本發(fā)明公開一種全人源抗補(bǔ)體因子h的抗體以及該抗體制備治療補(bǔ)體相關(guān)病癥藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù):
補(bǔ)體系統(tǒng)是構(gòu)成人體免疫系統(tǒng)的重要組成部分,補(bǔ)體不僅參與生理性的免疫防御過程,而且可以導(dǎo)致免疫病理性的損傷,補(bǔ)體系統(tǒng)的過度活化,將直接或間接地引起自身器官和組織的損傷,進(jìn)而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)。越來越多的研究發(fā)現(xiàn),持續(xù)的感染或慢性炎癥刺激可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展。目前已經(jīng)有研究證實(shí)補(bǔ)體系統(tǒng)與腫瘤的發(fā)生有相關(guān)關(guān)系(markiewskimm,etal,2008,9(11):1225-1235)。
補(bǔ)體系統(tǒng)的激活有3條途徑:經(jīng)典途徑、mbl途徑及旁路途徑。雖然3條途徑的啟動(dòng)激活物不同,但其共有步驟為將中心產(chǎn)物c3轉(zhuǎn)化成其活化形式c3b。補(bǔ)體調(diào)節(jié)的初始就是補(bǔ)體級(jí)聯(lián)的酶對(duì)c3的切割將硫酯暴露于親核攻擊,容許c3b經(jīng)由硫酯結(jié)構(gòu)域共價(jià)附著到抗原表面上。此切割消除了c3進(jìn)一步擴(kuò)大c3b沉積和活化補(bǔ)體級(jí)聯(lián)晚期成分(包括能夠指導(dǎo)膜破壞的膜攻擊復(fù)合物)的能力。然而,巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)胞受體優(yōu)先識(shí)別c3b及其片段;由于酯鍵形成的通用性,c3介導(dǎo)的調(diào)節(jié)對(duì)于病原體識(shí)別是重要的(holers,etal,13,231-236(1992)),因此各種c3降解產(chǎn)物c3b的受體在宿主免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。
cfh是補(bǔ)體系統(tǒng)旁路激活途徑的關(guān)鍵抑制因子,在炎癥及疾病的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。已有大量研究表明cfh與多種腫瘤疾病的發(fā)病有密切關(guān)系。wilczed等的研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌患者及繼發(fā)于結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移性肝癌患者中呈現(xiàn)高表達(dá)的狀態(tài),提示與結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)理密切相關(guān)(wilczed,etal,2008,122(9):2030-2037)。在junnikkalal的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在卵巢癌患者的腹水和卵巢癌細(xì)胞中表達(dá)水平明顯升高,還發(fā)現(xiàn)卵巢癌細(xì)胞可以分泌,提示在卵巢癌的發(fā)病過程中起重要作用(junnikkalal,etal,2002,87(10):1119-1127)。而目前關(guān)于cfh的研究多集中在與cfh密切相關(guān)的amd和冠心病方面。
cfh是一種具有多結(jié)構(gòu)域和多功能的蛋白質(zhì),在補(bǔ)體活化早期階段起重要的調(diào)節(jié)作用,通過抑制轉(zhuǎn)換酶的生成發(fā)揮作用:一方面在c3b降解過程中可以作為i因子的輔助因子介導(dǎo)c3b降解而失活;另一方面可以通過與b因子競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合cfh減少c3轉(zhuǎn)化酶的生成,同時(shí)加速已形成的c3轉(zhuǎn)化酶的衰變。同時(shí)cfh還在先天免疫中發(fā)揮重要的作用,即它能辨別自體和異己;還具有區(qū)分細(xì)胞表面是否激活,在細(xì)胞粘附方面起重要作用。
補(bǔ)體活化的大多數(shù)調(diào)節(jié)物在cfh(補(bǔ)體轉(zhuǎn)化酶的中心成分)水平起作用。補(bǔ)體活化的這些天然調(diào)節(jié)物分子通常大于100kda,而且難以開發(fā)成治療性試劑。因此,需要開發(fā)cfh抗體治療劑,主要通過阻斷cfh來預(yù)防和治療補(bǔ)體相關(guān)病癥。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
本發(fā)明關(guān)注cfh特異性的單克隆抗體及其在治療補(bǔ)體相關(guān)病癥中的用途,本發(fā)明的單克隆抗體結(jié)合人cfh的c末端結(jié)構(gòu)域(scr),本發(fā)明的單克隆抗體能夠增加補(bǔ)體c3b沉積在細(xì)胞表面,從而促進(jìn)補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用(cdc)。
本發(fā)明的cfh特異性單克隆抗體的重鏈可變區(qū)具有seqidno:1所示的氨基酸序列,單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)具有seqidno:5所示的氨基酸序列;單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)cdr具有如下的氨基酸序列:seqidno:2所示的cdr1、seqidno:3所示的cdr2、seqidno:4所示的cdr3;其輕鏈可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)具有如下的氨基酸序列:seqidno:6所示的cdr1、seqidno:7所示的cdr2、seqidno:8所示的cdr3。
另一方面,本發(fā)明的單克隆抗體選擇性結(jié)合多種哺乳動(dòng)物物種(人類和選自除人類外的靈長(zhǎng)類、小鼠、大鼠、豬、馬及兔等)的cfh。所述抗體或抗原結(jié)合片段可為非補(bǔ)體激活同種型或亞類。
本發(fā)明的單克隆抗體還包括將上述抗體的氨基酸序列通過對(duì)氨基酸殘基的添加、刪除、修改形成所得到的包括人源與非人源抗體,并具有與cfh抗體相同功能或改造及優(yōu)化的一切抗體。
本發(fā)明還提供了編碼前面所述的單克隆抗體或其抗原結(jié)合分子的核酸分子。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識(shí)到這些核酸分子的功能變體也是本發(fā)明的一部分。功能變體是這樣的核酸序列,通過使用標(biāo)準(zhǔn)遺傳密碼可以將其直接翻譯以提供與從親代核酸分子中翻譯的序列相同的氨基酸序列。
一旦獲得了有關(guān)的序列,就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體,再轉(zhuǎn)入細(xì)胞,然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外,還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列,尤其是片段長(zhǎng)度較短時(shí)。通常,通過先合成多個(gè)小片段,然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長(zhǎng)的片段。
目前,已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明的核酸分子(或其片段,或其衍生物)的核酸序列。然后可將該核酸序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的dna分子(或如載體)和細(xì)胞中。此外,還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明的核酸分子的序列中。
本發(fā)明還提供了一種包括前面所述的核酸分子的載體。所述載體包括克隆載體或者表達(dá)載體。
本發(fā)明還提供了一種含有前面所述的核酸分子或前面所述的載體的宿主細(xì)胞。
宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞,如細(xì)菌細(xì)胞;或是低等真核細(xì)胞,如酵母細(xì)胞;或是高等真核細(xì)胞,如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。代表性例子有:大腸桿菌,鏈霉菌屬;鼠傷寒沙門氏菌的細(xì)菌細(xì)胞:真菌細(xì)胞如酵母;植物細(xì)胞;果蠅s2或sf9的昆蟲細(xì)胞;cho,cos,293細(xì)胞、或bowes黑素瘤細(xì)胞的動(dòng)物細(xì)胞等。
在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中,所述宿主細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞,更優(yōu)選293細(xì)胞。
在另一方面,本發(fā)明所述單克隆抗體與抗原的結(jié)合域是scr19區(qū)(seqidno:9)的8個(gè)特定氨基酸pidngdit(seqidno:10)。
本發(fā)明所述單克隆抗體的結(jié)合抗原包括包含pidngdit序列的任何多肽,不限于本發(fā)明使用的scr19區(qū)。
在另一方面,本發(fā)明所述單克隆抗體包含如下抗原結(jié)合位點(diǎn),該抗原結(jié)合位點(diǎn)包含與cfh接觸的cfh抗體殘基。
在具體實(shí)施方案中,所述單克隆抗體是全人源化抗體。所述抗體片段可以例如選自下組:fab、fab′、f(ab′)2、scfv、(scfv)2、dab、互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)片段、線性抗體、單鏈抗體分子、微型抗體(minibody)、雙抗體、和自抗體片段形成的多特異性抗體。
在另一個(gè)方面,本發(fā)明涉及藥物組合物,其包含與藥學(xué)可接受的載體混和的本發(fā)明的cfh抑制劑,諸如cfh抗體。
進(jìn)一步,所述產(chǎn)品包括試劑盒,所述試劑盒包含容器和說明書,所述容器中裝有本發(fā)明的cfh抗體或包含抗體的藥物組合物,所述說明書指示如何施用所述抗體或藥物組合物來治療補(bǔ)體相關(guān)病癥。
本發(fā)明還提供了前面所述的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段在制備治療補(bǔ)體相關(guān)病癥的藥物中的應(yīng)用。
進(jìn)一步,所述補(bǔ)體相關(guān)病癥可以是選自下述中的任意一種:包括炎性和自身免疫性疾病,例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoidarthritis)(ra)、急性呼吸窘迫綜合征(acuterespiratorydistresssyndrome)(ards)、缺血和再灌注后的遠(yuǎn)距離組織損傷(remotetissueinjuryafterischemiaandreperfusion)、心肺旁路手術(shù)期間的補(bǔ)體活化(complementactivationduringcardiopulmonarybypasssurgery)、皮肌炎(dermatomyositis)、天皰瘡(pemphigus)、狼瘡腎炎及所致腎小球腎炎和血管炎(lupusnephritisandresultantglomerulonephritisandvasculitis)、心肺旁路(cardiopulmonarybypass)、心臟停搏誘發(fā)的冠狀內(nèi)皮功能障礙(cardioplegia-inducedcoronaryendothelialdysfunction)、ii型膜性增生性腎小球腎炎(typeiimembranoproliferativeglomerulonephritis)、iga腎病(iganephropathy)、急性腎衰竭(acuterenalfailure)、冷球蛋白血癥(cryoglobulemia)、抗磷脂綜合征(antiphospholipidsyndrome)、黃斑變性性疾病(maculardegenerativediseases)諸如年齡相關(guān)黃斑變性(age-relatedmaculardegeneration)(amd)、脈絡(luò)膜新血管形成(choroidalneovascularization)(cnv)、葡萄膜炎(uveitis)、糖尿病性和其它缺血相關(guān)視網(wǎng)膜病變(diabeticandotherischemia-relatedretinopathies)、眼內(nèi)炎(endophthalmitis)、和其它眼內(nèi)新血管疾病(otherintraocularneovasculardiseases)諸如糖尿病性黃斑水腫(diabeticmacularedema)、病理性近視(pathologicalmyopia)、vonhippel-lindau病、眼的組織胞漿菌病(histoplasmosisoftheeye)、視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞(centralretinalveinocclusion)(crvo)、角膜新血管形成(cornealneovascularization)、視網(wǎng)膜新血管形成(retinalneovascularization)、以及同種異基因移植(allotransplantation)、超急性排斥反應(yīng)(hyperacuterejection)、血液透析(hemodialysis)、慢性阻塞性肺病綜合征(chronicocclusivepulmonarydistresssyndrome)(copd)、哮喘(asthma)、和吸入性肺炎(aspirationpneumonia)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中,所述補(bǔ)體相關(guān)病癥是補(bǔ)體相關(guān)眼疾(complement-associatedeyecondition),諸如年齡相關(guān)黃斑變性(age-relatedmaculardegeneration)(amd)或脈絡(luò)膜新血管形成(choroidalneovascularization)(cnv);還包腫瘤或癌癥,所述包括但不限于包括腎上腺皮質(zhì)癌,肛門癌,膀胱癌,腦腫瘤,乳腺癌,類癌腫瘤,胃腸道未知原發(fā)癌,子宮頸癌,結(jié)腸癌,子宮內(nèi)膜癌,食管癌,肝外膽管癌癥,ewings家庭腫瘤,顱外生殖細(xì)胞腫瘤,眼內(nèi)黑色素瘤眼癌,膽囊癌,胃癌,外生殖細(xì)胞腫瘤,妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤,頭頸癌,下咽癌,胰島細(xì)胞癌,腎癌,喉癌,口腔癌,肝癌,肺癌,艾滋病相關(guān)淋巴瘤,中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤,皮膚t細(xì)胞淋巴瘤,霍奇金淋巴瘤,惡性間皮瘤,黑色素瘤,梅克爾細(xì)胞癌,多發(fā)性骨髓瘤、漿細(xì)胞瘤,鼻咽癌,成骨細(xì)胞瘤,口咽癌,骨肉瘤,卵巢上皮癌,卵巢生殖細(xì)胞腫瘤,胰腺癌,外分泌,胰腺癌,鼻旁竇和鼻腔癌,甲狀旁腺癌,陰莖癌,垂體癌,前列腺癌,橫紋肌肉瘤,直腸癌,過渡細(xì)胞腎盂和尿道癌,唾液腺癌,sezary綜合征,皮膚癌,小腸癌,軟組織肉瘤,睪丸癌,惡性胸腺瘤,甲狀腺癌,尿道癌,子宮癌,不尋常的兒童癌癥,陰道癌,vulvar癌癥和wilms′瘤。
在另一個(gè)方面,本發(fā)明涉及檢測(cè)cfh的產(chǎn)品,所述產(chǎn)品包括前面所述的單克隆抗體。
本發(fā)明提供了前面所述的單克隆抗體在制備檢測(cè)cfh的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
進(jìn)一步,所述產(chǎn)品包括試劑盒、芯片或試紙。
應(yīng)理解,在本發(fā)明范圍內(nèi)中,本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征可以互相組合,從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
本發(fā)明其它方面由于本文的公開內(nèi)容,對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。
附圖說明
圖1顯示利用sds-page鑒定表達(dá)純化后的trn1004抗體的圖;
圖2顯示抗體trn1004結(jié)合位點(diǎn)驗(yàn)證的結(jié)果圖;
圖3顯示利用biacore檢測(cè)trn1004抗體的親和活性的圖。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明從有自身抗體的病人單個(gè)b細(xì)胞中分離獲得高親和力全人源單克隆抗體。本發(fā)明探索了抗腫瘤活性的機(jī)制并證明了抗體在體外殺死腫瘤細(xì)胞和在體內(nèi)抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。
分離的抗體或抗體片段可以是人源化的。
分離的抗體或抗體片段可以包含選自以下的重鏈免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域:人igm恒定結(jié)構(gòu)域,人igg4恒定結(jié)構(gòu)域,人igg1恒定結(jié)構(gòu)域,人ige恒定結(jié)構(gòu)域,人igg2恒定結(jié)構(gòu)域,人igg3恒定結(jié)構(gòu)域和人iga恒定結(jié)構(gòu)域。
本發(fā)明分離的抗體或抗體片段可能選自人抗體,免疫球蛋白分子,二硫鍵連接的fv,單克隆抗體,scfv,嵌合體抗體,單結(jié)構(gòu)域抗體,cdr移植抗體,雙抗體,人源化抗體,多特異性抗體,fab,雙特異性抗體,dvd,tvd,fab′,雙特異性抗體,f(ab′)2和fv。
本文所用的術(shù)語“可變”表示抗體中可變區(qū)的某些部分在序列上有所不同,它形成了各種特定抗體對(duì)其特定抗原的結(jié)合和特異性??勺冃约杏谳p鏈和重鏈可變區(qū)中稱為互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)或超變區(qū)中的三個(gè)片段中。天然重鏈和輕鏈的可變區(qū)中各自包含四個(gè)fr區(qū)(可變區(qū)中較保守的部分),它們大致上呈β-折疊構(gòu)型,由形成連接環(huán)的三個(gè)cdr相連,可形成部分β折疊結(jié)構(gòu)。每條鏈中的cdr通過fr區(qū)緊密地靠在一起并與另一鏈的cdr一起形成了抗體的抗原結(jié)合部位。恒定區(qū)不直接參與抗體與抗原的結(jié)合,但是它們表現(xiàn)出不同的效應(yīng)功能,例如參與抗體的依賴于抗體的細(xì)胞毒性。
下面通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。應(yīng)該理解的是,本發(fā)明的實(shí)施例是用于說明本發(fā)明而不是對(duì)本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的簡(jiǎn)單改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
實(shí)施例1全人源的單克隆的cfh抗體trn1004的制備
1.pbmc分離和單個(gè)記憶性b細(xì)胞分選
用親和素標(biāo)記cfh15-mer多肽(seqidno:9)作為釣餌,利用流式分選儀從合并的外周血單個(gè)核細(xì)胞(pbmc,采自表達(dá)cfh自身抗體的病人)中分選到了單個(gè)記憶b細(xì)胞,通過熒光-熒光標(biāo)記分選cd20+/cd27all/cfh-抗原結(jié)合記憶b細(xì)胞。為了使假陽性最小化,用alexa標(biāo)記鏈霉抗生物素蛋白fluor647和brilliantviolet421。每個(gè)熒光團(tuán)用鏈霉親和素進(jìn)行標(biāo)記在單獨(dú)的等分試樣上,然后將其混合在一起然后與生物素化的抗原肽相互作用。顯示升高熒光的兩種熒光團(tuán)細(xì)胞分選到單一96孔板的孔中。
2.vhdjh和vl基因的分離
通過rt/pcr從流式分選的人cfh抗原特異性記憶b細(xì)胞擴(kuò)增mab的vhdjh和vljl基因區(qū)段對(duì),并使用前述方法(liaoetal.,2013)測(cè)序。使用軟件程序cloanalyst(http://www.bu.edu/computationalimmunology/research/software/)推斷個(gè)體抗體的vhdjh和vljl基因區(qū)段的遺傳信息,包括基因區(qū)段家族使用,體細(xì)胞突變頻率,cdr3長(zhǎng)度和克隆譜系關(guān)系。
3.生產(chǎn)純化的重組抗體
合成選擇的cfh抗體的vhdjh和vljl基因并分別克隆到含有人igg1重鏈恒定區(qū)的修飾的pcdna3.1質(zhì)粒中。用轉(zhuǎn)染試劑polyfect共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞,具體操作參見說明書。轉(zhuǎn)染后6-8小時(shí)換新鮮培養(yǎng)基,并在37℃5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時(shí),收集細(xì)胞上清進(jìn)行檢測(cè)。
4.重組抗體的篩選檢測(cè)
(1)純化scr19(cfh15-mer多肽)
巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體中編碼人cfh短共有重復(fù)結(jié)構(gòu)域19(稱為scr19)進(jìn)行克隆。通過使用具有50,000和5,000mw截留值(sartorius,goettingen,germany)的vivacell70離心單元,然后hitrapspff陽離子交換色譜(gehealthcarelifesciences,piscataway,nj),通過順序差異過濾,從巴斯德畢赤酵母培養(yǎng)基中純化蛋白質(zhì)。
(2)篩選實(shí)驗(yàn)
以cfh15-mer多肽(seqidno:9)為抗原,并用包被液將抗原10倍稀釋后包被96孔elisa板,每孔100μl4℃過夜包被,用封閉液常溫封閉2個(gè)小時(shí)。將100μl的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染上清作為一抗常溫孵育2個(gè)小時(shí),用抗-iggγ鏈-hrp(millipore)為二抗(1:2000)作為二抗常溫孵育1個(gè)小時(shí),加入底物顯色液100μl/孔,常溫避光放置5min后,用2m硫酸鈉中止反應(yīng),用450nm/630nm波長(zhǎng)進(jìn)行比色。篩選獲得具有活性并特異性結(jié)合cfh15-mer多肽的抗體命名為trn1004,進(jìn)行大量表達(dá)和功能性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
5.抗體大量表達(dá)與純化
將trn1004抗體重鏈與輕鏈的表達(dá)載體用polyfect(qiagen)轉(zhuǎn)染試劑盒共轉(zhuǎn)染大批量的293細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后6-8小時(shí)換新鮮培養(yǎng)基,并在37℃5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時(shí)。收集轉(zhuǎn)染上清,4000rpm離心1小時(shí),采用amersham公司的protein-a親和層析柱直接純化表達(dá)上清。利用sds-page檢驗(yàn)抗體trn1004的表達(dá)及純化情況。
結(jié)果如圖1所示,還原后可見清晰的抗體重鏈和輕鏈。
實(shí)施例2結(jié)合位點(diǎn)驗(yàn)證試驗(yàn)
標(biāo)有生物素的cfh15-mer多肽抗原(seqidno:9),對(duì)每個(gè)氨基酸分別進(jìn)行突變,形成了15個(gè)突變肽,再加上野生型多肽作為陽性對(duì)照以及序列打亂的多肽作為陰性對(duì)照,用elisa檢測(cè)trn1004抗體在不同濃度下分別與上述18個(gè)多肽的結(jié)合情況,繪制曲線并且計(jì)算出areaundercurve(auc),分析抗體與多肽的關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)果如圖2顯示,trn1004抗體與cfh抗原多肽關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)是多肽序列g(shù)ppppidngditsfp中第5位、第6位、第7位、第8位、第11位、第12位,證明能與抗原多肽特異性結(jié)合。其中,圖2中cfh為陽性對(duì)照1,其序列如seqidno:9所示,or為陽性對(duì)照2,其序列如seqidno:11所示,ga1、pa2、pa3、pa4、pa5、ia6、da7、na8、ga9、da10、ia11、ta12、sa13、fa14、pa15分別代表上述15個(gè)突變肽。
實(shí)施例3抗體親和力測(cè)定
先進(jìn)行sa芯片偶聯(lián)捕獲分子,再活化芯片的葡聚糖表面,以進(jìn)樣時(shí)間確定偶聯(lián)量。最后利用sa芯片捕獲分子捕獲配體:將制備的全人源抗狂犬病病毒中和抗體作為配體,以計(jì)算得到的信號(hào)值確定單抗的進(jìn)樣濃度及接觸時(shí)間。單抗與cfh15-mer多肽(抗原)結(jié)合的親和力和動(dòng)力學(xué)分析:cfh15-mer多肽用hbs-ep緩沖液稀釋作為分析物,分析物以逐漸增高的濃度依次流過芯片,分別得到信號(hào)曲線。每個(gè)濃度作為1個(gè)循環(huán),完成1次循環(huán)后用10mmol/l的甘氨酸-鹽酸再生芯片以回復(fù)到原始未結(jié)合抗原的狀態(tài)。用biacorex-100system軟件進(jìn)行分析。
結(jié)果如圖3所示,trn1004抗體的親和力可達(dá)1.42e-08,具體見下表:
表1抗體親和力測(cè)定表
實(shí)施例4trn1004抗體的抗原表位測(cè)定
丙氨酸掃描定點(diǎn)突變:
為了明確重組cfh單抗的氨基酸印記,本發(fā)明分析了重組單抗和丙氨酸替代多肽(包含最初描述的那8個(gè)氨基酸結(jié)合域pidngdit序列)的結(jié)合情況。異亮氨酸1120突變?yōu)楸彼岷蟾亟M單抗完全不結(jié)合。天冬酰胺1117突變后有0%-35%的野生型結(jié)合。蘇氨酸1121突變后有1%-66%的野生型結(jié)合。多肽的上游四個(gè)殘基或下游三個(gè)殘基的改變對(duì)于單抗沒影響。
雖然以上僅描述了本發(fā)明的具體實(shí)施方式范例,但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解,這些僅是舉例說明,本發(fā)明的保護(hù)范圍是由所附權(quán)利要求書限定的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不背離本發(fā)明的原理和實(shí)質(zhì)的前提下,可以對(duì)這些實(shí)施方式做出多種變更或修改,但這些變更或修改均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
sequencelisting
<110>廣州泰諾迪生物科技有限公司;珠海泰諾麥博生物技術(shù)有限公司;暨南大學(xué)
<120>一種全人源抗補(bǔ)體因子h的抗體
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