本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種菠菜ssr標(biāo)記的制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

菠菜(spinaciaoleraceal.)是重要的葉菜類經(jīng)濟(jì)作物之一，生長周期短，復(fù)種指數(shù)高，在我國南北方普遍種植。我國是最大的菠菜生產(chǎn)和消費(fèi)國家，年產(chǎn)量1200多萬噸，約占世界總產(chǎn)量的90％。菠菜即可生食(拌沙拉)，也可熟食(炒、拌、做湯)，還可加工出口。菠菜營養(yǎng)豐富，富含纖維素、維生素以及鐵、鈣等，其含有的胡蘿卜素和多種維生素、氨基酸，對預(yù)防肺癌和子宮癌有益處。

菠菜起源于波斯地區(qū)(今伊朗及周邊)，于公元647年傳入中國，已在世界上廣泛栽培，包含2個野生種和1個栽培種，具有十分豐富的種質(zhì)資源。目前菠菜種質(zhì)資源的研究主要集中于對植物學(xué)性狀的描述和品質(zhì)性狀測定上，雖然表型和品質(zhì)性狀的調(diào)查及測定快捷簡便，可以對植物材料做出快速且較直觀的比較和分類，但易受環(huán)境因素和植物生長發(fā)育時期的影響，而利用分子標(biāo)記研究菠菜種質(zhì)資源遺傳，則不受樣品形態(tài)和環(huán)境因素的影響，并且分子標(biāo)記試驗所需樣品用量少，標(biāo)記數(shù)目多，重復(fù)性高，結(jié)果可靠，能檢測整個基因組及提供中立、客觀的遺傳多樣性評價。目前對于菠菜的遺傳多樣性研究主要局限于trap等通用的分子標(biāo)記技術(shù)，雖然已經(jīng)開發(fā)出部分ssr標(biāo)記，但標(biāo)記的數(shù)量小，應(yīng)用局限，不利于后期的研究。

簡單重復(fù)序列(simplesequencerepeat，ssr)，又叫微衛(wèi)星(microsatellite)，主要是以1-6核苷酸為核心序列的簡單串聯(lián)重復(fù)序列，其長度大多在100-300bp。微衛(wèi)星包括重復(fù)基本基序所構(gòu)成的核心序列與其兩側(cè)的側(cè)翼序列。ssr標(biāo)記利用簡單序列重復(fù)的側(cè)翼保守序列設(shè)計引物，經(jīng)過pcr擴(kuò)增，根據(jù)條帶的大小來反映dna序列的多態(tài)性。與其它分子標(biāo)記相比，ssr標(biāo)記具有多態(tài)性高、共顯性遺傳、重復(fù)性好、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，然而傳統(tǒng)ssr標(biāo)記的開發(fā)費(fèi)時費(fèi)力、開發(fā)成本高，阻礙了該技術(shù)在分子遺傳育種等領(lǐng)域的應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對目前菠菜分子生物學(xué)研究基礎(chǔ)及分子遺傳育種技術(shù)薄弱的不足，開發(fā)菠菜ssr標(biāo)記的引物序列，并將其應(yīng)用于菠菜種質(zhì)資源遺傳多樣性評價、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建及qtl定位的研究。本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：

本發(fā)明一方面提供了一種菠菜ssr標(biāo)記的制備方法，包括以下步驟：

步驟1、獲取菠菜基因組或轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)；

步驟2、利用ssr檢索程序進(jìn)行ssr位點(diǎn)搜索；

步驟3、采用引物設(shè)計軟件設(shè)計含有上述ssr位點(diǎn)的引物序列；

步驟4、提取菠菜材料的總dna；

步驟5、利用形態(tài)特征差異明顯的菠菜材料的dna篩選出差異ssr標(biāo)記。

優(yōu)選地，在上述步驟1中，獲取菠菜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的27376條unigene序列。

優(yōu)選地，在上述步驟2中，利用microsatellite(misa)程序進(jìn)行ssr位點(diǎn)搜索，搜索條件為：二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸和七核苷酸最少重復(fù)次數(shù)分別為10、6、5、5、5和5次。

優(yōu)選地，在上述步驟3中，采用primer3.0軟件對含有ssr位點(diǎn)的unigene序列批量設(shè)計引物。

更優(yōu)選地，設(shè)計上述引物的主要參數(shù)為：(1)退火溫度在55～65℃之間，上、下游引物的tm相差≤2℃；(2)pcr產(chǎn)物大小在100～300bp；(3)引物長度在18～24bp之間；(4)gc含量在40％～60％之間。

優(yōu)選地，在上述步驟5中，差異ssr標(biāo)記為篩選出的在形態(tài)特征差異明顯的12個菠菜材料的dna中存在多態(tài)性的標(biāo)記。

優(yōu)選地，上述差異ssr標(biāo)記至少包括如表2所示的20對具有多態(tài)性的ssr標(biāo)記。

優(yōu)選地，上述菠菜材料至少包括自然群體、f2群體、回交群體、重組自交系、雙單倍體群體、近等基因系、殘留異質(zhì)系、qtl等基因系、導(dǎo)入系、單片段代換系和染色體片段代換系中的一種或幾種。

更優(yōu)選地，上述植物材料為菠菜自然群體。

本發(fā)明在另一方面提供了根據(jù)上述制備方法得到的菠菜ssr標(biāo)記在菠菜種質(zhì)資源多樣性、連鎖圖譜構(gòu)建、親緣關(guān)系研究及分子輔助選育技術(shù)中的應(yīng)用。

根據(jù)上述制備方法得到的菠菜ssr標(biāo)記的應(yīng)用，包括以下步驟：

步驟1、用上述差異ssr標(biāo)記擴(kuò)增目標(biāo)菠菜材料和f2群體；

步驟2、計算每對引物的多態(tài)性信息含量；

步驟3、對目標(biāo)菠菜材料進(jìn)行遺傳多樣性聚類及群體結(jié)構(gòu)分析。

本發(fā)明的有益效果在于，共開發(fā)菠菜轉(zhuǎn)錄組ssr位點(diǎn)7410個，設(shè)計ssr特異引物5932對，隨機(jī)合成60對ssr引物，其中20對能成功地在84份菠菜種質(zhì)資源中擴(kuò)增出多態(tài)性，20對引物共獲得64個多態(tài)性位點(diǎn)，最多一對引物檢測到了5個多態(tài)位點(diǎn)，平均每對引物能檢測到3.1個多態(tài)性位點(diǎn)。20對ssr引物在84份材料中檢測到的多態(tài)性信息含量(pic值)范圍為0.137-0.668，平均pic值為0.41；基因多樣性范圍為0.144-0.720，平均0.475；期望雜合度為0.012-0.988，平均值0.413。84份材料的相似系數(shù)范圍是0.64-0.98，被這些引物分成不同的組別，且基本與其形態(tài)特征相吻合。此外群體結(jié)構(gòu)分析表明在q值＝0.612時，可以將84份菠菜材料分為2個組，分別為q1和q2。

以下將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，以充分說明本發(fā)明的目的、技術(shù)特征和技術(shù)效果。

附圖說明

圖1為本發(fā)明較優(yōu)實(shí)施例中的ssr標(biāo)記對菠菜材料的擴(kuò)增電泳圖；

圖2為本發(fā)明較優(yōu)實(shí)施例中的ssr標(biāo)記分析的84份菠菜材料的聚類圖；

圖3為本發(fā)明較優(yōu)實(shí)施例中的ssr標(biāo)記分析的84份菠菜材料的群體結(jié)構(gòu)圖。

具體實(shí)施方式

在描述本發(fā)明之前，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不限于所述的具體方法和實(shí)驗條件，因為這類方法和條件可以變動。還應(yīng)當(dāng)理解本文所用的術(shù)語其目的僅在于描述具體實(shí)施方案，并且不意圖是限制性的，本發(fā)明的范圍將僅由所附的權(quán)利要求書限制。

以84份菠菜種質(zhì)資源為例進(jìn)行說明。本發(fā)明提供的菠菜ssr標(biāo)記的制備方法以及應(yīng)用，具體按照以下步驟完成：

(1)、從spinachbase(http://www.spinachbase.org)獲取菠菜基因組或轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)；

(2)、利用microsatellite(misa)程序進(jìn)行ssr位點(diǎn)搜索；

(3)、用primer3.0軟件批量設(shè)計含有ssr位點(diǎn)的引物序列；

(4)、獲取菠菜材料植株嫩綠葉片，提取總dna；

(5)、用步驟(3)所設(shè)計合成的ssr標(biāo)記的引物序列擴(kuò)增步驟(4)中如表1所示的形態(tài)特征差異明顯的12份菠菜材料；

(6)、獲得在步驟(5)中12份菠菜材料中有差異的est-ssr標(biāo)記，其序列如序列表2所示；并用所獲差異ssr標(biāo)記擴(kuò)增所有菠菜材料；

表1示出了本發(fā)明較優(yōu)實(shí)施例中所用的84份菠菜植物材料

(7)、計算每對引物的多態(tài)性信息含量；

(8)、對所有菠菜材料進(jìn)行遺傳多樣性聚類及群體結(jié)構(gòu)分析。

以下通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述。

實(shí)施例1：

1、供試材料(如表1所示)：選擇形態(tài)特征差異的菠菜材料12份(編號分別為1、2、3、4、6、16、24、69、77、88、98和106，剩余菠菜材料72份，其中3份為野生型種質(zhì)，種植于實(shí)驗大棚中。

2、ssr標(biāo)記的制備及引物設(shè)計：使用microsatellite(misa)程序進(jìn)行ssr位點(diǎn)搜索，搜索標(biāo)準(zhǔn)為：二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸和七核苷酸最少重復(fù)次數(shù)分別為10、6、5、5、5和5次。結(jié)果表明：通過對菠菜轉(zhuǎn)錄組的27376條unigene序列(序列總長約42968kb)進(jìn)行搜索，發(fā)現(xiàn)其中5454條unigene序列中含有7410個ssr位點(diǎn)，其中1351條unigene序列中含有兩個或兩個以上ssr位點(diǎn)。總體上，ssr發(fā)生頻率為19.9％，平均每5.8kb出現(xiàn)1個ssr。ssr的類型豐富，二核苷酸至七核苷酸重復(fù)類型均存在。其中二核苷酸和四核苷酸重復(fù)出現(xiàn)頻率占優(yōu)勢，分別占總ssr的40.3％和41.3％；六核苷酸和七核苷酸重復(fù)類型數(shù)量較少，分別占總數(shù)的0.8％和5.3％。

用primer3.0引物批量設(shè)計程序?qū)衧sr位點(diǎn)的unigene序列設(shè)計引物，并且ssr位點(diǎn)側(cè)翼序列長度≥50bp。引物設(shè)計的主要參數(shù)為：(1)、退火溫度(tm)在55～65℃之間，上、下游引物的tm相差≤2℃；(2)、pcr產(chǎn)物大小在100～300bp；(3)、引物長度在18～24bp之間；(4)、gc含量在40％～60％之間；盡量避免引物二級結(jié)構(gòu)如發(fā)卡結(jié)構(gòu)、二聚體、錯配、引物二聚體的出現(xiàn)。對批量設(shè)計的ssrs引物對在unigene庫中進(jìn)行ssr引物的blast驗證，共設(shè)計了5932對ssr位點(diǎn)特異引物。為了驗證其引物的有效性，隨機(jī)挑選合成了60對ssr引物。

3、菠菜總dna提取方法：田間取所述供試材料的嫩綠葉片，提取其總dna，具體方法步驟如下：

(1)取菠菜的幼嫩葉片50-100mg于2.0ml離心管中，加入750μl新鮮提取緩沖液于植物dna磨樣機(jī)中充分研磨，65℃條件下水浴30min，12000rpm離心10min，上清液轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管；所述提取緩沖液為2％ctab，100mmtris-hcl(ph8.0)，20mmedta，1.4mnacl，1％pvp和2％β-巰基乙醇。

(2)加入等體積(750μl)的氯仿：異戊醇為24：1的混合液，上下劇烈顛倒100次，靜置2min；12000rpm離心10min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5ml離心管中。

(3)加入等體積(750μl)的氯仿：異戊醇為24：1的混合液，上下劇烈顛倒100次，靜置2min；12000rpm離心10min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的2.0ml離心管中。

(4)加入0.1倍體積3mnaac，輕輕充分混勻，靜置1min；加等體積的異丙醇后翻轉(zhuǎn)50次，于-20℃冰箱保存10min，12000r/min離心5min。

(5)倒掉上清液，用1000μl75％的酒精清洗，同時震蕩離心，再次倒掉酒精，自然干燥。

(6)加入適量含有rnase的ddh2o(50μl)溶解沉淀，37℃水浴30min。最后測定dna濃度，調(diào)至300-500ng/μl置于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

4、利用開發(fā)的引物進(jìn)行分析：具體步驟如下：

4.1、將所有的引物對所選取的差異明顯的菠菜材料進(jìn)行預(yù)篩選：

ssr的pcr反應(yīng)體系為：體系總體積為15μl，模板dna約為20ng，前引物與后引物分別為0.2μm，2.5mmmgcl2，0.4mmdntps，1×taqbuffer和1utaqdnataq聚合酶。pcr反應(yīng)在96孔pcr儀(etc-811dongshengthermalcycler)上進(jìn)行。反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性0.5min，55℃復(fù)性1min，72℃延伸1min，35個循環(huán)；72℃延伸5min后4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，凝膠濃度1-2％，凝膠大小140×120×2mm，電泳緩沖液為1×tae，恒壓100v，電泳0.5h左右。電泳結(jié)束后，凝膠用凝膠成像系統(tǒng)拍照保存(tanon2500gelimagesystem)。

4.2、按照步驟4所示用差異ssr標(biāo)記對剩余的72份菠菜材料進(jìn)行標(biāo)記分析。

4.3、數(shù)據(jù)整理及分析：

在相同遷移率位置上，條帶有記為“1”，無則記為“0”構(gòu)成1、0數(shù)據(jù)矩陣，建立excel表格的數(shù)據(jù)庫。應(yīng)用powermarker3.25軟件計算基因多樣性，雜合性和多態(tài)性信息含量(pic，polymorphisminformationcontent)等參數(shù)值。利用ntsys-pc2.10軟件，采用非加權(quán)平均法(upgma)對材料進(jìn)行聚類分析并繪制系統(tǒng)樹圖(rohlf，2000)。利用stucture2.3.4軟件分析菠菜群體結(jié)構(gòu)。

4.4、引物擴(kuò)增情況：

隨機(jī)開發(fā)合成的60對ssr引物，其中32對能夠在12份菠菜材料中擴(kuò)增出目的條帶，占總引物的53.3％，并且其中20引物在12份菠菜材料中具有多態(tài)性(表2)，占總引物的33.3％。利用這20對引物對所有的84份菠菜材料進(jìn)行標(biāo)記分析，20對ssr引物共獲得64個多態(tài)性位點(diǎn)，最多一對引物檢測到了5個多態(tài)位點(diǎn)。平均每對引物能檢測到3.1個多態(tài)性位點(diǎn)(見圖1)。

表2示出了本發(fā)明較優(yōu)實(shí)施例中篩選出的20對具有多態(tài)性的ssr標(biāo)記

其中標(biāo)記物ssr7由核苷酸序列如seqidno.1所示的上游引物和核苷酸序列如seqidno.2所示的下游引物組成；

標(biāo)記物ssr13由核苷酸序列如seqidno.3所示的上游引物和核苷酸序列如seqidno.4所示的下游引物組成；

標(biāo)記物ssr17由核苷酸序列如seqidno.5所示的上游引物和核苷酸序列如seqidno.6所示的下游引物組成；

標(biāo)記物ssr19由核苷酸序列如seqidno.7所示的上游引物和核苷酸序列如seqidno.8所示的下游引物組成；

標(biāo)記物ssr20由核苷酸序列如seqidno.9所示的上游引物和核苷酸序列如seqidno.10所示的下游引物組成；

標(biāo)記物ssr21由核苷酸序列如seqidno.11所示的上游引物和核苷酸序列如seqidno.12所示的下游引物組成；

標(biāo)記物ssr22由核苷酸序列如seqidno.13所示的上游引物和核苷酸序列如seqidno.14所示的下游引物組成；

標(biāo)記物ssr23由核苷酸序列如seqidno.15所示的上游引物和核苷酸序列如seqidno.16所示的下游引物組成；

標(biāo)記物ssr28由核苷酸序列如seqidno.17所示的上游引物和核苷酸序列如seqidno.18所示的下游引物組成；

標(biāo)記物ssr30由核苷酸序列如seqidno.19所示的上游引物和核苷酸序列如seqidno.20所示的下游引物組成；

標(biāo)記物ssr36由核苷酸序列如seqidno.21所示的上游引物和核苷酸序列如seqidno.22所示的下游引物組成；

標(biāo)記物ssr38由核苷酸序列如seqidno.23所示的上游引物和核苷酸序列如seqidno.24所示的下游引物組成；

標(biāo)記物ssr39由核苷酸序列如seqidno.25所示的上游引物和核苷酸序列如seqidno.26所示的下游引物組成；

標(biāo)記物ssr40由核苷酸序列如seqidno.27所示的上游引物和核苷酸序列如seqidno.28所示的下游引物組成；

標(biāo)記物ssr42由核苷酸序列如seqidno.29所示的上游引物和核苷酸序列如seqidno.30所示的下游引物組成；

標(biāo)記物ssr44由核苷酸序列如seqidno.31所示的上游引物和核苷酸序列如seqidno.32所示的下游引物組成；

標(biāo)記物ssr45由核苷酸序列如seqidno.33所示的上游引物和核苷酸序列如seqidno.34所示的下游引物組成；

標(biāo)記物ssr53由核苷酸序列如seqidno.35所示的上游引物和核苷酸序列如seqidno.36所示的下游引物組成；

標(biāo)記物ssr55由核苷酸序列如seqidno.37所示的上游引物和核苷酸序列如seqidno.38所示的下游引物組成；

標(biāo)記物ssr58由核苷酸序列如seqidno.39所示的上游引物和核苷酸序列如seqidno.40所示的下游引物組成。

4.5、ssr引物的特征：

20對ssr引物在84份材料中檢測到的pic值范圍為0.137-0.668，平均pic值為0.41；基因多樣性范圍為0.144-0.720，平均0.475；期望雜合度為0.012-0.988，平均值0.413(見表3)。

表3示出了本發(fā)明中篩選出的20對ssr標(biāo)記遺傳多樣性

4.6、聚類及群體結(jié)構(gòu)分析：

84份材料的相似系數(shù)范圍是0.64-0.98(見圖2)，從圖2中可以看出，在相似系數(shù)為0.67，84份菠菜材料被分為2個亞組，分別為組a和組b。組a中有29份菠菜材料，包含2份野生型材料，13份來源于中國不同地區(qū)的材料；組b有55份材料，又可細(xì)分為4個亞組。此外群體結(jié)構(gòu)分析表明在q值＝0.612時，可以將84份菠菜材料分為2個組，分別為q1和q2。84份材料基本能被這些引物分成不同的組別，且基本與其形態(tài)特征相吻合。

以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的較佳具體實(shí)施例。應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域的普通技術(shù)無需創(chuàng)造性勞動就可以根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思做出諸多修改和變化。因此，凡本技術(shù)領(lǐng)域中技術(shù)人員依本發(fā)明的構(gòu)思在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上通過邏輯分析、推理或者有限的實(shí)驗可以得到的技術(shù)方案，皆應(yīng)在由權(quán)利要求書所確定的保護(hù)范圍內(nèi)。

sequencelisting

<110>上海師范大學(xué)

<120>一種菠菜ssr標(biāo)記的制備方法及應(yīng)用

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<212>dna

<213>人工合成

<400>20

ggacgccgacactttgtg18

<210>21

<211>18

<212>dna

<213>人工合成

<400>21

gaaacacgaggtggccga18

<210>22

<211>18

<212>dna

<213>人工合成

<400>22

aacgtaccgcccatgcaa18

<210>23

<211>18

<212>dna

<213>人工合成

<400>23

ccggaccctccatctcca18

<210>24

<211>20

<212>dna

<213>人工合成

<400>24

agggagaatggaaactggcg20

<210>25

<211>19

<212>dna

<213>人工合成

<400>25

tcctcttcacacactccct19

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<211>18

<212>dna

<213>人工合成

<400>26

gtgaatttggcacgggcg18

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<212>dna

<213>人工合成

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tctttgccccctctcccc18

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<212>dna

<213>人工合成

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tcagtgtcgccgccaaat18

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<212>dna

<213>人工合成

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cgcgcacaagcaagactc18

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<211>18

<212>dna

<213>人工合成

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gcttgcaggagctcggaa18

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<212>dna

<213>人工合成

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ccttctcttgggtggagtgt20

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<213>人工合成

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