經(jīng)沸水浴滅酶（100℃，10min）和離心（4000r/min，10min）后得上清，將上清濃縮、凍干后即得草魚(yú)肉水解多肽干燥粉末樣品。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：

借助聚能式超聲輔助美拉德反應(yīng)，在相同反應(yīng)效果下，加快反應(yīng)速率、降低反應(yīng)溫度。相比不加超聲作用120℃下反應(yīng)60min的反應(yīng)體系，超聲作用的反應(yīng)體系類黑精濃度能提高4.79~14.85mmol/l，反應(yīng)速率提高24.16~74.89%，同時(shí)反應(yīng)溫度降低20~30℃。

具體實(shí)施方式

在本發(fā)明中所使用的術(shù)語(yǔ)，除非有另外說(shuō)明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。下面結(jié)合具體的實(shí)施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例只是對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定，該領(lǐng)域的技術(shù)工程師可根據(jù)上述發(fā)明的內(nèi)容對(duì)本發(fā)明作出一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整。

在以下的實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過(guò)程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。所用試劑的來(lái)源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時(shí)標(biāo)明，其后所用相同試劑如無(wú)特殊說(shuō)明，均以首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。

本實(shí)施例和對(duì)照例所用草魚(yú)購(gòu)買自江蘇省鎮(zhèn)江市學(xué)府路歐尚超市。

本實(shí)施例和對(duì)照例所用魚(yú)糜由草魚(yú)肉經(jīng)絞肉機(jī)絞肉制得。

本實(shí)施例和對(duì)照例所用風(fēng)味蛋白酶購(gòu)買自無(wú)錫市聯(lián)合恒洲化工有限公司，酶活為500lapu/g。lapu指每分鐘水解1mmoll-亮氨酸-對(duì)硝基苯胺所需的酶量。

本實(shí)施例和對(duì)照例所用葡萄糖購(gòu)買自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

本實(shí)施例和對(duì)照例所用的草魚(yú)肉水解多肽干燥粉末由以下方法制備：

（1）按照25%的底物濃度（m/v）用蒸餾水配置魚(yú)糜混濁液，放入50℃恒溫水浴鍋并調(diào)節(jié)ph到6.75。

（2）按酶底（e/s）質(zhì)量比1:100加入風(fēng)味蛋白酶，酶解7.8h，用naoh溶液維持反應(yīng)體系ph維持在6.75。

（3）酶解結(jié)束，經(jīng)沸水浴和離心獲得上清液，將其濃縮、干燥后得草魚(yú)肉水解多肽干燥粉末，置于干燥皿中保存?zhèn)溆谩?/p>

其中干燥方式可以為冷凍干燥、噴霧干燥或其他合適的干燥方式。

本實(shí)施例聚能式超聲作用方法如下：

本實(shí)施例所用聚能式超聲設(shè)備購(gòu)自溫州博創(chuàng)輕工機(jī)械有限公司，型號(hào)bc-cs-1200。主要由聚能式超聲探頭、超聲發(fā)生器、超聲作用室、控制器等組成。細(xì)節(jié)操作參考說(shuō)明書(shū)。

（1）取燒杯加蒸餾水并調(diào)ph到6~8，于90~100℃下預(yù)熱，升溫到位后加入14g草魚(yú)肉水解多肽干燥粉末和2g葡萄糖并迅速混勻，將燒杯置于超聲作用室，使超聲探頭浸沒(méi)于液面以下，設(shè)置功率密度800~1200w/l后開(kāi)動(dòng)超聲發(fā)生器進(jìn)行超聲作用。

（2）超聲作用60min后，迅速冰浴降溫，終止美拉德反應(yīng)，取樣以備測(cè)定。

其中所述草魚(yú)肉水解多肽可由其他多肽或肽類衍生物簡(jiǎn)單替代。

其中所述葡萄糖可由其他還原糖簡(jiǎn)單替代。

類黑精是美拉德反應(yīng)終產(chǎn)物，類黑精濃度越高表明美拉德反應(yīng)進(jìn)行越徹底。本實(shí)施例和對(duì)照例類黑精檢測(cè)方法如下：

（1）超聲結(jié)束降溫終止反應(yīng)后取得的樣品溶液經(jīng)離心（4000r/min，10min）后，取上清液備測(cè)。

（2）每次測(cè)定樣品稀釋后取樣0.2ml加入3.5ml磷酸緩沖液（ph8.5，1/15mol/l），在420nm處測(cè)定吸光值a420。根據(jù)公式c=（a420/ε×n）/100計(jì)算類黑精濃度，其中n（這里n=18.5）為稀釋倍數(shù)，ε取500l·mol^-1·cm^-1，c為類黑精濃度，單位為mmol/l，所有樣品以蒸餾水為空白，以不使用超聲作用的草魚(yú)肉水解物干燥粉末-葡萄糖溶液為對(duì)照進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

對(duì)照1

取500ml燒杯加入500ml蒸餾水調(diào)ph到7.0，于120℃油浴中預(yù)熱15min后，加入14g草魚(yú)肉水解多肽干燥粉末和2g葡萄糖，迅速混勻并保持?jǐn)嚢瑁?20℃反應(yīng)60min。迅速冰浴降溫到4℃，終止美拉德反應(yīng)。取樣離心后取上清0.2ml，加入3.5ml磷酸緩沖液（ph8.5，1/15mol/l），在420nm處測(cè)定吸光值a420。代入公式計(jì)算類黑精濃度。樣品中類黑精的濃度為19.83±1.33mmol/l。

實(shí)施例1

取500ml燒杯加入500ml蒸餾水調(diào)ph到7.0，于90℃油浴中預(yù)熱15min后，加入14g草魚(yú)肉水解多肽干燥粉末和2g葡萄糖，迅速混勻后放入超聲作用室，使聚能式超聲探頭浸沒(méi)液面，設(shè)定超聲功率為400w，超聲作用60min后，迅速冰浴降溫到4℃，終止美拉德反應(yīng)。取樣離心后取上清0.2ml，加入3.5ml磷酸緩沖液（ph8.5，1/15mol/l），在420nm處測(cè)定吸光值a420。代入公式計(jì)算類黑精濃度。樣品中類黑精的濃度為24.62±2.07mmol/l，相比于對(duì)照1，類黑精濃度提高了4.79mmol/l。

實(shí)施例2

取500ml燒杯加入500ml蒸餾水調(diào)ph到7.0，于95℃油浴中預(yù)熱15min后，加入14g草魚(yú)肉水解多肽干燥粉末和2g葡萄糖，迅速混勻后放入超聲作用室，使聚能式超聲探頭浸沒(méi)液面，設(shè)定超聲功率為400w，超聲作用60min后，迅速冰浴降溫到4℃，終止美拉德反應(yīng)。取樣離心后取上清0.2ml，加入3.5ml磷酸緩沖液（ph8.5，1/15mol/l），在420nm處測(cè)定吸光值a420。代入公式計(jì)算類黑精濃度。樣品中類黑精的濃度為28.26±1.41mmol/l，相比于對(duì)照1，類黑精濃度提高了8.43mmol/l。

實(shí)施例3

取500ml燒杯加入500ml蒸餾水調(diào)ph到7.0，于100℃油浴中預(yù)熱15min后，加入14g草魚(yú)肉水解多肽干燥粉末和2g葡萄糖，迅速混勻后放入超聲作用室，使聚能式超聲探頭浸沒(méi)液面，設(shè)定超聲功率為400w，超聲作用60min后，迅速冰浴降溫到4℃，終止美拉德反應(yīng)。取樣離心后取上清0.2ml，加入3.5ml磷酸緩沖液（ph8.5，1/15mol/l），在420nm處測(cè)定吸光值a420。代入公式計(jì)算類黑精濃度。樣品中類黑精的濃度為31.33±1.27mmol/l，相比于對(duì)照1，類黑精濃度提高了11.50mmol/l。

實(shí)施例4

取500ml燒杯加入500ml蒸餾水調(diào)ph到7.0，于90℃油浴中預(yù)熱15min后，加入14g草魚(yú)肉水解多肽干燥粉末和2g葡萄糖，迅速混勻后放入超聲作用室，使聚能式超聲探頭浸沒(méi)液面，設(shè)定超聲功率為600w，超聲作用60min后，迅速冰浴降溫到4℃，終止美拉德反應(yīng)。取樣離心后取上清0.2ml，加入3.5ml磷酸緩沖液（ph8.5，1/15mol/l），在420nm處測(cè)定吸光值a420。代入公式計(jì)算類黑精濃度。樣品中類黑精的濃度為26.38±1.39mmol/l，相比于對(duì)照1，類黑精濃度提高了6.55mmol/l。

實(shí)施例5

取500ml燒杯加入500ml蒸餾水調(diào)ph到7.0，于95℃油浴中預(yù)熱15min后，加入14g草魚(yú)肉水解多肽干燥粉末和2g葡萄糖，迅速混勻后放入超聲作用室，使聚能式超聲探頭浸沒(méi)液面，設(shè)定超聲功率為600w，超聲作用60min后，迅速冰浴降溫到4℃，終止美拉德反應(yīng)。取樣離心后取上清0.2ml，加入3.5ml磷酸緩沖液（ph8.5，1/15mol/l），在420nm處測(cè)定吸光值a420。代入公式計(jì)算類黑精濃度。樣品中類黑精的濃度為30.45±1.68mmol/l，相比于對(duì)照1，類黑精濃度提高了10.62mmol/l。

實(shí)施例6

取500ml燒杯加入500ml蒸餾水調(diào)ph到7.0，于100℃油浴中預(yù)熱15min后，加入14g草魚(yú)肉水解多肽干燥粉末和2g葡萄糖，迅速混勻后放入超聲作用室，使聚能式超聲探頭浸沒(méi)液面，設(shè)定超聲功率為600w，超聲作用60min后，迅速冰浴降溫到4℃，終止美拉德反應(yīng)。取樣離心后取上清0.2ml，加入3.5ml磷酸緩沖液（ph8.5，1/15mol/l），在420nm處測(cè)定吸光值a420。代入公式計(jì)算類黑精濃度。樣品中類黑精的濃度為34.68±1.88mmol/l，相比于對(duì)照1，類黑精濃度提高了14.85mmol/l。