本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物領(lǐng)域，涉及從海洋微生物獲得新結(jié)構(gòu)放線菌素衍生物新放線菌素A；及其制備方法和藥物應(yīng)用。

背景技術(shù)：
：

目前細(xì)菌耐藥日益嚴(yán)重，研發(fā)新的抗生素迫在眉睫。放線菌素(英文名稱：(Actinomycins)是一類色素肽類抗生素，由生色團(tuán)母核吩噁嗪酮發(fā)色團(tuán)通過酰胺鍵與兩個(gè)五肽內(nèi)酯環(huán)相連組成，具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒和抗結(jié)核活性[袁薇,焦偉華,王穎,等.放線菌素生物合成研究進(jìn)展[J].氨基酸和生物資源,2014,36(1):1-7；Anthony,B.M.；Helmut,L.The Actinomycins.In Anticancer Agents from Natural Products,Second Edition,CRC Press:2011；pp 363-382.]。近年來，本實(shí)驗(yàn)室從海洋微生物資源中研發(fā)出一系列具有生物活性的物質(zhì)的放線菌素，其中發(fā)現(xiàn)新化合物、新天然產(chǎn)物以及該新型天然產(chǎn)物的半合成方法。

至今為止，自鏈霉菌屬、小單孢菌屬和類諾卡氏菌屬等放線菌中發(fā)現(xiàn)了30多種天然放線菌素。放線菌素廣泛分布鏈霉菌屬各個(gè)種，比如抗生鏈霉菌(S.antibioticus)，小鏈霉菌(S.parvulus)，金羊毛鏈霉菌(S.chrysomallus)，綠青鏈霉菌(S.iakyrus)，弗氏鏈霉菌(S.fradiae)，灰色鏈霉菌(S.griseus)，稠李鏈霉菌東方變種(S.padanus)等。不僅在陸地上，分離自海綿的放線菌sh6004中也發(fā)現(xiàn)了放線菌素的存在[孫肇暘,楊秀萍.放線菌素研究進(jìn)展[J].首都師范大學(xué)學(xué)報(bào)自然科學(xué)版,2011,32(1):54-59.]。

本發(fā)明從一株來源于海洋放線菌鏈霉菌IMB094(Streptomyces sp.IMB094)的發(fā)酵液活性成分中，分離獲得新結(jié)構(gòu)放線菌素衍生物，新放線菌素A(Neo-actinomycins A，化合物1，式I)。此外，以放線菌素D為原料，利用化學(xué)反應(yīng)合成式I所示化合物1。體外抗菌活性表明，化合物1對(duì)包括MRSA(甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌)、MRSE(甲氧西林耐藥表皮葡萄球菌)、VRE(萬古霉素耐藥糞腸球菌、屎腸球菌)等多種耐藥菌具有較好的抗菌活性。體外細(xì)胞毒性表明，化合物1對(duì)A549細(xì)胞(人肺腺癌細(xì)胞)和HCT116(人結(jié)腸癌細(xì)胞)和HepG2(人肝癌細(xì)胞)具有良好的細(xì)胞毒性。涉及化合物1的化學(xué)結(jié)構(gòu)、制備方法、半合成方法、生物合成途徑以及抗耐藥菌和抗腫瘤活性，迄今為止，尚未見有關(guān)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
：

本發(fā)明目的之一是，提供一株產(chǎn)生放線菌素衍生物(新放線菌素A)的產(chǎn)生菌：海洋放線菌鏈霉菌，生物保藏編號(hào)為CGMCC 13680。

本發(fā)明目的之二是，提供一種放線菌素衍生物，新放線菌素A。

本發(fā)明從海洋放線菌IMB094(Streptomyces sp.IMB094)的發(fā)酵產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的新放線菌素A，其結(jié)構(gòu)如式Ⅰ所示。

化合物1：新放線菌素A(Neo-actinomycins A)

分子式C₆₆H₉₀N₁₂O₁₈，分子量1339。

本發(fā)明目的之三是，提供新放線菌素A的制備方法。

本發(fā)明所述的新放線菌素A的制備方法，包括以下步驟：

(1)將生物保藏編號(hào)為CGMCC 13680的海洋放線菌鏈霉菌IMB094菌種接種于配方為淀粉-葡萄糖-棉籽餅粉-蛋白胨-無機(jī)鹽的發(fā)酵培養(yǎng)基，在搖瓶中，28℃，搖床培養(yǎng)120h；

(2)鏈霉菌(Streptomyces sp.)IMB094發(fā)酵液經(jīng)固液分離后得到濾液和菌絲體；菌絲體用丙酮超聲提取，得到菌絲體丙酮提取物；濾液經(jīng)過大孔吸附樹脂柱吸附，依次用水、丙酮洗脫；丙酮洗脫部分與菌絲體丙酮提取物合并，減壓濃縮除去丙酮后得到發(fā)酵液浸膏；

(3)取發(fā)酵液浸膏，經(jīng)正相硅膠柱色譜分離，依次用二氯甲烷-甲醇(50:1-0:100)梯度洗脫，得到10個(gè)組分(F₁-F₁₀)；取餾分F5，F(xiàn)6和F7分別經(jīng)過色譜柱色譜分離，用甲醇洗脫，然后經(jīng)HPLC制備得到含有式Ⅰ所示化合物的混合物，混合物經(jīng)過HPLC進(jìn)行純化得到式I所示化合物。

優(yōu)選的，本發(fā)明所述的新放線菌素A的制備方法，包括以下步驟：

(1)將生物保藏編號(hào)為CGMCC 13680的海洋放線菌鏈霉菌IMB094菌種接種于配方為淀粉-葡萄糖-棉籽餅粉-蛋白胨-無機(jī)鹽的發(fā)酵培養(yǎng)基，在搖瓶中，28℃，搖床培養(yǎng)120h；

(2)鏈霉菌(Streptomyces sp.)IMB094發(fā)酵液經(jīng)固液分離后得到濾液和菌絲體；菌絲體用丙酮超聲提取，得到菌絲體丙酮提取物；濾液經(jīng)過XAD-7HP大孔吸附樹脂柱吸附，依次用水、50％丙酮、90％丙酮洗脫；50％丙酮、90％丙酮洗脫部分與菌絲體丙酮提取物合并，減壓濃縮除去丙酮后得到發(fā)酵液浸膏；

(3)取鏈霉菌(Streptomyces sp.)IMB094發(fā)酵液浸膏(25g)，經(jīng)正相硅膠柱色譜分離，依次用二氯甲烷-甲醇(50:1-0:100)梯度洗脫，得到10個(gè)組分(F₁-F₁₀)；取餾分F5(20:1洗脫,0.36g)，F(xiàn)6(9:1洗脫,0.54g)，和F7(9:1洗脫,0.65g)分別經(jīng)過Sephadex LH-20柱色譜柱色譜分離，用90％甲醇洗脫，然后經(jīng)HPLC分離純化得到混合物，將混合物在經(jīng)過HPLC進(jìn)行分離純化，收集高分辨電噴霧質(zhì)譜準(zhǔn)分子離子峰m/z 1339.6542的峰得到式I所示化合物。

步驟3)中，餾分F4、F5為二氯甲烷-甲醇(20:1)分別依次洗脫4.0L得到，

餾分F6、F7為二氯甲烷-甲醇(9:1)依次洗脫4.5L得到。

其中，第1次HPLC分離純化過程如下：

C-18色譜柱，5μm,20mm×250mm,75-100％甲醇線性梯度60min洗脫,10mL/min。

其中，第2次HPLC分離純化過程如下：

C-18色譜柱，10mm×250mm，58％MeCN含0.5％甲酸洗脫,2mL/min。

58％MeCN含0.5％甲酸：濃度為58％的乙腈溶液中，含有濃度為0.5％的甲酸。

其中，制備方法中使用的鏈霉菌，優(yōu)選為鏈霉菌(Streptomyces sp.)IMB094，系分離自中國大連黃海黑石礁海灣深度約40m的海底沉積物，該細(xì)胞株已經(jīng)保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)：CGMCC No. 13680，保藏日期2017年2月24日，分類命名：鏈霉菌，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào))。鏈霉菌(Streptomyces sp.)IMB094 16S rDNA基因序列如SEQ ID NO.1所示，提交NCBI，GenBank編號(hào)為KY111376。

本發(fā)明從海洋放線菌鏈霉菌(Streptomyces sp.)IMB094的發(fā)酵產(chǎn)物中，還發(fā)現(xiàn)式II所示化合物2、放線菌素D和X2。化合物2曾有文獻(xiàn)報(bào)道通過化學(xué)合成得到[Sengupta,S.K.et al.J.Med.Chem.1983,26,1631；Sengupta,S.K.Anticancer actinomycin D analogs.US4562176A,1985]。文獻(xiàn)中報(bào)道了該化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)、紫外光譜和分子式信息，沒有氫譜、碳譜等核磁共振波譜數(shù)據(jù)。由于化合物2作為天然產(chǎn)物是首次發(fā)現(xiàn)，因此命名為新放線菌素B。

化合物2：新放線菌素B(Neo-actinomycins B)

分子式C₆₄H₈₈N₁₂O₁₆，分子量1281。

本發(fā)明目的之四是，提供新放線菌素A的化學(xué)合成方法。

本發(fā)明所述的合成方法，是以放線菌素D(式II)為原料，合成新放線菌素A。

具體包括以下步驟：將放線菌素D(式III)與α-酮戊二酸(α-KG)分別溶解在水、DMSO或甲醇、乙醇等碳鏈≤4的醇類溶劑中，以水或含水量大于10％的混合溶劑為反應(yīng)介質(zhì)，經(jīng)一步反應(yīng)得到式Ⅰ所示的化合物。

優(yōu)選的，本發(fā)明的合成方法，包括以下步驟：

儲(chǔ)備液配置：將放線菌素D(4mg)溶解于0.5-1mL水、DMSO或甲醇、乙醇等碳鏈≤4的醇類溶劑中，配成6.4-12.8mM的溶液1；

將α-酮戊二酸(46.7mg)溶解于0.5-1mL水、DMSO或甲醇、乙醇等碳鏈≤4的醇類溶劑中，配成640-1280mM的溶液2。

合成方法：分別取50ul溶液1和溶液2，加入200ul反應(yīng)溶劑，于磁力器上加熱攪拌進(jìn)行反應(yīng)，即得。

其中，反應(yīng)溶劑選自：水、含水量大于10％以上的混合溶劑，包括但不限于丙酮水溶液、碳鏈≤4的醇溶液、乙腈水溶液。

其中，放線菌素D是為已知化合物，可以在市場(chǎng)上購買到。

本發(fā)明目的之五是，提供新放線菌素A或以其為活性成分的藥物組合物在制備抗耐藥菌中的應(yīng)用。

所述耐藥菌包括：MRSA(耐甲氧西林金黃色葡萄球菌)、MRSE(耐甲氧西林表皮葡萄球菌)、VRE(耐萬古霉素糞腸球菌、屎腸球菌)。

本發(fā)明目的之六是，提供新放線菌素A或以其為活性成分的藥物組合物在抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

其中，所述腫瘤包括：肺癌、結(jié)腸癌、肝癌。

本發(fā)明采用瓊脂稀釋法測(cè)試了所述新放線菌素A對(duì)包括MRSA、MRSE、VRE在內(nèi)多種耐藥菌的最小抑菌濃度(MIC)。采用磺酰羅丹明(SRB)染色法測(cè)試了所述新放線菌素A對(duì)包括A549細(xì)胞(人肺腺癌細(xì)胞)、HCT116(人結(jié)腸癌細(xì)胞)和HepG2(人肝癌細(xì)胞)進(jìn)行抗腫瘤活性測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示這些化合物對(duì)所試驗(yàn)的耐藥菌株具有較好的抗菌活性，對(duì)所試驗(yàn)的腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的抑制作用。表明所述放線菌素衍生物可用于制備抗耐藥菌和抗腫瘤的藥物。

而以所述衍生物作為活性成分，與藥學(xué)上可接受的一種或多種載體、賦形劑或輔料配伍，可制成抗耐藥菌感染和抗腫瘤的藥物組合物。所述藥物及藥物組合物可用于耐藥菌感染和抗腫瘤的臨床治療。所述化合物也可與已知藥物組成復(fù)方制劑用于耐藥菌感染的治療。

本發(fā)明中經(jīng)微生物發(fā)酵制備式Ⅰ所示新放線菌素A的方法，可適用于其他能產(chǎn)生此類化合物的任何微生物。

本發(fā)明的目的之七在于，提供以放線菌素衍生物A為活性成分的藥物組合物。

本發(fā)明的藥物組合物，包括放線菌素衍生物A，以及藥學(xué)上可接受的載體。

其中，藥學(xué)上可接受的載體以重量計(jì)是藥物組合物總重量的0.1-99.9％。

其中，藥學(xué)上可接受的載體包括甘露醇、山梨醇、山梨酸或鉀鹽、焦亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉、鹽酸半胱氨酸、巰基乙酸、蛋氨酸、維生素A、維生素C、維生素E、維生素D、氮酮、EDTA二鈉、EDTA鈣鈉，一價(jià)堿金屬的碳酸鹽、醋酸鹽、磷酸鹽或其水溶液、鹽酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化鈉、氯化鉀、乳酸鈉、木糖醇、麥芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纖維素及其衍生物、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、丙二醇、乙醇、土溫60-80、司班-80、蜂蠟、羊毛脂、液體石蠟、十六醇、沒食子酸酯類、瓊脂、三乙醇胺、堿性氨基酸、尿素、尿囊素、碳酸鈣、碳酸氫鈣、表面活性劑、聚乙二醇、環(huán)糊精、β－環(huán)糊精、磷脂類材料、高嶺土、滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、微晶中一種或以上；優(yōu)選所述的載體為微晶纖維素、乳糖、淀粉、羧甲基纖維素鈉、低取代羥丙基纖維素、滑石粉中一種或以上。

本發(fā)明的藥物組合物，可以制備成任何要用劑型。所述的制劑為片劑、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、溶液劑、注射劑、栓劑、軟膏劑、硬膏劑、霜?jiǎng)?、噴霧劑、貼劑任意一種；優(yōu)選所述的制劑為膠囊劑、顆粒劑或片劑。

發(fā)明效果：

本發(fā)明從來源于海洋放線菌IMB094(Streptomyces sp.IMB094)的發(fā)酵產(chǎn)物中，獲得如式Ⅰ所示的放線菌素衍生物：新放線菌素A。以放線菌素D為原料，通過化學(xué)合成式Ⅰ所示化合物。體外抗菌活性表明，式Ⅰ所示化合物對(duì)包括MRSA(耐甲氧西林金黃色葡萄球菌)、MRSE(耐甲氧西林表皮葡萄球菌)、VRE(耐萬古霉素糞腸球菌、屎腸球菌)等多種耐藥菌具有較好的抗菌活性。體外細(xì)胞毒性表明，式Ⅰ所示化合物對(duì)A549細(xì)胞(人肺腺癌細(xì)胞)、HCT116(人結(jié)腸癌細(xì)胞)、HepG2(人肝癌細(xì)胞)具有較強(qiáng)的抗腫瘤細(xì)胞活性，有望開發(fā)成為臨床上抗耐藥菌和抗腫瘤的新型藥物。

附圖說明：

圖1：鏈霉菌(Streptomyces sp.)IMB094的16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析

圖2：化合物1的高分辨電噴霧質(zhì)譜

圖3：化合物1的¹H NMR譜

圖4：化合物1的¹³C NMR譜

具體實(shí)施方式：

本發(fā)明實(shí)施方案適用于從任何微生物，而不限于從鏈霉菌發(fā)酵液制備放線菌素及其衍生物。以下所列實(shí)施例是為幫助本領(lǐng)域技術(shù)人員更好的理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。

<實(shí)施例1>鏈霉菌(Streptomyces sp.)IMB094的鑒定

a)菌株來源：鏈霉菌(Streptomyces sp.)IMB094由本實(shí)驗(yàn)室從中國大連黃海黑石礁海灣(38°49'N,121°34'E)深度約40m的海洋沉積物中分離獲得。

b)菌株鑒定：根據(jù)16S rRNA基因序列在微生物種屬中的保守性，對(duì)鏈霉菌(Streptomyces sp.)IMB094進(jìn)行鑒定。提取鏈霉菌(Streptomyces sp.)IMB094的基因組，PCR擴(kuò)增其16S rRNA基因并進(jìn)行測(cè)序，提交到NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫獲得登陸號(hào)為KY111376，其序列如SEQ ID NO.1所示。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹如圖1所示。

SEQ ID NO.1

表明，該菌屬于鏈霉菌科鏈霉菌屬中的一種，據(jù)此將該菌命名為鏈霉菌(Streptomyces sp.)IMB094，并于2017年2月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為：CGMCC 13680。

<實(shí)施例2>鏈霉菌(Streptomyces sp.)IMB094的發(fā)酵

取活化的鏈霉菌(Streptomyces sp.)IMB094平板，挑取約1cm²菌苔接種于100mL發(fā)酵培養(yǎng)基[配方為：淀粉1.0g，葡萄糖2.5g，棉籽餅粉1.0g，蛋白胨0.3g，無機(jī)鹽如KH₂PO₄0.01g，MgSO₄ 0.01g，NaCl 0.5g，CaCO₃ 0.5g等，去離子水100mL]，在500mL搖瓶中，28℃，200r/min搖床培養(yǎng)120h。

<實(shí)施例3>發(fā)酵液的提取與浸膏的獲得

鏈霉菌(Streptomyces sp.)IMB094發(fā)酵液經(jīng)固液分離后得到濾液和菌絲體；菌絲體用丙酮超聲提取，得到菌絲體丙酮提取物；濾液經(jīng)過XAD-7HP大孔吸附樹脂柱吸附，依次用水、50％、90％丙酮洗脫；50％、90％丙酮洗脫部分與菌絲體丙酮提取物合并，減壓濃縮除去丙酮后得到發(fā)酵液浸膏。

<實(shí)施例4>化合物1的分離、制備及結(jié)構(gòu)鑒定

取鏈霉菌(Streptomyces sp.)IMB094發(fā)酵液浸膏(25g)，經(jīng)正相硅膠柱色譜分離，依次用二氯甲烷-甲醇(50:1-0:100)梯度洗脫，得到10個(gè)組分(F1-F10)；其中，餾分F1-F3為二氯甲烷-甲醇(50:1)分別洗脫3L得到，餾分F4-F5為二氯甲烷-甲醇(20:1)分別依次洗脫4.0L得到，餾分F6-F7為二氯甲烷-甲醇(9:1)依次洗脫4.5L得到。取餾分F5(20:1,0.36g)，F(xiàn)6(9:1,0.54g)，和F7(9:1,0.65g)分別經(jīng)過Sephadex LH-20柱色譜柱用90％甲醇洗脫，經(jīng)過HPLC制備(Capcell MGII 5μm,20mm×250mm,75-100％MeOH線性梯度60min,10mL/min)分別得到混合物1(tR：23.96-30.60min)和混合物2(tR：34.25-41.26)?；旌衔?經(jīng)HPLC進(jìn)行再次純化(10mm×250mm C-18column，58％MeCN含0.5％甲酸)，收集高分辨電噴霧質(zhì)譜(HRESIMS)準(zhǔn)分子離子峰m/z 1339.6542的峰得到新放線菌素A；混合物2經(jīng)HPLC進(jìn)行再次純化(10mm×250mm C-18column，75％MeCN含0.5％甲酸)，收集HRESIMS準(zhǔn)分子離子峰m/z 1281.6512得到新放線菌素B。

式Ⅰ所示化合物1：新放線菌素A結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1為紅色粉末，易溶于甲醇、丙酮、氯仿、DMSO，略溶于水。高分辨電子噴霧質(zhì)譜(HRESIMS)顯示出準(zhǔn)分子離子峰m/z 1339.6542[M+H]⁺(圖2)，結(jié)合核磁共振波譜(NMR)數(shù)據(jù)，確定其分子式為C₆₆H₉₀N₁₂O₁₈，提示分子中有28個(gè)不飽和鍵。根據(jù)化合物1的紅外光譜，提示結(jié)構(gòu)中含有羰基碳(1743cm^-1)，酰胺鍵(1647cm^-1)和芳香環(huán)(1505cm^-1)。氫譜(¹H NMR，圖3)顯示出多肽類化合物的特征信號(hào)，包括5個(gè)氨基NH質(zhì)子(δ_H 7.2-11.7)，12氨基酸α-質(zhì)子(δ_H 3.2-6.3)，和2個(gè)酯鍵質(zhì)子(δ_H 5.14和5.24)。此外，氫譜中觀察到兩個(gè)鄰位取代的芳香質(zhì)子[δ_H 6.62(d,H-8)和7.11(d,H-7)]，4個(gè)氮甲基NMe質(zhì)子[δ_H 2.75(s,6H)和3.19(s,6H)]以及另外12個(gè)甲基信號(hào)(δ_H 0.7-2.3)?；衔?的碳譜(¹³C NMR，圖4)和DEPT譜，顯示出13個(gè)羰基碳信號(hào)(δc 165-173)，10個(gè)α-氨基酸碳(δc 51-70)，提示化合物1為多肽類化合物。碳譜中的其它碳信號(hào)還包括16個(gè)甲基，8個(gè)亞甲基，2個(gè)sp²次甲基，6個(gè)sp³次甲基，和11個(gè)sp²季碳信號(hào)(δc 100-165)，這些信號(hào)與已知放線菌素類化合物特征相同[Bitzer,J.；Streibel,M.；Langer,H.-J.；Grond,S.Org.Biomol.Chem.2009,7,444；Sengupta,S.K.；Madhavarao,M.S.；Kelly,C.；Blondin,J.J.Med.Chem.1983,26,1631.]。將化合物1和放線菌素D的氫譜和碳譜數(shù)據(jù)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)化合物肽內(nèi)酯環(huán)上的氫、碳原子化學(xué)位移基本一致，但是在生色基團(tuán)的氫、碳譜數(shù)據(jù)有顯著區(qū)別，提示化合物1的生色基團(tuán)母核發(fā)生了改變。化合物1的紫外(UV)光譜最大吸收峰(410nm)較放線菌素D發(fā)生紅移的佐證了上述推測(cè)。

全面分析二維核磁共振波譜數(shù)據(jù)(HSQC,COSY,HMBC)，揭示化合物1中含有10個(gè)氨基酸殘基：2個(gè)蘇氨酸殘基(Thr),2個(gè)纈氨酸殘基(Val),2脯氨酸殘基(Pro),2個(gè)氮甲基甘氨酸(Sar),2個(gè)氮甲基纈氨酸殘基(MeVal)。經(jīng)過HMBC譜相關(guān)信號(hào)分析，表明這些氨基酸殘基的連接順序與放線菌素D完全一致。HSQC譜顯示，兩個(gè)芳香質(zhì)子H-7和H-8與兩個(gè)重疊的碳信號(hào)δ_C 122.0(C-7和C-8)相關(guān)。在HMBC光譜中，H-8與C-6(δ_C 113.4)、C-9a(δ_C 140.7)和甲基碳C-12(δ_C 14.8)在相關(guān)信號(hào),，而H-7與C-5a(δ_C 131.3),C-6,C-9(δ_C 127.5)和羰基碳C-14(δ_C 166.6)存在相關(guān)峰。δ_H 11.74處的氨基NH活潑氫質(zhì)子與C-4(δ_C 100.2),C-4a,C-6,C-9a和C-10a(δ_C 139.5)有相關(guān)信號(hào)，δ_H 2.27(s,H₃-13)與C-10a,C-11(δ_C 111.8)和C-11a有相關(guān)信號(hào)。根據(jù)這些HMBC相關(guān)信號(hào)，結(jié)合質(zhì)子和碳的化學(xué)位移，可以確定分子中存在9,11-二甲基-5H-吩噁嗪結(jié)構(gòu)。根據(jù)C-11a(δ_C 143.5)的化學(xué)位移，表明該sp²雜化碳與氧原通過C-O單鍵相連，而不是在經(jīng)典的放線菌素結(jié)構(gòu)中的C＝O雙鍵。此外，C-18的化學(xué)位移(δ_C 173.1)表明該碳原子為游離羧基碳。從相互偶合的亞甲基質(zhì)子H₂-16(δ_H 3.17)和H₂-17(δ_H 2.89)與C-18和另一個(gè)季碳δ_C 165.8(C-2)均存在相關(guān)峰，揭示了分子中存在N＝CCH₂CH₂COOH結(jié)構(gòu)單元。該結(jié)構(gòu)單元，與之前確定的兩個(gè)肽鏈單元以及11a-O-9,11-二甲基-5H-吩惡嗪，共有27個(gè)不飽和度。根據(jù)分子式確定的28個(gè)不飽和度，說明化合物1還存在一個(gè)環(huán)，提示季碳C-2分別經(jīng)氮原子和氧原子與C-3和C-11相連，形成一個(gè)噁唑環(huán)，從而最終確定了化合物1的平面結(jié)構(gòu)。

化合物1中氨基酸的絕對(duì)構(gòu)型經(jīng)酸水解后利用高級(jí)Marfey法得到確定，與放線菌素D中的氨基酸殘基構(gòu)型一致。通過比較水解產(chǎn)物與L-和D/L-FDLA形成的衍生物的HPLC保留時(shí)間，表明除纈氨酸為D-構(gòu)型外，基余氨基酸為L-構(gòu)型。因此，化合物1的結(jié)構(gòu)確定為如式I所示，該化合物未見文獻(xiàn)報(bào)道，為新結(jié)構(gòu)化合物，命名為新放線菌素A(Neo-actinomycin A)。

新放線菌素A(1)的理化數(shù)據(jù)：紅色無定形粉末；[α]²⁰_D-97.7(c 0.35，MeOH)；UV(MeOH)λ_max(logε)251(4.50),410(4.12)nm；ECD(c 1.89×10^-4M，MeOH)λ_max(Δε)210(-27.4)，242(+1.1)，277(-7.0)，405(-2.0)nm；IR v_max 3397,2922，1743，1647，1505，1467，1259，1194，1098cm^-1；¹H NMR(DMSO-d₆，600MHz，圖2)和¹³C NMR(DMSO-d₆,150MHz，圖3)數(shù)據(jù)，見表1；HRESIMS m/z 1339.6542[M+H]⁺(計(jì)算值C₆₆H₉₁N₁₂O₁₈，1339.6569),1361.6355[M+Na]⁺(計(jì)算值C₆₆H₉₀N₁₂O₁₈Na,1361.6388)。

表1.新放線菌素A的¹H和¹³C NMR數(shù)據(jù)(DMSO-d₆)

^a1H and ¹³C NMR data were recorded at 600and 150MHz,respectively.

<實(shí)施例5>化合物1的抗菌活性試驗(yàn)

1、實(shí)驗(yàn)材料

檢定菌株：Staphylococcus aureus ATCC29213(甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌)；Staphylococcus aureus 15(甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌)；Staphylococcus aureus ATCC33591(甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌)；Staphylococcus aureus 13-17(甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌)；Staphylococcus aureus 13-18(甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌)；Staphylcoccus epidermidis ATCC12228(甲氧西林敏感表皮葡萄球菌)；Staphylococcus epidermidis 13-1(甲氧西林敏感表皮葡萄球菌)；Staphylococcus epidermidis 13-3(甲氧西林敏感表皮葡萄球菌)；Enterococcus faecalis ATCC29212(萬古霉素敏感糞腸球菌)；Enterococcus faecalis 13-4(萬古霉素敏感糞腸球菌)；Enterococcus faecalis ATCC51299(萬古霉素耐藥糞腸球菌)；Enterococcus faecalis ATCC51575(萬古霉素耐藥糞腸球菌)；Enterococcus faecalis ATCC700221(萬古霉素耐藥屎腸球菌)；Enterococcus faecalis 12-1(萬古霉素耐藥屎腸球菌)；Enterococcus faecium 13-71(萬古霉素敏感屎腸球菌)；Escherichia coli ATCC 25922(大腸埃希菌)；Escherichia coli 1515(大腸埃希菌)；Escherichia coli 14-10(大腸埃希菌)；Escherichia coli 14-11(ESBLsg耐藥大腸埃希菌)；Klebsiella pneumoniae ATCC 700603(ESBLs耐藥肺炎克雷伯桿菌)；Klebsiella pneumoniae 7(肺炎克雷伯桿菌)；Klebsiella pneumoniae ATCC BAA-2146(產(chǎn)NDM-1肺炎克雷伯桿菌)；Klebsiella pneumoniae 14-4(肺炎克雷伯桿菌)；Klebsiella pneumoniae 14-15(產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯桿菌)；Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853(銅綠假單胞菌)；Pseudomonas aeruginosa PAO1(銅綠假單胞菌)；Pseudomonas aeruginosa 13-46(銅綠假單胞菌)；Acinetobacter calcoacetious ATCC 19606(鮑曼不動(dòng)桿菌)；Enterobacter cloacae ATCC 43560(陰溝腸桿菌)；Enterobacter aerogenes ATCC 13048(產(chǎn)氣腸桿菌)；Serratia marcescens ATCC 21074(粘質(zhì)沙雷氏菌)；Morganella morganii ATCC 25830(摩氏摩根菌)；Providentia rettgeri(雷極普魯菲登桿菌)ATCC 31052；Proteus vulgaris ATCC 29905(普通變形桿菌)；Proteus mirabilis 13-1(奇異變形桿菌)；Stenotrophomonas maltophilia ATCC 13636(嗜麥芽假單孢菌)；Citrobacter freundii ATCC 43864(弗勞地枸櫞酸菌)。以上菌株由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所藥理室保存。

LB肉湯培養(yǎng)基：酵母提取物0.5g，胰蛋白胨1.0g，NaCl 0.5g，蒸餾水100mL，pH 7.4～7.6。

LB瓊脂培養(yǎng)基:酵母提取物0.5g，胰蛋白胨1.0g，NaCl 0.5g，蒸餾水100mL，瓊脂2.0g，pH 7.4～7.6。

Mueller-Hinton肉湯培養(yǎng)基：牛肉膏0.2g，可溶性淀粉0.15g，酸水解酪蛋白1.75g，蒸餾水100mL，pH值7.4±0.2。

Mueller-Hinton瓊脂培養(yǎng)基：牛肉膏0.2g，可溶性淀粉0.15g，酸水解酪蛋白1.75g，蒸餾水100mL，瓊脂2.0g，pH值7.4±0.2。

CM0984VRE BROTH BASE培養(yǎng)基(購自O(shè)XOID公司)。

CM0984VRE AGAR BASE培養(yǎng)基：每100mL CM0984VRE BROTH BASE中加入2.0g瓊脂。

對(duì)照樣品：左氧沙星(購自中國食品藥品檢定院)。

2、實(shí)驗(yàn)方法

采用瓊脂稀釋法測(cè)定樣品對(duì)各株檢定菌的MIC值，具體如下：

a)樣品配置：精確稱取適量左氧沙星，溶于純水中，配置成一定終濃度溶液，然后用純水按倍比稀釋成所需濃度溶液，供活性測(cè)試用；精確稱取適量的化合物1樣品以及其他化合物樣品，溶于二甲基亞砜(DMSO)中，配置成一定終濃度溶液，然后用DMSO按倍比稀釋成所需濃度溶液，供活性測(cè)試用。

b)含藥瓊脂平板制備：將已倍比稀釋的不同濃度的樣品分別加入已加熱溶解，并在45～50℃水浴中平衡的Mueller-Hinton瓊脂培養(yǎng)基(或LB瓊脂培養(yǎng)基、CM0984VRE AGAR BASE培養(yǎng)基)中，充分混勻傾倒滅菌平皿，瓊脂厚度3～4mm；按1∶9比例配制藥物瓊脂平板；各含藥瓊脂平板的樣品終濃度分別為0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16、32、64、128、256μg/mL。

c)接種物制備與接種：取各檢定菌甘油管按1％(v/v)接種于約3mL液體Mueller-Hinton肉湯培養(yǎng)基；接種后于37℃，200rpm振搖培養(yǎng)過夜；菌液根據(jù)菌濃稀釋，以多點(diǎn)接種器吸取制備好菌液(約1～2μl)接種于瓊脂平板表面，各檢定菌使用與制備菌液相同的培養(yǎng)基制備瓊脂平板。每點(diǎn)菌數(shù)約為10⁴CFU(菌落形成單位)，形成直徑為5～8mm的菌斑，接種好后置35℃孵育18h。

d)結(jié)果判斷：將平板置于暗色、無反光物體表面上判斷試驗(yàn)終點(diǎn)，以肉眼可見的抑制細(xì)菌生長的最低加藥濃度為最低抑菌濃度(MIC)。

3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：式I、II、III所示新放線菌素A以及對(duì)照樣品對(duì)20株檢定菌的MIC值見表5。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，新放線菌素A對(duì)包括MRSA和VRE在內(nèi)的15株檢定菌，顯示出這些化合物具有良好的抗菌活性，絕大部分的MIC值在1～64μg/mL；式I所示新放線菌素A可用作抗耐藥菌感染的藥物，或以其為活性成分，與藥學(xué)上可接受的一種或多種載體、賦形劑或輔料配伍，制成抗耐藥菌感染的藥物組合物。

表3.放線菌素衍生物體外抗菌活性結(jié)果(MIC，單位ug/mL)

<實(shí)施例6>新放線菌素A抗腫瘤活性試驗(yàn)

1、實(shí)驗(yàn)材料

檢定細(xì)胞株：A549細(xì)胞(人肺腺癌細(xì)胞)、HCT116(人結(jié)腸癌細(xì)胞)和HepG2(人肝癌細(xì)胞)。

所需試劑：三羥甲基氨基甲烷(Tris)、醋酸、三氯醋酸(TCA)、磺酰羅丹明(SRB，sigma S9012)、96孔板、10mM Tris溶液(pH10.5)、1％醋酸、50％三氯醋酸(TCA)、SRB溶液(0.4％SRB和1％醋酸)。

實(shí)驗(yàn)儀器：細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備2、酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(檢測(cè)波長490nm、515nm)。

2、實(shí)驗(yàn)方法

2.1給藥

根據(jù)腫瘤細(xì)胞生長速率，將處于對(duì)數(shù)生長期的貼壁腫瘤細(xì)胞以200μL/孔接種于96孔培養(yǎng)板，貼壁生長24h后加藥，每個(gè)濃度設(shè)3復(fù)孔。并設(shè)相應(yīng)濃度的生理鹽水溶媒對(duì)照及無細(xì)胞調(diào)零孔。腫瘤細(xì)胞在37℃、5％CO₂條件下培養(yǎng)72h。

2.2固定

取出培養(yǎng)板，每孔加入50％(m/v)的三氯乙酸(TCA)50uL固定細(xì)胞，4℃放置lh。若培養(yǎng)的是懸浮細(xì)胞。則加80％的冷TCA50uL，TCA的終濃度為16％，先靜置5min，再放入4℃冰箱中1h。

2.3洗滌

棄固定液，用蒸餾水洗滌5次，空氣中自然干燥。

2.4染色

在空氣中干燥后，每孔加SRB溶液100uL，室溫下放置10-30min。

2.5洗滌

去上清液，用1％醋酸洗滌5次，空氣干燥。

2.6溶解

最后加入150μL/孔的Tris溶液，在平板振蕩器上振蕩5min。

2.7測(cè)量

在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定OD值，用空白對(duì)照調(diào)零，所用波長為515nm。

2.8計(jì)算

按以下公式計(jì)算腫瘤細(xì)胞生長的抑制率：抑制率＝[(OD_{515對(duì)照孔}－OD_515給藥孔)/OD_{515對(duì)照孔}]×100％。

根據(jù)各濃度抑制率，采用Logit法計(jì)算半數(shù)抑制濃度IC50。以上每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)2～3次，求出2～3次實(shí)驗(yàn)的平均IC50。值作為最終指標(biāo)。

2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果顯示，新放線菌素A(1)對(duì)A549、HCT116和HePG2均具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒活性，IC50在納摩爾水平(見表4)。

表4放線菌素衍生物體外細(xì)胞毒活性結(jié)果(IC₅₀，單位：nM)

<實(shí)施例7>新放線菌素A的前體添加原位合成試驗(yàn)

向500ml錐形瓶中加入100ml M8培養(yǎng)基，接種鏈霉菌(Streptomyces sp.)IMB094的孢子懸浮液。28℃恒溫培養(yǎng)4天后，向培養(yǎng)基中分別加入1mg/ml的α-酮戊二酸和丙酮酸，繼續(xù)在28℃恒溫200rpm搖床培養(yǎng)1天。

后處理：將處理過發(fā)酵液和未經(jīng)任何處理的陰性對(duì)照發(fā)酵液，離心取上清，上清液用乙酸乙酯萃取。將乙酸乙酯萃取液用HPLC-MS進(jìn)行液質(zhì)分析。

分析條件：Capcell MGII C-18 3μM，3.0mm×150mm；流動(dòng)相A(0.1％甲酸水溶液)，流動(dòng)相B(乙腈加入0.1％甲酸)；線性梯度：0-30min，35-80％流動(dòng)相B；流速，0.5mL/min。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：與未添加前體的陰性對(duì)照相比，加入α-酮戊二酸后發(fā)酵液中新放線菌素A含量明顯提高。

<實(shí)施例8>新放線菌素A的化學(xué)合成試驗(yàn)

儲(chǔ)備液配置：將放線菌素D(4mg)溶解于0.5mL水、DMSO或甲醇、乙醇等碳鏈≤4的醇類溶劑中，配成6.4mM的溶液1；

將α-酮戊二酸(46.7mg)溶解于0.5mL水、DMSO或甲醇、乙醇等碳鏈≤4的醇類溶劑中，配成640mM的溶液2。

合成方法：分別取50ul溶液1和溶液2，加入反應(yīng)溶劑200ul水中，于磁力器上加熱攪拌進(jìn)行反應(yīng)，36小時(shí)然后進(jìn)行HPLC-MS檢測(cè)，結(jié)果表明新線菌素A的反應(yīng)產(chǎn)率為10％左右。若使用甲醇作為反應(yīng)溶劑，反應(yīng)無法進(jìn)行。

其中，反應(yīng)溶劑選自：水、含水量大于10％以上的混合溶劑，包括但不限于丙酮水溶液、碳鏈≤4的醇溶液、乙腈水溶液。

序 列 表

<110> 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所

<120> 新放線菌素A及其制備方法和用途

<160> 1

<210> 1

<211> 1424

<212> DNA

<213> Streptomyces sp. IMB094

<220>

<223> 16SrDNA

<400>

1 cgggtcaacc ttcgacagct ccctcccaca aggggttggg ccaccggctt cgggtgttac

61 cgactttcgt gacgtgacgg gcggtgtgta caaggcccgg gaacgtattc accgcagcaa

121 tgctgatctg cgattactag caactccgac ttcatggggt cgagttgcag accccaatcc

181 gaactgagac cggctttttg agattcgctc cacctcacgg tatcgctgct ctttgtaccg

241 gccattgtag cacgtgtgca gcccaagaca taaggggcat gatgacttga cgtcgtcccc

301 accttcctcc gagttgaccc cggcggtctc ctgtgagtcc ccatcatccc gaaggacatg

361 ctggcaacac agaacaaggg ttgcgctcgt tgcgggactt aacccaacat ctcacgacac

421 gagctgacga cagccatgca ccacctgtac accgaccaca agggggcgac catctctggc

481 cgtttccggt gtatgtcaag ccttggtaag gttcttcgcg ttgcgtcgaa ttaagccaca

541 tgctccgctg cttgtgcggg cccccgtcaa ttcctttgag ttttagcctt gcggccgtac

601 tccccaggcg gggaacttaa tgcgttagct gcggcaccga cgacgtggaa tgtcgccaac

661 acctagttcc caccgtttac ggcgtggact accagggtat ctaatcctgt tcgctcccca

721 cgctttcgct cctcagcgtc agtaatggcc cagagatccg ccttcgccac cggtgttcct

781 cctgatatct gcgcatttca ccgctacacc aggaattccg atctccccta ccacactcta

841 gctagcccgt atcgaatgca gacccggggt taagccccgg gctttcacac ccgacgtgac

901 aagccgccta cgagctcttt acgcccaata attccggaca acgcttgcgc cctacgtatt

961 accgcggctg ctggcacgta gttagccggc gcttcttctg caggtaccgt cactttcgct

1021 tcttccctgc tgaaagaggt ttacaacccg aaggccgtca tccctcacgc ggcgtcgctg

1081 catcaggctt tcgcccattg tgcaatattc cccactgctg cctcccgtag gagtctgggc

1141 cgtgtctcag tcccagtgtg gccggtcgcc ctctcaggcc ggctacccgt cgtcgccttg

1201 gtgagccatt acctcaccaa caagctgata ggccgcgggc tcatcctgca ccgccggagc

1261 tttcgaccct cacagatgcc tgcaagagtg atatccggta ttagaccccg tttccagggc

1321 ttgtcccaga gtgcagggca gattgcccac gtgttactca cccgttcgcc actaatccac

1381 cccgaagggc ttcatcgttc gacttgcatg tgtaagcacc cgcc