技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種用于檢測(cè)霍亂弧菌的lamp檢測(cè)用引物組及檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：
：

霍亂弧菌(vibriocholerae，vc)是引起霍亂的病原菌，在世界上曾引起多次大流行，給人們的生命財(cái)產(chǎn)造成巨大的損失。自然情況下，人類是vc的唯一易感者，主要通過被病原菌污染的水源或食物經(jīng)口傳染，臨床表現(xiàn)為劇烈的嘔吐、腹瀉、失水，死亡率高，屬于國際檢疫傳染病，在我國被列為甲類傳染病?？焖贉?zhǔn)確地診斷是及時(shí)發(fā)現(xiàn)疫情、迅速采取措施控制疫情的關(guān)鍵。目前，vc的檢測(cè)方法主要有傳統(tǒng)分離鑒定法、血清學(xué)方法、pcr方法、膠體金法等。傳統(tǒng)的分離鑒定方法靈敏度和特異性雖然較高，但檢測(cè)時(shí)間太長(zhǎng)，至少需要3～5d，不適于快速檢測(cè)要求；血清學(xué)方法主要用于vc細(xì)菌分型，以現(xiàn)有的血清檢測(cè)，當(dāng)新的血清型出現(xiàn)時(shí)，易發(fā)生漏檢；pcr法雖然靈敏度高，但受設(shè)備、試劑盒、試劑等條件的限制，基層單位較難開展，不利于霍亂疫情的監(jiān)測(cè)；免疫膠體金技術(shù)雖檢測(cè)快速，沒有特殊的實(shí)驗(yàn)室條件要求，但該技術(shù)陽性預(yù)測(cè)值低，最終確診仍以細(xì)菌培養(yǎng)為準(zhǔn)。因此，發(fā)展操作簡(jiǎn)便、快速準(zhǔn)確、易推廣的檢測(cè)方法對(duì)霍亂疫情的監(jiān)測(cè)與控制具有重要意義。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediatedisothermalamplification，lamp)是notomi等人在2000年發(fā)明的一種新的恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)。傳統(tǒng)的pcr技術(shù)離不開反復(fù)升降溫這個(gè)耗時(shí)耗能的過程，且反應(yīng)程序設(shè)定也較繁瑣。相比之下，lamp技術(shù)克服了這些問題。根據(jù)lamp技術(shù)的原理，它可實(shí)現(xiàn)在恒溫條件下(一般在60～65℃)快速連續(xù)擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)過程快速、簡(jiǎn)便，儀器設(shè)備簡(jiǎn)單、便攜，檢測(cè)結(jié)果特異性強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。lamp擴(kuò)增結(jié)果觀察方式多，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果、肉眼觀察顏色變化及試紙條技術(shù)，也可使用實(shí)時(shí)熒光法和實(shí)時(shí)濁度法，通過實(shí)時(shí)熒光pcr儀或?qū)崟r(shí)濁度儀對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行實(shí)時(shí)觀察。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
：

鑒于此，有必要設(shè)計(jì)一種檢測(cè)快速、操作簡(jiǎn)便、特異性高、靈敏度好、成本低廉的檢測(cè)霍亂弧菌的lamp檢測(cè)用引物組，及利用該引物組檢測(cè)霍亂弧菌的lamp檢測(cè)方法。

一種用于檢測(cè)霍亂弧菌的lamp檢測(cè)用引物組，其特征在于，由內(nèi)引物對(duì)fip/bip和外引物對(duì)f3/b3組成，fip、bip、f3、b3具體如下：

一種利用前述引物組檢測(cè)霍亂弧菌的lamp檢測(cè)方法，包括以下步驟：

步驟1、提取待測(cè)樣品dna；

步驟2、配制lamp檢測(cè)反應(yīng)體系，反應(yīng)體系包括引物：seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4；

步驟3、以步驟1中提取的dna為模版進(jìn)行l(wèi)amp擴(kuò)增反應(yīng)，用實(shí)時(shí)濁度法鑒定擴(kuò)增結(jié)果。

優(yōu)選的，lamp檢測(cè)反應(yīng)體系具體為：2×反應(yīng)液rm12～13ul，fip、bip各3.7～4.3ul，f3、b3各0.4～0.6ul，bstdna聚合酶0.9～1.2ul，待測(cè)樣品dna1.8～2.2ul，補(bǔ)超純水至25ul。

優(yōu)選的，fip、bip的濃度是40umol/l，f3、b3的濃度是5umol/l。

優(yōu)選的，lamp擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)前的預(yù)熱溫度50.0℃，lamp擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)溫度為65.0℃且進(jìn)行40min，lamp擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)后的酶失活溫度95℃進(jìn)行2min。

上述的lamp檢測(cè)方法中，檢測(cè)結(jié)果通過實(shí)時(shí)濁度儀實(shí)時(shí)測(cè)量濁度值來判斷核酸有無擴(kuò)增。

本發(fā)明采用上述技術(shù)方案，根據(jù)霍亂弧菌基因rexa的序列，設(shè)計(jì)4條特異性lamp引物，用來建立霍亂弧菌lamp檢測(cè)方法，結(jié)果表明，建立的lamp檢測(cè)方法對(duì)霍亂弧菌的檢測(cè)特異性良好，且方法的靈敏度高。本發(fā)明方法不受培養(yǎng)條件的限制，可在50min內(nèi)完成核酸的檢測(cè)。本發(fā)明對(duì)霍亂弧菌定性檢測(cè)靈敏度可達(dá)到6.63×10⁴cfu/ml，優(yōu)于一般pcr檢測(cè)方法，其檢測(cè)靈敏度是普通pcr的10倍。

附圖說明：

附圖1是lamp引物篩選試驗(yàn)圖，no.1-7分別為空白對(duì)照、toxr引物組、vcc引物組、rexa引物組、reca引物組、nbpa-1引物組和nbpa-2引物組。

附圖2是60℃時(shí)溫度對(duì)lamp反應(yīng)的影響試驗(yàn)圖。

附圖3是61℃時(shí)溫度對(duì)lamp反應(yīng)的影響試驗(yàn)圖。

附圖4是62℃時(shí)溫度對(duì)lamp反應(yīng)的影響試驗(yàn)圖。

附圖5是63℃時(shí)溫度對(duì)lamp反應(yīng)的影響試驗(yàn)圖。

附圖6是64℃時(shí)溫度對(duì)lamp反應(yīng)的影響試驗(yàn)圖。

附圖7是65℃時(shí)溫度對(duì)lamp反應(yīng)的影響試驗(yàn)圖。

附圖8是30min時(shí)時(shí)間對(duì)lamp反應(yīng)的影響試驗(yàn)圖。

附圖9是40min時(shí)時(shí)間對(duì)lamp反應(yīng)的影響試驗(yàn)圖。

附圖10是50min時(shí)時(shí)間對(duì)lamp反應(yīng)的影響試驗(yàn)圖。

附圖11是60min時(shí)時(shí)間對(duì)lamp反應(yīng)的影響試驗(yàn)圖。

附圖12是引物特異性鑒定試驗(yàn)圖，no.2-8依次為霍亂弧菌、腸出血行大腸桿菌o157:h7、致病性大腸埃希氏菌、致瀉性大腸埃希氏菌、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌、單增李斯特菌、痢疾志賀菌擴(kuò)增曲線圖；left反應(yīng)槽的no.1和right反應(yīng)槽的no.9均為空白對(duì)照。

附圖13是是引物特異性鑒定試驗(yàn)圖，no.10-16依次為金黃色葡萄球菌、宋氏志賀菌、鮑氏志賀菌、阪崎桿菌、甲型副傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌擴(kuò)增曲線圖；left反應(yīng)槽的no.1和right反應(yīng)槽的no.9均為空白對(duì)照。

附圖14是lamp反應(yīng)靈敏度試驗(yàn)圖，no.1為空白對(duì)照，no.2-8分別是菌液濃度為3.45×10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10、10^-1cfu/ml。

附圖15是普通pcr反應(yīng)靈敏度試驗(yàn)圖，m為dl1000marker，n為空白對(duì)照，泳道1-7分別是菌液濃度為3.45×10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10、10^-1cfu/ml。

具體實(shí)施方式：

以下敘述中所使用的試驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，為可從商業(yè)途徑得到的試劑和材料。

一、引物設(shè)計(jì)

按照lamp引物設(shè)計(jì)原則，根據(jù)genbank數(shù)據(jù)庫中的霍亂弧菌特異基因組序列，進(jìn)行多序列比對(duì)，尋找一段高度保守區(qū)作為擴(kuò)增對(duì)象，然后通過分子生物學(xué)軟件lampddesigner5設(shè)計(jì)6組引物，采用hplc純化方式。合成后的引物用超純水稀釋成100pmol/pl溶液，-20℃保存?zhèn)溆?。各引物序列見?。

表1霍亂弧菌的lamp檢測(cè)用引物

二、霍亂弧菌的lamp檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法的建立

細(xì)菌基因組dna快速抽提試劑盒為生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品，lamp擴(kuò)增體系的2×反應(yīng)液rm、bstdna聚合酶為榮研生物科技(中國)有限公司產(chǎn)品。

日本榮研l(wèi)t-16alpha恒溫?cái)U(kuò)增基因檢測(cè)系統(tǒng)，abiveriti96wellthermalcycler核酸擴(kuò)增儀、bioradgeldocxr凝膠成像系統(tǒng)。

霍亂弧菌實(shí)驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)菌株購自中國工業(yè)微生物保存中心和北京路橋技術(shù)股份有限公司(見表2)。

表2實(shí)驗(yàn)用菌種名稱及編號(hào)

1、樣品dna的提取

樣品為霍亂弧菌、eheco157:h7、致病性大腸埃希氏菌、致瀉性大腸埃希氏菌、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌、單增李斯特菌、痢疾志賀菌、金黃色葡萄球菌、宋氏志賀菌、鮑氏志賀菌、阪崎桿菌、甲型副傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌14株標(biāo)準(zhǔn)菌株的液體純培養(yǎng)物。

dna的提取方法按照dna提取試劑盒說明書中關(guān)于細(xì)菌dna提取要求進(jìn)行，具體步驟如下：

(1)吸取1ml過夜培養(yǎng)的細(xì)菌菌液，加入1.5ml離心管中，室溫8000rpm離心1min，棄上清，收集菌體。加入400ulbufferdigestion，震蕩混勻。65℃水浴1h至細(xì)胞完全裂解。

(2)加入200ulbufferpb，充分顛倒混勻，-20℃冰箱放置5min。

(3)室溫10000rpm離心5min，將上清液轉(zhuǎn)移到新的1.5ml離心管中。

(4)加入等體積的異丙醇，顛倒5～8次使之充分混勻，室溫靜置2-3min。室溫10000rpm離心5min，棄上清。

(5)加入1ml75％乙醇，顛倒漂洗1～3min，10000rpm離心2min，棄上清。

(6)重復(fù)步驟5一次。

(7)開蓋室溫倒置5～10min至殘留的乙醇完全揮發(fā)。

(8)得到的dna用50～100ultebuffer溶解。

獲得的dna模板的260/280比值均在1.8-2.0之間,濃度在200-500ng/ul。提取的dna質(zhì)量和濃度較高，適合后續(xù)的擴(kuò)增反應(yīng)。

2、lamp反應(yīng)體系

反應(yīng)體系為：2×反應(yīng)液rm12.5ul，內(nèi)引物fip、bip各4ul，外引物f3、b3各0.5ul，bstdna聚合酶1ul，dna模版2.0ul，補(bǔ)水至25ul。

內(nèi)引物fip、bip的濃度是40umol/l，外引物f3、b3的濃度是5umol/l。

dna模版由各細(xì)菌的培養(yǎng)物提取而得。

3、最優(yōu)引物的篩選

將表1的6組引物(nbpa-1、nbpa-2、reca、rexa、toxr、vcc)以霍亂弧菌dna為模板，在榮研l(wèi)t-16alpha恒溫?cái)U(kuò)增基因檢測(cè)系統(tǒng)上同時(shí)進(jìn)行l(wèi)amp反應(yīng)，并設(shè)空白對(duì)照，圖1中no.1-7分別為空白對(duì)照、toxr引物組、vcc引物組、rexa引物組和reca引物組、nbpa-1引物組、nbpa-1引物組。

擴(kuò)增反應(yīng)的程序?yàn)椋悍磻?yīng)溫度為65℃，反應(yīng)時(shí)間為40min，反應(yīng)結(jié)束后讀取數(shù)值。結(jié)果顯示，引物組rexa擴(kuò)增開始時(shí)間(tt值)最早(見圖1)，且曲線峰值高度(df)值最高，引物組rexa擴(kuò)增開始時(shí)間(tt值)和曲線峰值高度(df值)具體數(shù)值見表3。

表3lamp引物篩選試驗(yàn)tt值和df值

4、lamp反應(yīng)條件的優(yōu)化

4.1、反應(yīng)溫度的優(yōu)化:以上述篩選的最優(yōu)引物組rexa作為擴(kuò)增引物，以霍亂弧菌dna為模板，95℃酶失活2min，做6組對(duì)照，分別將反應(yīng)混合物放在60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃反應(yīng)條件下進(jìn)行l(wèi)amp反應(yīng)，并設(shè)空白對(duì)照，附圖2～7分別為60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃擴(kuò)增曲線圖，left反應(yīng)槽的no.1和right反應(yīng)槽的no.9均為空白對(duì)照，反應(yīng)時(shí)間為40min，反應(yīng)結(jié)束后讀取數(shù)值。結(jié)果顯示，當(dāng)反應(yīng)溫度為65℃時(shí)，擴(kuò)增效果最好，各反應(yīng)組擴(kuò)增開始時(shí)間(tt值)和曲線峰值高度(df值)具體數(shù)值見表4。因此，引物組rexa擴(kuò)增反應(yīng)的最佳溫度為65℃。

表4lamp反應(yīng)溫度優(yōu)化試驗(yàn)tt值和df值

4.2、反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化：以上篩選的最優(yōu)引物組rexa作為擴(kuò)增引物，以霍亂弧菌dna為模板，以上述最優(yōu)65℃為反應(yīng)溫度，95℃酶失活2min，做4組對(duì)照，分別將反應(yīng)混合物放在30min、40min、50min、60min反應(yīng)條件下進(jìn)行l(wèi)amp反應(yīng)，并設(shè)空白對(duì)照，附圖8～11分別為30min、40min、50min、60min擴(kuò)增曲線圖，left反應(yīng)槽的no.1和right反應(yīng)槽的no.9均為空白對(duì)照，反應(yīng)結(jié)束后讀取數(shù)值。結(jié)果顯示，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為40℃時(shí)，擴(kuò)增效果最好，用時(shí)最短，各反應(yīng)組擴(kuò)增開始時(shí)間(tt值)和曲線峰值高度(df值)具體數(shù)值見表5。因此，引物組rexa擴(kuò)增反應(yīng)的最佳溫度為40min。

表5lamp反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化試驗(yàn)tt值和df值

通過反復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，對(duì)霍亂弧菌的lamp反應(yīng)條件進(jìn)行調(diào)整，調(diào)整優(yōu)化后的lamp反應(yīng)溫度為65℃，反應(yīng)時(shí)間為40min，95℃酶失活2min。

三、引物的特異性鑒定:

為了驗(yàn)證設(shè)計(jì)引物霍亂弧菌檢測(cè)的特異性，用第二部分(檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法的建立)所述反應(yīng)體系和優(yōu)化后條件，以13種霍亂弧菌細(xì)菌和一株陽性對(duì)照霍亂弧菌細(xì)菌培養(yǎng)物提取的dna為模板進(jìn)行l(wèi)amp擴(kuò)增檢測(cè)，并設(shè)置空白對(duì)照，no.2-8(a)依次為霍亂弧菌、腸出血行大腸桿菌o157:h7、致病性大腸埃希氏菌、致瀉性大腸埃希氏菌、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌、單增李斯特菌、痢疾志賀菌擴(kuò)增曲線圖，no.10-16(b)依次為金黃色葡萄球菌、宋氏志賀菌、鮑氏志賀菌、阪崎桿菌、甲型副傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌擴(kuò)增曲線圖，left反應(yīng)槽的no.1和right反應(yīng)槽的no.9均為空白對(duì)照，反應(yīng)結(jié)束后讀取數(shù)值。

檢測(cè)結(jié)果見附圖12～13，可以看出，只有以霍亂弧菌純培養(yǎng)物提取的dna模板有擴(kuò)增曲線出現(xiàn)，其他反應(yīng)孔均無擴(kuò)增曲線出現(xiàn)，其它樣品為陰性。結(jié)果表明，引物組rexa對(duì)霍亂弧菌具有專一性，可用于對(duì)霍亂弧菌的特異性檢測(cè)。

四、靈敏度實(shí)驗(yàn)：

1、原菌液濃度的定量

經(jīng)37℃過夜培養(yǎng)的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的霍亂弧菌菌液，用生理鹽水10倍系列稀釋，平板菌落計(jì)數(shù)，推算原菌液濃度。通過平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)得霍亂弧菌原菌液濃度為6.63×10⁶cfu/ml，菌落計(jì)數(shù)結(jié)果見表6。

表6腸出血性大腸桿菌o157：h7平板計(jì)數(shù)

2、模板的稀釋以及l(fā)amp反應(yīng)：:將上一步驟中(原菌液濃度的定量)測(cè)得的原菌液依次做10倍梯度稀釋，稀釋度為10^-1-10^-7，分別標(biāo)記為1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)、5號(hào)、6號(hào)、7號(hào)，然后每個(gè)稀釋度取2ul作為模板,用第二部分(檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法的建立)所述反應(yīng)體系和條件進(jìn)行l(wèi)amp反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后讀取數(shù)值。同時(shí)，也使用傳統(tǒng)的pcr方法進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4min；94℃變性30s，55℃退火45s，72℃延伸2min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存反應(yīng)產(chǎn)物，反應(yīng)結(jié)束后，取反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，pcr產(chǎn)物長(zhǎng)度為211bp。

3、檢測(cè)結(jié)果見附圖14和附圖15，圖14中no.1為空白對(duì)照，no.2-8分別是菌液濃度為6.63×10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10、10^-1cfu/ml；圖15中m為dl1000marker，n為空白對(duì)照，泳道1-7分別是菌液濃度為6.63×10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10、10^-1cfu/ml。結(jié)果表明：傳統(tǒng)的pcr擴(kuò)增的敏感性測(cè)定結(jié)果1、2號(hào)泳道有特異性條帶，其它泳道無特異性擴(kuò)增，即pcr的擴(kuò)增的最低靈敏度為6.63×10⁵cfu/ml。lamp擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果見附圖14，no.1-3號(hào)反應(yīng)孔有擴(kuò)增曲線出線，及l(fā)amp擴(kuò)增最低靈敏度為6.63×10⁴cfu/ml，與普通pcr相比，靈敏度提高了10倍。

通過以上實(shí)驗(yàn)最終確定了本發(fā)明的一種用于檢測(cè)霍亂弧菌的lamp檢測(cè)用引物組，由內(nèi)引物對(duì)fip/bip和外引物對(duì)f3/b3組成，fip、bip、f3、b3具體如下：

一種利用前述引物組檢測(cè)霍亂弧菌的lamp檢測(cè)方法，包括以下步驟：

步驟1、提取待測(cè)樣品dna；

步驟2、配制lamp檢測(cè)反應(yīng)體系，反應(yīng)體系包括引物：seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4，2×反應(yīng)液rm12.5ul，fip、bip的濃度是40umol/l且各4ul，f3、b3的濃度是5umol/l且各0.5ul，bstdna聚合酶1.0ul，待測(cè)樣品dna2.0ul，補(bǔ)超純水至25ul；

步驟3、以步驟1中提取的dna為模版進(jìn)行l(wèi)amp擴(kuò)增反應(yīng)，lamp擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)前的預(yù)熱溫度50.0℃，lamp擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)溫度為65.0℃且進(jìn)行40min，lamp擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)后的酶失活溫度95℃進(jìn)行2min，用實(shí)時(shí)濁度法鑒定擴(kuò)增結(jié)果。

序列表

<110>寧夏出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫綜合技術(shù)中心

<120>一種用于檢測(cè)霍亂弧菌的lamp檢測(cè)用引物組及檢測(cè)方法

<170>patentinversion3.5

<160>4

<210>1

<211>50

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

tgcctatgtacagctaatccttggttttatgacaaaacactttatgaccg50

<210>2

<211>47

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

attggcatgacgttataggctacttttgcttgttctaactgggctaa47

<210>3

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

gtggaatggttgtcacga18

<210>4

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

agcaatttcacgttttcgt19