本發(fā)明涉及基因轉(zhuǎn)錄活性的檢測(cè)，尤其是節(jié)律基因轉(zhuǎn)錄活性的檢測(cè)。

背景技術(shù)：

基因的轉(zhuǎn)錄活性直接影響著動(dòng)物和人的生理功能和行為，研究基因的轉(zhuǎn)錄是生物學(xué)研究中的一個(gè)重要方向。real-timepcr技術(shù)是檢測(cè)基因體外轉(zhuǎn)錄活性的一種常用方法之一，通過(guò)建立轉(zhuǎn)錄水平報(bào)告系統(tǒng)的細(xì)胞系也是體外檢測(cè)組織和細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄活性的一種常用方法。然而不論是real-timepcr還是體外建立細(xì)胞系，只適合進(jìn)行體外研究，無(wú)法進(jìn)行在體實(shí)驗(yàn)，且沒(méi)有實(shí)時(shí)性。在生物鐘節(jié)律研究中，人們通過(guò)用節(jié)律基因per2、bmal1的啟動(dòng)子來(lái)誘導(dǎo)熒光素霉的表達(dá)，通過(guò)體外(例如在加有熒光素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞和腦片組織)連續(xù)記錄螢光發(fā)光的強(qiáng)度，來(lái)指示不同基因(cry1，per1，per2，以及bmal1等等)的轉(zhuǎn)錄水平，人們發(fā)現(xiàn)利用這種方法可以很好的顯示出這些基因24小時(shí)周期性的轉(zhuǎn)錄。隨著近十幾年來(lái)發(fā)展，基于螢光素發(fā)光的成像是目前能夠連續(xù)檢測(cè)基因轉(zhuǎn)錄活性和表達(dá)水平的唯一方法。

雖然利用螢光素發(fā)光技術(shù)體外研究基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)取得了很大成功，但是該技術(shù)有多處缺點(diǎn)，給相關(guān)研究帶來(lái)很大的限制，尤其是在體檢測(cè)方面。現(xiàn)有技術(shù)(tahara,y.,kuroda,h.,saito,k.,nakajima,y.,kubo,y.,ohnishi,n.,seo,y.,otsuka,m.,fuse,y.,ohura,y.,etal.(2012).invivomonitoringofperipheralcircadianclocksinthemouse.currbiol22,1029-1034)基于螢光素發(fā)光的成像需要給動(dòng)物注射螢光素，且成像時(shí)動(dòng)物必須麻醉以保持不動(dòng)，拍攝完照片后需要將動(dòng)物放回飼養(yǎng)籠，完成一次成像，下次實(shí)驗(yàn)需要重復(fù)這一過(guò)程；圖像的拍攝在一個(gè)封閉的箱體中完成，通過(guò)箱體頂部的二維感光元件(例如em-ccd相機(jī))進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間曝光，得到影像；最后得到不同時(shí)間段的圖像信號(hào)的強(qiáng)弱，判斷基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平。這種實(shí)驗(yàn)方法需要反復(fù)麻醉動(dòng)物，動(dòng)物不能自由活動(dòng)，時(shí)間分辨率差，實(shí)驗(yàn)時(shí)需要避光，僅適合短期實(shí)驗(yàn)，無(wú)法長(zhǎng)時(shí)間(例如連續(xù)數(shù)小時(shí)甚至數(shù)天)連續(xù)監(jiān)測(cè)，缺點(diǎn)非常明顯。

近幾年有研究人員對(duì)這一實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行了改進(jìn)。camillesaini等人設(shè)計(jì)了一個(gè)特殊的實(shí)驗(yàn)裝置(saini,c.,liani,a.,curie,t.,gos,p.,kreppel,f.,emmenegger,y.,bonacina,l.,wolf,j.p.,poget,y.a.,franken,p.,etal.(2013).real-timerecordingofcircadianlivergeneexpressioninfreelymovingmicerevealsthephase-settingbehaviorofhepatocyteclocks.genesdev27,1526-1536)。他們將小動(dòng)物成像儀頂部的ccd改成光電倍增管，以增加探測(cè)靈敏度和信噪比，同時(shí)將箱體內(nèi)表面設(shè)計(jì)成反光的錐形面，以盡量將動(dòng)物體內(nèi)發(fā)出的生物螢光反射到頂部的光電倍增管中，增加探測(cè)效率。實(shí)驗(yàn)前將裝有螢光素的滲透壓泵植入動(dòng)物體內(nèi)，實(shí)驗(yàn)時(shí)無(wú)需麻醉動(dòng)物，但每次曝光仍然很長(zhǎng)，記錄的是來(lái)自動(dòng)物全身發(fā)出的螢光光子，這樣可連續(xù)記錄幾天，動(dòng)物可在箱體內(nèi)自由活動(dòng)。這種方法解決了動(dòng)物反復(fù)麻醉的問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)了連續(xù)記錄。然而這種探測(cè)方法沒(méi)有空間分辨信息，無(wú)法判斷記錄到的螢光光子來(lái)自何種組織，何種細(xì)胞。螢光素發(fā)光信號(hào)較弱，動(dòng)物骨骼和皮毛對(duì)光造成阻擋，因此記錄到信號(hào)的信噪比較差，且一般只適用于淺表層組織。而且這種實(shí)驗(yàn)只能在嚴(yán)格避光環(huán)境下進(jìn)行，難以保證正常的光照節(jié)律。綜上所述，目前基于生物螢光發(fā)光的在體基因轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)存在信號(hào)微弱，信噪比差，要求嚴(yán)格避光，需要持續(xù)提供螢光素底物等等問(wèn)題，這些難點(diǎn)使得連續(xù)實(shí)時(shí)在體基因轉(zhuǎn)錄活性檢測(cè)一直難以實(shí)現(xiàn)。

早在2001年，yamaguchi等人在nature上發(fā)表了一項(xiàng)通過(guò)植入光纖記錄動(dòng)物體內(nèi)生物素螢光信號(hào)的文章(yamaguchi,s.,kobayashi,m.,mitsui,s.,ishida,y.,vanderhorst,g.t.,suzuki,m.,shibata,s.,andokamura,h.(2001).viewofamouseclockgeneticking.nature409,684)。通過(guò)將光纖植入到大腦節(jié)律中樞視交叉上核，記錄這個(gè)區(qū)域神經(jīng)元的螢光素發(fā)光的光信號(hào)，光纖的另一端連接一個(gè)光電倍增管，可以連續(xù)幾天記錄自由活動(dòng)動(dòng)物的基因轉(zhuǎn)錄水平。然而也許是效果不佳的原因，該方法很長(zhǎng)一段時(shí)間都沒(méi)有其他小組跟進(jìn)和重復(fù)。直到2015年，ken-ichihonma課題組再次嘗試用此方法記錄不同基因的在體表達(dá)情況(ono,d.,honma,k.,andhonma,s.(2015).circadianandultradianrhythmsofclockgeneexpressioninthesuprachiasmaticnucleusoffreelymovingmice.scirep5,12310)，但是由于無(wú)法解決一直需要給熒光素和信號(hào)弱等問(wèn)題，實(shí)驗(yàn)也無(wú)法得到很好的結(jié)果，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的噪音依舊很大，也只能在完全黑暗的條件下進(jìn)行。而且現(xiàn)有方法對(duì)于每一種基因的檢測(cè)都需要做不同的轉(zhuǎn)基因小鼠，這對(duì)于大量研究不同基因的表達(dá)來(lái)說(shuō)無(wú)疑是不可能實(shí)現(xiàn)的。

近幾年來(lái)，研究人員開(kāi)始在動(dòng)物體內(nèi)植入光纖記錄神經(jīng)元鈣信號(hào)(cui,g.,jun,s.b.,jin,x.,pham,m.d.,vogel,s.s.,lovinger,d.m.,andcosta,r.m.(2013).concurrentactivationofstriataldirectandindirectpathwaysduringactioninitiation.nature494,238-242)。鈣敏感探針gcamp是一種由gfp改進(jìn)而來(lái)的熒光蛋白，沒(méi)有結(jié)合鈣時(shí)，gcamp發(fā)光較弱，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度增加，gcamp與鈣結(jié)合會(huì)增加發(fā)光強(qiáng)度。如果將gcamp表達(dá)在神經(jīng)細(xì)胞上，就可以通過(guò)記錄熒光信號(hào)的強(qiáng)弱來(lái)觀測(cè)神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)放情況。與螢光素發(fā)光不同，熒光蛋白發(fā)光需要有激發(fā)光激發(fā)，一個(gè)典型的用光纖在體記錄神經(jīng)元鈣信號(hào)的系統(tǒng)如圖1所示(gunaydin,l.a.,grosenick,l.,finkelstein,j.c.,kauvar,i.v.,fenno,l.e.,adhikari,a.,lammel,s.,mirzabekov,j.j.,airan,r.d.,zalocusky,k.a.,etal.(2014).naturalneuralprojectiondynamicsunderlyingsocialbehavior.cell157,1535-1551)。473nm激光耦合到光纖中，光纖的一端植入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的大腦中，473nm激發(fā)光由光纖傳導(dǎo)到末端進(jìn)行熒光激發(fā)，激發(fā)出的熒光由同一根光纖收集，熒光信號(hào)經(jīng)過(guò)濾色片后，由光電倍增管收集，數(shù)據(jù)最終傳送到電腦程序保存。雖然這一新技術(shù)在記錄神經(jīng)元活動(dòng)上發(fā)揮了重要作用并快速得到廣泛應(yīng)用，但是其應(yīng)用目前僅限于鈣信號(hào)記錄。

目前，尚無(wú)一種在體實(shí)時(shí)長(zhǎng)時(shí)間記錄基因轉(zhuǎn)錄活性的方法和裝置，解決上述方法的缺點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了在體實(shí)時(shí)長(zhǎng)時(shí)間記錄基因轉(zhuǎn)錄活性的方法。

本發(fā)明的方法通過(guò)構(gòu)建了基于熒光蛋白為報(bào)告基因的檢測(cè)基因轉(zhuǎn)錄活性的質(zhì)粒，并利用cre-loxp重組酶系統(tǒng)，利用定位微量注射對(duì)特定區(qū)域中特異類(lèi)型細(xì)胞的檢測(cè)。

所述待檢測(cè)基因可以是任何適合的基因，尤其是適合節(jié)律基因，例如cry1，per2等。

所述cre-loxp重組酶系統(tǒng)可以存在于任何適合的特定區(qū)域中特異類(lèi)型細(xì)胞中，例如vip-cre小鼠的視交叉上核的vip神經(jīng)元。

所述基于熒光蛋白為報(bào)告基因的檢測(cè)基因轉(zhuǎn)錄的質(zhì)粒包含節(jié)律基因例如per2、cry1基因啟動(dòng)子序列，啟動(dòng)子序列之后為由lox2272和loxp序列間隔的反向熒光表達(dá)基因，所述lox2272和loxp序列可以被cre重組酶特異性識(shí)別然后使其中間序列倒置的特定核苷酸序列。

所述per2基因啟動(dòng)子的核苷酸序列為seqidno.1，所述cry1基因啟動(dòng)子的核苷酸序列為seqidno.2，所述lox2272序列的核苷酸序列為seqidno.3，所述loxp序列的核苷酸序列為seqidno.4。

所述反向熒光表達(dá)基因包含flag標(biāo)簽序列，per2基因的第一個(gè)內(nèi)含子intron1序列，熒光蛋白基因序列或cry1基因的第一個(gè)內(nèi)含子列，核定位信號(hào)nls序列，及泛素化降解信號(hào)d2序列。

所述flag標(biāo)簽序列的核苷酸序列為seqidno.5，intron1序列的核苷酸序列為seqidno.6，cry1基因的第一個(gè)內(nèi)含子列的核苷酸序列為seqidno.7，nls序列的核苷酸序列為seqidno.8，d2序列的核苷酸序列為seqidno.9。

所述熒光蛋白基因序列可是任何適合的熒光蛋白基因序列，例如核苷酸序列為seqidno.10的venus熒光蛋白基因，核苷酸序列為seqidno.11的mcherry熒光蛋白基因。

進(jìn)一步，所述基于熒光蛋白為報(bào)告基因的檢測(cè)基因轉(zhuǎn)錄的質(zhì)粒的核苷酸序列為seqidno.12，其指示per2基因轉(zhuǎn)錄，或seqidno.13，其指示cry1基因轉(zhuǎn)錄。

本發(fā)明的質(zhì)?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域常規(guī)的方法進(jìn)行構(gòu)建。

其中指示per2基因轉(zhuǎn)錄的質(zhì)粒seqidno.12是在質(zhì)粒paav-ef1a-do-hchr2(h134r)-mcherry-wpre-pa的基礎(chǔ)上構(gòu)建的，質(zhì)粒paav-ef1a-do-hchr2(h134r)-mcherry-wpre-pa購(gòu)買(mǎi)自addgene，貨號(hào)37082。

另一方面，與生物螢光素發(fā)光不同，熒光的產(chǎn)生需要有特定波長(zhǎng)的激發(fā)光激發(fā)，才能產(chǎn)生特定波長(zhǎng)范圍的熒光光子。因此，本發(fā)明提供了一種在體實(shí)時(shí)長(zhǎng)時(shí)間記錄基因轉(zhuǎn)錄活性的系統(tǒng)，用于探測(cè)在體熒光信號(hào)，其包括：1)光學(xué)模塊，具有激發(fā)光源10、1分多激光分束器20、二相色濾光片30、光纖耦合器40、旋轉(zhuǎn)光纖50、光電倍增管60和發(fā)射濾光片70，所述1分多激光分束器20將激發(fā)光源10產(chǎn)生的激光能量均勻分成多束并分別通過(guò)二相色濾光片30和光纖耦合器40導(dǎo)入耦合到旋轉(zhuǎn)光纖50中，所述旋轉(zhuǎn)光纖50用于傳輸激光和采集熒光信號(hào)，采集的熒光通過(guò)二相色濾光片30和發(fā)射濾光片70傳輸?shù)焦怆姳对龉?0，轉(zhuǎn)換成電信號(hào)；2)電路和控制模塊，具有濾波和放大電路80、usb數(shù)據(jù)采集卡90和計(jì)算機(jī)100，所述光電倍增管60輸出的電信號(hào)經(jīng)過(guò)濾波和放大電路80后由usb數(shù)據(jù)采集卡90轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)傳輸給計(jì)算機(jī)100，并且通過(guò)所述計(jì)算機(jī)控制所述系統(tǒng)。

本發(fā)明的系統(tǒng)將一個(gè)激光光源分成多路，構(gòu)建了多個(gè)獨(dú)立的光纖記錄模塊，實(shí)現(xiàn)多路同步，高效的探測(cè)信號(hào)。

在本發(fā)明中，所述激光光源10根據(jù)所使用的熒光蛋白發(fā)出特異性的激光，例如，針對(duì)venus熒光蛋白采用的是488nm的激光，針對(duì)mcherry熒光蛋白采用的是561nm的激光。

在本發(fā)明中，旋轉(zhuǎn)光纖50用于傳輸激光和采集熒光信號(hào)的旋轉(zhuǎn)光纖50，該光纖將激光引入動(dòng)物特定組織區(qū)域，進(jìn)行熒光激發(fā)，激發(fā)出的熒光通過(guò)同一根光纖進(jìn)行收集。

在本發(fā)明中，所述1分多激光分束器20將激發(fā)光源10產(chǎn)生的激光能量均勻分成2束、3束或更優(yōu)先的4束及以上。

在本發(fā)明中，所述usb數(shù)據(jù)采集卡90同時(shí)可接受來(lái)自計(jì)算機(jī)100的命令，輸出數(shù)字和模擬信號(hào)，控制光電倍增管增益電壓和激發(fā)光功率。

在本發(fā)明中，計(jì)算機(jī)100負(fù)責(zé)采集熒光隨時(shí)間變化的信號(hào)曲線(xiàn)，同時(shí)具有設(shè)定采樣頻率，控制采樣時(shí)間，設(shè)置采樣通道的功能；計(jì)算機(jī)程序100可以實(shí)時(shí)展示采集到的多路信號(hào)曲線(xiàn)，設(shè)定顯示范圍，數(shù)據(jù)保存路徑，設(shè)定數(shù)據(jù)名稱(chēng)的功能；計(jì)算機(jī)100可以給數(shù)據(jù)usb采集卡發(fā)送命令，控制光電倍增管電壓，開(kāi)關(guān)激光光源，設(shè)置激光功率，設(shè)置激光調(diào)制模式的功能。

本發(fā)明采用熒光蛋白為報(bào)告基因，相比生物螢光素發(fā)光，具有以下優(yōu)點(diǎn)：1)不需要持續(xù)給螢光素酶底物；2)熒光信號(hào)更強(qiáng)，信噪比較高；3)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不需要嚴(yán)格避光，動(dòng)物可以得到正常的光照，光照對(duì)實(shí)驗(yàn)記錄基本沒(méi)有影響，保證正常的晝夜節(jié)律。

進(jìn)一步地，本發(fā)明首次通過(guò)光纖記錄熒光蛋白的發(fā)光，實(shí)現(xiàn)了在體長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)檢測(cè)基因轉(zhuǎn)錄。相比較之前的方法，本發(fā)明進(jìn)一步具有如下優(yōu)點(diǎn)：首先，本發(fā)明的方法不用嚴(yán)格避光，動(dòng)物可以得到正常的光照，保持了正常的晝夜節(jié)律，而且可以任意改變光照條件，模擬時(shí)差等現(xiàn)實(shí)情況；其次，相比之前光纖在體記錄熒光素發(fā)光的方法，由于熒光蛋白只有在激光激發(fā)的時(shí)候才能發(fā)出光子，這也避免了雜散信號(hào)的干擾，保證了本發(fā)明方法的高信噪比。再次，通過(guò)設(shè)計(jì)病毒載體的方法，可以非常方便的針對(duì)特定基因設(shè)計(jì)載體，效率遠(yuǎn)高于制作轉(zhuǎn)基因小鼠的方法。最后，本發(fā)明的系統(tǒng)可以同時(shí)記錄四只動(dòng)物的信號(hào)，大大提高了效率。

附圖說(shuō)明

圖1典型的用光纖在體記錄神經(jīng)元鈣信號(hào)的系統(tǒng)；

圖2本發(fā)明的檢測(cè)per2基因轉(zhuǎn)錄的病毒載體(質(zhì)粒)；

圖3本發(fā)明的在視交叉上核的vip神經(jīng)元中特異性指示per2的轉(zhuǎn)錄結(jié)果；

圖4本發(fā)明的在體實(shí)時(shí)長(zhǎng)時(shí)間記錄基因轉(zhuǎn)錄活性的系統(tǒng)；

圖5本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)裝置單個(gè)通道解析圖；

圖6本發(fā)明的多只小鼠同時(shí)記錄的實(shí)驗(yàn)方法圖；

圖7本發(fā)明實(shí)時(shí)檢測(cè)無(wú)信號(hào)小鼠的背景值，圖中白色區(qū)域代表開(kāi)燈時(shí)間，灰色區(qū)域代表關(guān)燈時(shí)間，可以看到開(kāi)燈對(duì)與結(jié)果的記錄基本沒(méi)有影響；

圖8本發(fā)明實(shí)時(shí)檢測(cè)小鼠cry1基因轉(zhuǎn)錄活性，圖中白色區(qū)域代表開(kāi)燈時(shí)間，灰色區(qū)域代表關(guān)燈時(shí)間。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明構(gòu)建了基于熒光蛋白為報(bào)告基因的病毒載體，同時(shí)利用定位微量注射和cre-loxp重組酶系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了對(duì)特定區(qū)域中特異類(lèi)型細(xì)胞的檢測(cè)。構(gòu)建了多個(gè)載體，包括檢測(cè)cry1，per2等節(jié)律基因，質(zhì)粒構(gòu)建的具體步驟以seqidno.12為例，如下所述，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以套用此方法獲得其他任何基因。

第一步，用thermofisher公司mlui和xbai內(nèi)切酶切割質(zhì)粒paav-ef1a-do-hchr2(h134r)-mcherry-wpre-pa，并跑焦回收大片段；

第二步，設(shè)計(jì)引物：

primerf1：其序列為seqidno.14；

primerr1：其序列為seqidno.15；

第三步，用引物primerf1、primerr1和小鼠基因組為模板pcr，并跑焦回收pcr片段。

第四步，用第一步和第三步中回收的片段gibson鏈接成新的中間質(zhì)粒產(chǎn)物，并在大腸桿菌中擴(kuò)增得到中間質(zhì)粒產(chǎn)物seqidno.16；

第五步，合成相關(guān)系列：

用于重組的d2序列seqidno.17；用于重組的鏈接序列1，其具有序列seqidno.18；用于重組的鏈接序列2，其具有序列seqidno.19；

第六步，設(shè)計(jì)引物：

primerf2：其序列為seqidno.20；

primerr2：其序列為seqidno.21；

primerf3：其序列為seqidno.22；

primerr3：其序列為seqidno.23；

第七步，用引物primerf2、primerr2和質(zhì)粒pcdna5/frt/to-venus-flag(購(gòu)買(mǎi)自addgene，貨號(hào)40998)為模板pcr，并跑焦回收pcr片段。用用引物primerf3、primerr3和小鼠基因組為模板pcr，并跑焦回收pcr片段；

第八步，用thermofisher公司asci和nhei內(nèi)切酶切割質(zhì)粒seqidno.16，并跑焦回收大片段；

第九步，用第五步、第六步和第七步中所有的片段gibson鏈接成最終質(zhì)粒產(chǎn)物，并在大腸桿菌中擴(kuò)增得到最終質(zhì)粒產(chǎn)物seqidno.12。

進(jìn)一步，本發(fā)明中的其他質(zhì)粒構(gòu)建方法可以通過(guò)類(lèi)似方法及本領(lǐng)域常規(guī)的其他方法獲得。

例如，可以以本發(fā)明的指示per2基因轉(zhuǎn)錄的質(zhì)粒seqidno.12為基礎(chǔ)，將其改造成指示cry基因轉(zhuǎn)錄的質(zhì)粒seqidno.13，具體步驟如下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以套用此方法獲得其他任何基因：

第一步，用thermofisher公司asci和nhei內(nèi)切酶切割質(zhì)粒seqidno.12，并跑焦回收大片段；

第二步，設(shè)計(jì)引物：

primerf4：其序列為seqidno.24；

primerr4：其序列為seqidno.25；

primerf5：其序列為seqidno.26；

primerr5：其序列為seqidno.27；

primerf6：其序列為seqidno.28；

primerr6：其序列為seqidno.29；

第三步，用引物primerf4、primerr4和模板seqidno.12pcr，并跑焦回收pcr片段；用引物primerf5、primerr5和cry1基因的第一個(gè)內(nèi)含子序列的dna片段為模板pcr，并跑焦回收pcr片段；用引物primerf6、primerr6和模板seqidno.12pcr，并跑焦回收pcr片段；

第四步，用第一步和第三步中回收的片段gibson鏈接成新的中間質(zhì)粒產(chǎn)物，并在大腸桿菌中擴(kuò)增得到中間質(zhì)粒產(chǎn)物seqidno.30；

第五步，用thermofisher公司mlui和sali內(nèi)切酶切割質(zhì)粒seqidno.30，并跑焦回收大片段；

第六步，設(shè)計(jì)引物：

primerf7：其序列為seqidno.31；

primerr7：其序列為seqidno.32；

第七步，用引物primerf7、primerr7和有cry1基因啟動(dòng)子的dna序列為模板pcr，并跑焦回收pcr片段；

第八步，用第五步和第七步中回收的片段gibson鏈接成最終質(zhì)粒產(chǎn)物，并在大腸桿菌中擴(kuò)增得到最終質(zhì)粒產(chǎn)物seqidno.13。

圖2是我們?cè)O(shè)計(jì)的一個(gè)檢測(cè)per2基因轉(zhuǎn)錄的病毒載體(即質(zhì)粒)，在per2啟動(dòng)子的控制下表達(dá)venus熒光蛋白，熒光蛋白的正確表達(dá)還需要有cre介導(dǎo)。由于熒光蛋白表達(dá)需要一定時(shí)間，表達(dá)后比較穩(wěn)定，為了能夠通過(guò)熒光強(qiáng)度反映基因活性，需要將已經(jīng)表達(dá)的蛋白降解，因此我們?cè)谠O(shè)計(jì)質(zhì)粒時(shí)在熒光蛋白后融合表達(dá)了一個(gè)泛素化的尾巴，使得整個(gè)熒光蛋白的半衰期只有兩個(gè)小時(shí)左右。隨后我們將該載體包裝成adeno-associatedvirus(aav)腺相關(guān)病毒，微量注射到vip-cre小鼠的視交叉上核。可以特異的在視交叉上核中的vip神經(jīng)元中表達(dá)venus熒光蛋白，見(jiàn)圖3。

與生物螢光素發(fā)光不同，熒光的產(chǎn)生需要有特定波長(zhǎng)的激發(fā)光激發(fā)，才能產(chǎn)生特定波長(zhǎng)范圍的熒光光子。如圖4所示，我們的光纖記錄系統(tǒng)主要由三大模塊組成：

a)光學(xué)模塊

1)用于激發(fā)熒光的激光光源10，針對(duì)venus熒光蛋白采用的是488nm的激光，針對(duì)mcherry熒光蛋白采用的是561nm的激光；2)激光光纖輸出經(jīng)由1分4激光分束器20，將激光能量均勻分成4束；3)二相色濾光片30和光纖耦合器40，將激光導(dǎo)入耦合到光纖中50；3)用于傳輸激光和采集熒光信號(hào)的旋轉(zhuǎn)光纖50，該光纖將激光引入動(dòng)物特定組織區(qū)域，進(jìn)行熒光激發(fā)，激發(fā)出的熒光通過(guò)同一根光纖進(jìn)行收集，通過(guò)二相色濾光片30和發(fā)射濾光片70；4)由濾光片過(guò)濾得到的熒光光子通過(guò)光電倍增管60采集，轉(zhuǎn)換成電信號(hào)。該裝置將一個(gè)激光光源分成4路，構(gòu)建了4個(gè)獨(dú)立的光纖記錄模塊，實(shí)現(xiàn)4路同步，高效的探測(cè)信號(hào)。

b)電路模塊

1)光電倍增管60輸出的電信號(hào)經(jīng)過(guò)濾波和放大電路80；2)模擬信號(hào)由usb數(shù)據(jù)采集卡90采集，并轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào)，傳輸給計(jì)算機(jī)100；3)usb數(shù)據(jù)采集卡同時(shí)可接受來(lái)自計(jì)算機(jī)程序的命令，輸出數(shù)字和模擬信號(hào)，控制光電倍增管增益電壓和激發(fā)光功率。

c)計(jì)算機(jī)采集和控制程序

1)計(jì)算機(jī)程序負(fù)責(zé)采集熒光隨時(shí)間變化的信號(hào)曲線(xiàn)，程序同時(shí)具有設(shè)定采樣頻率，控制采樣時(shí)間，設(shè)置采樣通道的功能；2)計(jì)算機(jī)程序可以實(shí)時(shí)展示采集到的多路信號(hào)曲線(xiàn)，設(shè)定顯示范圍，數(shù)據(jù)保存路徑，設(shè)定數(shù)據(jù)名稱(chēng)的功能；3)計(jì)算機(jī)程序可以給數(shù)據(jù)采集卡發(fā)送命令，控制光電倍增管電壓，開(kāi)關(guān)激光器，設(shè)置激光功率，設(shè)置激光調(diào)制模式的功能。

進(jìn)一步，以在體監(jiān)測(cè)小鼠大腦中視交叉上核神經(jīng)元中節(jié)律基因cry1活性為例，建立了一套完整的在體連續(xù)監(jiān)測(cè)基因活性的實(shí)驗(yàn)方法，取得了良好的結(jié)果。首先需要將aav病毒載體微量注射到視交叉上核，同時(shí)將直徑230微米，na0.39的多模光纖植入到該區(qū)域。等待2周后，將光纖的另一端接入到四通道系統(tǒng)，進(jìn)行實(shí)時(shí)記錄。圖5和圖6展示了實(shí)驗(yàn)方法，旋轉(zhuǎn)光纖一端直接埋入小鼠大腦，另一端連接本發(fā)明的在體熒光記錄系統(tǒng)，圖5是單通道的內(nèi)部解析圖，圖6為四通道實(shí)驗(yàn)方法圖。利用本發(fā)明方法記錄基因轉(zhuǎn)錄不用避光，可以給予動(dòng)物正常的晝夜光照。如圖7所示，正常的光照不會(huì)造成信號(hào)的波動(dòng)。隨后我們以在體監(jiān)測(cè)cry1基因轉(zhuǎn)錄為例，測(cè)試了本發(fā)明方法和裝置的有效性。結(jié)果見(jiàn)圖8，cry1轉(zhuǎn)錄水平隨著晝夜光照而變化，在光照時(shí)轉(zhuǎn)錄水平逐漸增加，在關(guān)燈前達(dá)到峰值，隨后下降，在下一次開(kāi)燈前達(dá)到谷值，且有著大約24小時(shí)的節(jié)律，如此持續(xù)7天時(shí)間?？傊景l(fā)明所述的在體檢測(cè)基因活性的方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)自由活動(dòng)小鼠連續(xù)長(zhǎng)時(shí)間的節(jié)律基因檢測(cè)，且具有高信噪比，動(dòng)物可自由活動(dòng)，監(jiān)測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，且實(shí)驗(yàn)無(wú)需避光，結(jié)合cre-loxp系統(tǒng)可以精確定位一種特定的神經(jīng)元中的特定基因的表達(dá)等顯著創(chuàng)新和優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)此方法可以長(zhǎng)時(shí)間在各種外界刺激下檢測(cè)任何腦區(qū)的任何基因的轉(zhuǎn)錄情況。

盡管本發(fā)明的實(shí)施方案已經(jīng)如上公開(kāi)，但其并不僅限于說(shuō)明書(shū)和實(shí)施方式中所示運(yùn)用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，可容易地實(shí)現(xiàn)另外的修改，因此，在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細(xì)節(jié)和這里示出與描述的圖例。

sequencelisting

<110>百聯(lián)微光（北京）科技有限公司

<120>一種在體實(shí)時(shí)長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)記錄基因轉(zhuǎn)錄活性的方法和裝置

<160>32

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>526

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

cggattaccgaggctggtcacgtcgtcgcaggtgataggccggtggccctggtctctgcc60

ggctgtgagttgcgcagcggccaagcaccattcccccgcgccgcagtggtacgcgccact120

ccggggctgcacgagcgggccaccgccgtgccaggtgaatggaagtcccgcaggccggaa180

gtggacgagcctactcgcccgggcgcgggggggcgcaagagcgcgcagcatcttcattga240

ggaacccgggcggcgaacatggagttccatgtgcgtcttatgtaaagagagcgacgggcg300

tctccaccaattgatgagcgtagctctcaggttccgccccgccagtatgcaaatgaggtg360

gcactccgaccaatggcgcgcgcaggggcgggctcagcgcgcgcggtcacgttttccact420

atgtgacagcggagggcgacgcggcggcagcggcgctactgggactagcggctccgggcg480

gctgcggcgcaggccgagcgcaccaagtgacgggccgagcaaggga526

<210>2

<211>1571

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

acgcgtgtaaagatgcacatgtggccctgtgttctcattagacttcaattgctttgataa60

aacatcatgagcaaaagcaacttggccaggaaggaaggggtttgttgccgtttacagtta120

ataatccatcgtggggagaagtcagggcagaaattcaaagcagaaacctggagatagagg180

gctgaagcagaagccatggaggaaagccgttttggttccctgtggcttcctcagcctgct240

tccatatacaacccgcctagggctaccagcctaatggtggcgccacacacactggtcggg300

tccttccacatcactcattaatcaagaaagtgcccagacttccctacaggcaacctgatg360

gaagtctttactacaattaaggttcctcttcccatttaacttcagttgaagaaaaaaaaa420

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tacacttcatgtaatagattagagttgataaattgacgatgtatctacagtattatgaaa540

tgctgaatatctgagatcggacctgtcttctccagagcttgggcaaaggtgcccgcccca600

aacagtaaaaaaggctaacggcgtgatttctgctcctttcagagcaggggactccgatta660

acacctgattgaagctgggtgagaggcaggactgtgcctcggttgcctctcacccagccc720

agcaataactctcagggcacacggaactggcttcagaccttccacacaacccataggaag780

agccctgggcgcgctcccgcgtcctagcctcttctcttccaccgcgagagcgcagcgcac840

gcgcgccgtgcccggcagagcgcgcgcccgcgagctccccgcagccccgtgctcatccgg900

gtccccgcgagcctcggccaatggaggcggctcccggccccgggagcagaactatgcctc960

ctcccccttctcgcggcctgtggcccccgcgagcggcctggggctcaggagacccgcaga1020

ggctgcgagtccggatcccacgcgagaactcaggtcgtgagcgcccagcgatcgcaaccg1080

gtcccgaagcaccgggcgcggcggcgcacgcgggggtctgagccagtgtagtaaacacac1140

ttcagaaacgtgaggtgccggtggtcacgtggggtgcatgccgcccaatgagaagccggg1200

ggcggggcggaggccgctgacgcggcggagtcacccgggcagcctcgggaccggtgaccg1260

gcaggcgagcgtcccgcggcctggagctctagcccgcgctctccgagctcgctgcccact1320

ccgggacgcacaggccgcgtcgcgcggaggccgcgtgagctcgtgtccgttcgtggaggc1380

cgcctcgggcgcgccaccgtctcctcgcgggtcgcctcggttgggcgaggtttccgtgac1440

gagcctcccggggctgctgcgaccagcccgggccgtcgtggcggctcgggccccgcgcgc1500

tcgcttgcgctccgggggtctcaggccctggaaggtatgcgtgtcctccggacgagatct1560

gcgatctaagt1571

<210>3

<211>34

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

ataacttcgtataggatactttatacgaagttat34

<210>4

<211>34

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

ataacttcgtatagcatacattatacgaagttat34

<210>5

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

gactacaaggatgacgatgacaag24

<210>6

<211>726

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

gtaggtcagcctcaggccaggccctcgcacacaggacacgggtggctccctccatagttt60

gtcgcccgtcttcaagcagcaagtaccaggacttgcaggatggcagtacttcttaatcct120

gtagatggtatttattgtactttgtccttccaaataacgataccacgtcatctttgcatt180

tttgtatctgatgcacttaacagacagtccagtaagacctcggaggagcctgctcacaca240

catgcattcgatcacagaatattccttttcatttctgtctctcagtgttcaagtctccta300

atagctgaagctcttatgtttcagttttaacatgacttttccttttttaaatttttactt360

taaagtatatgggtgttttgcctgtatgtatgtcggtgcaccacttgcatgtttggtgac420

cataggggacagaagagggcattggatcccctggaactgtgagttacagatgggtgtaag480

cagccgtgtgggtgcttctcttcaccattgagctgattctccagctctgacttttatttt540

gaggggaagtatggaggccatactatgggtctcaggcactccaggcaagtcctttgtccc600

aaagccaccacccagcatacggtaatattttctttaaaatctctggtgtgatgtccctgg660

tcagttttatcggctggttgggggaagaggcgtgtggagatcttatctatctatcttccc720

ttgcag726

<210>7

<211>336

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

gaaactatggcataggacagatgactgtgttatatgaattcataatgtcttgttttcagt60

agcagtgggattatgttgtatcttgccattgcctttttcagactattttatagacagaac120

tagaaatactagttatataagctgtcctagcacagactagaaagtaggtcattgtgatgg180

gagtatgctaaaccacccactggttgctatagcgatgacctactttagaaactatttctg240

ttgattcatgttgaaatcatcttttggaagtggcataaggaagttactacatgtacgttt300

ttatagtagtaaaaggtagagctgtcaagaggtacc336

<210>8

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

ccaaaaaagaagagaaaggta21

<210>9

<211>123

<212>dna

<213>人工序列

<400>9

agccatggcttcccgccggaggtggaggagcaggatgatggcacgctgcccatgtcttgt60

gcccaggagagcgggatggaccgtcaccctgcagcctgtgcttctgctaggatcaatgtg120

tag123

<210>10

<211>714

<212>dna

<213>人工序列

<400>10

gtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggc60

gacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggc120

aagctgaccctgaagttgatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctc180

gtgaccaccctcggctacggcctgcagtgcttcgcccgctaccccgaccacatgaagcag240

cacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttc300

aaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtg360

aaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaag420

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cactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactac600

ctgagctaccagtccaaactgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctg660

ctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaag714

<210>11

<211>708

<212>dna

<213>人工序列

<400>11

atggtgagcaagggcgaggaggataacatggccatcatcaaggagttcatgcgcttcaag60

gtgcacatggagggctccgtgaacggccacgagttcgagatcgagggcgagggcgagggc120

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gtgatgaacttcgaggacggcggcgtggtgaccgtgacccaggactcctccctgcaggac360

ggcgagttcatctacaaggtgaagctgcgcggcaccaacttcccctccgacggccccgta420

atgcagaagaagaccatgggctgggaggcctcctccgagcggatgtaccccgaggacggc480

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gaggtcaagaccacctacaaggccaagaagcccgtgcagctgcccggcgcctacaacgtc600

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<211>6992

<212>dna

<213>人工序列

<400>12

cctgcaggcagctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtc60

gggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggcca120

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tcgcaggtgataggccggtggccctggtctctgccggctgtgagttgcgcagcggccaag240

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ccgtgccaggtgaatggaagtcccgcaggccggaagtggacgagcctactcgcccgggcg360

cgggggggcgcaagagcgcgcagcatcttcattgaggaacccgggcggcgaacatggagt420

tccatgtgcgtcttatgtaaagagagcgacgggcgtctccaccaattgatgagcgtagct480

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gggcgggctcagcgcgcgcggtcacgttttccactatgtgacagcggagggcgacgcggc600

ggcagcggcgctactgggactagcggctccgggcggctgcggcgcaggccgagcgcacca660

agtgacgggccgagcaagggatctagagtcgactccggaataacttcgtataggatactt720

tatacgaagttatgcagaatggtagctggattgtagctgctattagcaatatgaaacctc780

ttaataacttcgtatagcatacattatacgaagttatggcgcgccctacacattgatcct840

agcagaagcacaggctgcagggtgacggtccatcccgctctcctgggcacaagacatggg900

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cacggggtcttctacctttctcttcttttttggaggcttgtacagctcgtccatgccgag1020

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gtctttgctcagtttggactggtagctcaggtagtggttgtcgggcagcagcacggggcc1140

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gttgtggcggatcttgaagtttgccttgatgccgttcttctgcttgtcggcggtgatata1260

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ggcgcgggtcttgtagttgccgtcgtccttgaagaagatggtgcgctcctggacgtagcc1440

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cccggtgaacagctcctcgcccttgctcacacctgcagggccctgaaaatacaggttttc1740

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ctggaagttgccactccagtgcccaccagccttgtcctaataaaattaagttgcatcatt3840

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