本發(fā)明涉及汞離子檢測領(lǐng)域，具體地說，涉及一種通過dna鏈雜交和表面增強拉曼技術(shù)檢測汞離子的方法。

背景技術(shù)：

汞作為一種常見的金屬，在工業(yè)中用途廣泛，但其造成的污染，對人體和環(huán)境都有很大危害。由于汞單質(zhì)具有揮發(fā)性，可通過多種渠道擴散于水和空氣中，并氧化成二價汞離子；汞離子被人體攝入后，會造成嚴重的神經(jīng)毒性、遺傳毒性和免疫毒性；而由汞離子引起的環(huán)境和健康問題也促進了檢驗方法的發(fā)展，人們開始嘗試各種方法對水溶液中的汞離子進行定量分析。

傳統(tǒng)的檢測汞離子的方法主要有化學(xué)比色法和原子吸收光譜法，其檢測靈敏度低，干擾因素多，檢測結(jié)果的穩(wěn)定性差、準確度低。近年來逐漸興起利用生物傳感器檢測汞離子的方法，主要通過含有胸腺嘧啶的dna與汞離子的特異性結(jié)合，形成t-hg²⁺-t復(fù)合物，再將可檢測的相關(guān)標記結(jié)合于dna上，進而對相關(guān)標記進行檢測；然而，目前的研究人員所設(shè)計生物傳感器的dna鏈種類多，反應(yīng)過程中易出現(xiàn)副反應(yīng)及非主鏈雜交反應(yīng)，導(dǎo)致檢測干擾增加，靈敏度降低，進而使得汞離子的檢測限不能達到檢測要求。

因此，亟待設(shè)計一種檢測干擾小且靈敏度高的汞離子檢測方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

基于現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，本發(fā)明提供一種通過dna鏈雜交和表面增強拉曼技術(shù)檢測汞離子的方法，有效解決低濃度汞離子無法檢測的難題，且保證了檢測的準確度。

本發(fā)明為了實現(xiàn)上述目的所采取的技術(shù)方案是：

通過dna鏈雜交和表面增強拉曼技術(shù)檢測汞離子的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)金納米顆粒的合成：將0.01％氯金酸加熱至沸騰，充分攪拌下加入檸檬酸鈉溶液，持續(xù)加熱20min回流冷凝，待反應(yīng)溶液顏色變化穩(wěn)定后停止加熱，保持回流至反應(yīng)溶液溫度降至室溫，于棕色瓶中4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

(2)生物條形碼的合成：對信號鏈dna進行活化，向活化后的信號鏈dna中加入步驟(1)中合成的金納米顆粒，遮光輕微震蕩24h；使用nacl老化12h，加入鏈霉親和素反應(yīng)1h，再用tris-hcl緩沖溶液洗滌并分散，4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

(3)捕獲鏈dna的固定：使用咪唑-鹽酸將磁性微球清洗干凈，依次加入edc和nhs，活化30min；然后加入捕獲鏈dna，輕微震蕩16h；對固定有捕獲鏈dna的磁性微球進行磁性分離，并用tris-hcl緩沖溶液洗滌；加入bsa反應(yīng)30min，并重復(fù)用tris-hcl緩沖溶液洗滌三次，將洗滌后的磁性微球分散于tris-hcl緩沖溶液中；

(4)靶標鏈dna的固定：將靶標鏈dna和不同濃度的汞離子加入到步驟(3)制得的溶液中，輕微震蕩反應(yīng)2h，磁性分離，用tris-hcl緩沖溶液洗滌并分散；

(5)引發(fā)鏈dna的雜交反應(yīng)：將引發(fā)鏈dna加入步驟(4)制得的溶液中，輕微震蕩反應(yīng)2h，磁性分離，用tris-hcl緩沖溶液洗滌并分散；

(6)dna雜交鏈式循環(huán)放大反應(yīng)：將末端修飾有生物素的發(fā)卡dna鏈h1及發(fā)卡dna鏈h2混合均勻，加入到步驟(5)制得的溶液中，輕微震蕩2.5h，磁性分離，用tris-hcl緩沖溶液洗滌并分散；

(7)拉曼信號的檢測：將步驟(2)中合成的生物條形碼加入到步驟(6)制得的溶液中，輕微震蕩且避光反應(yīng)1h，磁性分離，用tris-hcl緩沖溶液洗滌并分散制成檢測溶液；將檢測溶液均勻分散于金片上，蒸干液滴，于激光共聚焦拉曼顯微鏡下進行檢測，記錄拉曼信號強度，并且根據(jù)汞離子濃度和拉曼信號強度繪制工作曲線，通過所述工作曲線對所需檢測的樣品進行定量分析。

進一步地，所述信號鏈dna核苷酸序列如seqidno.1所示；所述捕獲鏈dna核苷酸序列如seqidno.2所示；所述靶標鏈dna核苷酸序列如seqidno.3所示；所述引發(fā)鏈dna核苷酸序列如seqidno.4所示；所述發(fā)卡dna鏈h1核苷酸序列如seqidno.5所示；所述發(fā)卡dna鏈h2核苷酸序列如seqidno.6所示。

進一步地，所述步驟(1)中金納米顆粒合成過程中使用的容器均經(jīng)王水泡制24h，并且使用去離子水清洗干凈，烘干密封備用。

進一步地，所述步驟(1)中合成的金納米顆粒ph值為8，粒徑為20nm。

進一步地，所述步驟(2)中的信號鏈dna的活化過程為：向1×10^-5m信號鏈dna中加入10mmtcep，活化反應(yīng)1h。

進一步地，所述步驟(2)中的老化過程為：先加入0.05mnacl老化6h，然后加入0.1mnacl續(xù)老化6h。

進一步地，所述步驟(2)-(7)中輕微震蕩時的反應(yīng)溫度為37℃。

進一步地，所述步驟(2)-(7)中洗滌及分散過程使用的tris-hcl緩沖溶液ph值為7.4。

進一步地，所述步驟(3)中磁性微球的清洗過程使用的咪唑-鹽酸溶液ph值為6.8。

進一步地，所述捕獲鏈dna的濃度為1×10^-7m；所述靶標鏈dna的濃度為1×10^-8m；所述引發(fā)鏈dna的濃度為1×10^-7m；所述發(fā)卡dna鏈h1濃度為1×10^-7m，所述發(fā)卡dna鏈h2濃度為1×10^-7m。

有益效果：本發(fā)明將捕獲鏈dna連接于磁性微球上，通過捕獲鏈dna、汞離子與靶標鏈dna間形成的t-hg²⁺-t結(jié)構(gòu)穩(wěn)定連接靶標鏈dna，再經(jīng)過引發(fā)鏈dna的固定以及發(fā)卡dna鏈循環(huán)放大雜交鏈式反應(yīng)，增加了生物條形碼的結(jié)合位點，并且根據(jù)發(fā)卡dna鏈上連接的生物素與生物條形碼上結(jié)合的鏈霉親和素之間較強的結(jié)合能力將生物條形碼連接到磁性微球上，從而實現(xiàn)了拉曼信號的放大，降低了汞離子的檢測限；本發(fā)明提供的檢測方法的干擾性小，選擇性高，滿足了對于汞離子高靈敏度、高準確度的檢測需求。

附圖說明

圖1為本發(fā)明dna鏈雜交原理圖；

圖2為本發(fā)明dna鏈雜交堿基互補配對示意圖；

圖3為本發(fā)明方案可行性分析圖；

圖4為不同濃度汞離子的拉曼信號強度圖譜；

圖5為拉曼檢測汞離子的工作曲線；

圖6為不同金屬離子的拉曼信號強度圖譜；

圖7為不同金屬離子拉曼信號1500cm^-1處峰差值；

圖8為雜交反應(yīng)溫度對拉曼信號強度的影響；

圖9為雜交反應(yīng)體系ph值對拉曼信號強度的影響；

圖10為雜交鏈式反應(yīng)時間對拉曼信號強度的影響；

圖11為捕獲dna的濃度對拉曼信號強度的影響；

附圖標記：1.金納米顆粒；2.信號鏈dna；3.鏈霉親和素；4.拉曼信號分子；5.磁性微球；6.捕獲鏈dna；7.靶標鏈dna；8.汞離子；9.引發(fā)鏈dna；10.生物素；11.發(fā)卡dna鏈h1；12.發(fā)卡dna鏈h2。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進行詳述：

實施例

如圖1-2所示，本發(fā)明基于t-hg²⁺-t的特異性及其穩(wěn)固的結(jié)合能力，引入汞離子作為靶分子，通過納米材料條形碼對大量信號分子的粘附作用、鏈霉親和素與生物素的強結(jié)合力以及循環(huán)進行的dna雜交鏈式反應(yīng)放大拉曼信號，進而降低檢測限，提高靈敏度和準確度，具體檢測方法如下：

(1)金納米顆粒的合成

首先，使用王水對合成金納米顆粒所用的容器泡制24h以上，以防止污染，然后使用去離子水進行清洗，烘干密封保存?zhèn)溆?。合成金納米顆粒時，取50ml濃度為1％的檸檬酸鈉微孔過濾除去雜質(zhì)備用；量取500μl濃度為1％的氯金酸加入50ml容量瓶中，定容至刻度線；將50ml氯金酸與轉(zhuǎn)子加入到三口燒瓶中，并將三口燒瓶置于磁力攪拌加熱套筒中，連接固定回流冷凝管，進行加熱攪拌；待溶液沸騰后，加入7ml1％的檸檬酸鈉溶液，持續(xù)加熱沸騰20min回流冷凝，觀察反應(yīng)溶液顏色由灰黑、藍紫到紫紅，最后穩(wěn)定變?yōu)槠咸丫萍t色后停止加熱，保持回流至反應(yīng)溶液溫度降至室溫，用ph計調(diào)節(jié)ph值為8，于棕色瓶中4℃保存?zhèn)溆?。合成的金納米顆粒粒徑為20nm，其大小適中，形狀規(guī)則，分散性佳，不易發(fā)生聚沉；ph值為8利于下一步生物條形碼的合成。

(2)生物條形碼的合成

取1×10^-5m信號鏈dna10μl，加入10mmtcep2μl活化1h；向活化后的信號鏈dna中加入ph值為8的金納米顆粒1ml，37℃下遮光輕微震蕩24h；反應(yīng)完畢后，加入0.05mnacl200μl老化6h，再加入0.1mnacl200μl續(xù)老化6h；老化結(jié)束后，加入1mg/ml鏈霉親和素溶液25μl反應(yīng)1h，并于10000rpm離心30min，棄去上清液，充分搖勻后使用ph值7.4的tris-hcl緩沖溶液洗滌3-5次，除去未參與反應(yīng)的物質(zhì)，然后將合成的生物條形碼均勻分散于50μlph值7.4的tris-hcl緩沖溶液中，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

信號鏈dna的5'端修飾有巰基，3'端修飾有拉曼信號分子rox，其核苷酸序列為seqidno.1：5'-sh-tttcctacggca-rox-3'；其堿基個數(shù)適中，利于減小空間位阻，從而促進與金納米顆粒的結(jié)合，并且防止生物條形碼聚沉。

上述老化反應(yīng)采用兩種濃度nacl分別老化6h，可進一步提高合成生物條形碼的性能，增加生物條形碼的連接使用率，防止生物條形碼聚沉；生物條形碼ph值為7.4，有利于提高后續(xù)dna雜交的效率和速率。

(3)捕獲鏈dna的固定

量取10μl磁性微球于ep管中，加入0.1mph值6.8的咪唑-鹽酸清洗3-5次，然后依次加入0.1medc和0.3mnhs活化磁性微球30min；向活化后的磁性微球中加入1×10^-7m捕獲鏈dna10μl，于37℃輕微震蕩16h；反應(yīng)完成后進行磁性分離，并用0.1mph值7.4的tris-hcl緩沖溶液清洗3-5次，除去未參與反應(yīng)的物質(zhì)，然后加入濃度為1％的bsa50μl，封閉位點反應(yīng)30min；最后進行磁分離，并使用ph值7.4的tris-hcl緩沖溶液洗滌3-5次，除去未參與反應(yīng)的物質(zhì)，然后將磁性微球均勻分散于50μlph值7.4的tris-hcl緩沖溶液中，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

捕獲鏈dna的3'端修飾有氨基，其核苷酸序列為seqidno.2：5'-cgggcgtttttgccgggcaatcgtctgtt-nh2-3'。磁性微球經(jīng)過羧基修飾，與帶有氨基的捕獲鏈dna相連接，方便進行磁性分離。

(4)靶標鏈dna的固定

將10μl1×10^-8m靶標鏈dna與10μl不同濃度的汞離子加入固定有捕獲鏈dna的磁性微球溶液中，于37℃輕微震蕩2h，反應(yīng)完成后進行磁分離，并使用ph值7.4的tris-hcl緩沖溶液洗滌3-5次，除去未參與反應(yīng)的物質(zhì)，然后將磁性微球均勻分散于50μlph值7.4的tris-hcl緩沖溶液中，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

靶標鏈dna核苷酸序列為seqidno.3：5'-gcccggctttaacgcccgcgccatggggatctaca-3'。此步驟中靶標鏈dna通過三個堿基ttt與捕獲鏈dna結(jié)合，形成t-hg²⁺-t結(jié)構(gòu)，從而固定到磁性微球上。

(5)引發(fā)鏈dna的雜交反應(yīng)

將10μl1×10^-7m引發(fā)鏈dna加入步驟(4)中已分散好的磁性微球溶液中，于37℃輕微震蕩2h，反應(yīng)完成后進行磁分離，并使用ph值7.4的tris-hcl緩沖溶液洗滌3-5次，除去未參與反應(yīng)的物質(zhì)，然后將磁性微球均勻分散于50μlph值7.4的tris-hcl緩沖溶液中，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

引發(fā)鏈dna核苷酸序列為seqidno.4：5'-agtctaggattcggccctcgcggtgtagatccccatggcg-3'。此步驟中，引發(fā)鏈dna與靶標鏈dna堿基互補配對，進而引入與發(fā)卡dna鏈互補配對的堿基。

(6)dna雜交鏈式循環(huán)放大反應(yīng)

取末端修飾有t3生物素的1×10^-7m發(fā)卡dna鏈h1及發(fā)卡dna鏈h2各10μl混合均勻，加入到步驟(5)制得的連接有dna鏈的磁性微球溶液中，37℃輕微震蕩2.5h，反應(yīng)完成后進行磁分離，并使用ph值7.4的tris-hcl緩沖溶液洗滌3-5次，除去未參與反應(yīng)的物質(zhì)，然后將磁性微球均勻分散于50μlph值7.4的tris-hcl緩沖溶液中，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

發(fā)卡dna鏈h1核苷酸序列為seqidno.5：5'-biotin-t3-ccgcgagggccgaatcctagactcggcgtagtctaggattcggc-3'，其5'端修飾生物素biotin-t3，第9-23個堿基與第30-44個堿基互補配對形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)；發(fā)卡dna鏈h2核苷酸序列為seqidno.6：5'-agtctaggattcggccctcgcgccgaatcctagactacgccg-biotin-t3-3'，其3'端修飾生物素biotin-t3，第1-15個堿基與第22-36個堿基互補配對形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)。引發(fā)鏈dna5'端與發(fā)卡dna鏈h1堿基互補配對的部分將發(fā)卡dna鏈h1的發(fā)卡結(jié)構(gòu)打開，而發(fā)卡dna鏈h1與發(fā)卡dna鏈h2堿基互補配對的部分繼而將發(fā)卡dna鏈h2的發(fā)卡結(jié)構(gòu)打開，而發(fā)卡dna鏈h2的5'端部分堿基結(jié)構(gòu)與引發(fā)鏈dna相同，進而使得雜交鏈式反應(yīng)不斷循環(huán)進行。

(7)拉曼信號的檢測

將步驟(2)中合成的生物條形碼加入到步驟(6)制得的溶液中，37℃輕微震蕩且避光反應(yīng)1h，反應(yīng)完畢后，進行磁性分離，并使用ph值7.4的tris-hcl緩沖溶液洗滌3-5次，除去未參與反應(yīng)的物質(zhì)，然后將磁性微球均勻分散于50μlph值7.4的tris-hcl緩沖溶液中制成檢測溶液；將檢測溶液均勻分散于金片上，以增強拉曼信號，待蒸干液滴后，于激光共聚焦拉曼顯微鏡下進行檢測，激光波長633nm，積分時間10s，曝光時間10s，功率5mw。記錄拉曼信號強度，根據(jù)汞離子濃度和拉曼信號強度繪制工作曲線，并通過工作曲線對所需檢測的樣品進行定量分析。

本步驟通過生物素與鏈霉親和素間較強的結(jié)合能力將生物條形碼連接到磁性微球上，在增強拉曼信號的同時提高了檢測的靈敏度、準確度，降低了檢測限。如圖3所示，曲線a為存在汞離子的條件下檢測得到的拉曼信號，曲線b為不存在汞離子的條件下檢測得到的拉曼信號；無汞離子存在時，靶標鏈dna不能和捕獲鏈dna結(jié)合，從而無法引發(fā)后續(xù)的雜交鏈式反應(yīng)，進而無法結(jié)合帶有拉曼信號分子的生物條形碼，故無拉曼信號檢出，由此可知，本發(fā)明檢測方法靈敏準確。

如圖4所示，由上至下依次為濃度10^-8-10^-14m的汞離子以及空白對照的拉曼檢測信號圖譜，圖5所示為拉曼檢測汞離子的工作曲線，由圖可知，隨著汞離子濃度的增加，靶標鏈dna與捕獲鏈dna的結(jié)合量增加，進而引發(fā)更多的雜交鏈式反應(yīng)，結(jié)合更多拉曼信號分子，相應(yīng)的拉曼信號分子特征峰強度也更大，而本發(fā)明對汞離子的檢測限可達10^-13m。

如圖6-7所示，對其他種類金屬離子進行對比實驗時，由于無法產(chǎn)生與汞離子相同的t-hg²⁺-t結(jié)構(gòu)，極少數(shù)靶標鏈dna與捕獲鏈dna連接，進而更少地發(fā)生后續(xù)反應(yīng)，故其拉曼信號與汞離子的拉曼信號強度差距較大，因此，本發(fā)明檢測的干擾小，準確度高。

圖8所示為雜交反應(yīng)溫度對拉曼信號強度的影響，反應(yīng)溫度由25℃到45℃，拉曼信號強度先增加后減小，溫度較低影響dna的雜交速率和反應(yīng)活性，溫度過高則dna自由能會降低，因此37℃為最佳的反應(yīng)溫度。

圖9所示為雜交反應(yīng)體系ph值對拉曼信號強度的影響，溶液的ph值直接影響dna雜交反應(yīng)，過酸或過堿均會影響dna堿基互補配對的速率和效率，以及氨基、羧基脫水縮合的效率。隨ph值的增大，拉曼信號強度先增加后減小，其中ph值7.4時達到最大值，故7.4為反應(yīng)最佳條件。

圖10所示為雜交鏈式反應(yīng)時間對拉曼信號強度的影響，反應(yīng)過程中隨著時間的延長，所生成的雙鏈dna長度不斷增加，當達到一定長度后，dna空間位阻影響拉曼信號，拉曼信號強度不再增加甚至逐漸降低，因此，反應(yīng)2.5h雜交鏈式反應(yīng)已經(jīng)達到最大狀態(tài)，故2.5h為最佳雜交鏈式反應(yīng)時間。

圖11所示為捕獲dna的濃度對拉曼信號強度的影響，捕獲dna修飾到磁珠上的濃度由10^-10到10^-5，拉曼信號先增加后減小，故10^-7為最佳的捕獲dna濃度。

以上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，本發(fā)明的保護范圍并不僅限制于本文所示的實施例，凡屬于本發(fā)明思路下的技術(shù)方案均屬于本發(fā)明的保護范圍。應(yīng)當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理前提下的若干修改和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。

sequencelisting

<110>青島科技大學(xué)

<120>通過dna鏈雜交和表面增強拉曼技術(shù)檢測汞離子的方法

<160>6

<170>patentinversion3.3

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<213>人工序列

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