本發(fā)明屬于基因工程技術領域，本發(fā)明涉及一個nf-y類核轉錄因子基因zmnf-ya13、其編碼的蛋白及該基因在提高植物耐旱性、鉀吸收功能及降低aba敏感性方面的作用。

背景技術：

植物在生長過程中會受到各種生物與非生物脅迫的影響，這些脅迫嚴重威脅著植物的生長發(fā)育。對糧食作物來說，生物與非生物脅迫都有可能使得作物的產(chǎn)量大大降低。干旱由于其分布廣泛且重復性高成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要限制因素。因此對植物尤其是對重要的糧食作物來說，研究其抗逆新品種就顯得尤為重要。

目前，nf-ya是mir169家族靶基因中報道的比較多的一個基因。nf-y類轉錄因子是一類重要的逆境調(diào)節(jié)因子，由nf-ya、nf-yb和nf-yc亞基組成。在行使功能時，nf-yb亞基和nf-yc亞基先在細胞質(zhì)中形成異源二聚體，然后遷移到細胞核中和nf-ya亞基結合形成有活性的異源三聚體，與ccaat結合從而調(diào)控下游基因的表達。

玉米是一種重要的糧食作物。本發(fā)明利用rt-pcr、race及5’端pcr技術從玉米中分離了zmnf-ya13全長cdna，分析了其編碼蛋白質(zhì)序列的結構特征、進化關系及該基因在玉米不同組織及非生物逆境脅迫處理下的表達模式，并使其在煙草中過表達，研究zmnf-ya13在干旱、aba及缺鉀脅迫下的功能，以期為進一步揭示該基因的生物學功能及調(diào)控機制奠定基礎。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于公開一種nf-y類核轉錄因子基因zmnf-ya13、其編碼蛋白及該基因在植物耐旱性、鉀吸收功能及降低aba敏感性方面的應用。該基因是從玉米中分離出來的，是一種nf-y類轉錄因子。nf-y類轉錄因子由nf-ya、nf-yb和nf-yc亞基組成。在行使功能時，nf-yb亞基和nf-yc亞基先在細胞質(zhì)中形成異源二聚體，然后遷移到細胞核中和nf-ya亞基結合形成有活性的異源三聚體，與ccaat結合從而調(diào)控下游基因的表達。過表達該基因能夠提高轉基因煙草對于干旱、低鉀脅迫的耐受性及降低其對aba敏感性，這種提高轉基因植物耐干旱和鉀吸收功能及降低其對aba敏感性的特性，可通過轉基因技術應用于農(nóng)作物上，從而應對日益嚴重的環(huán)境問題。

本發(fā)明的目的之一在于提供nf-y類核轉錄因子基因zmnf-ya13，該基因是從玉米中分離出來的，具有序列表中seqidno.1所示的堿基序列。其序列由1147個堿基組成，自5′端第48到第869位殘基為該基因的開放閱讀框序列。

本發(fā)明的另一方面在于提供具有與上文所述的seqidno:1所示的堿基序列95％以上的同源性，且編碼與seqidno:1所示的堿基序列編碼的蛋白質(zhì)具有相同生物學功能蛋白質(zhì)的堿基序列。

本發(fā)明的目的之二在于提供具有上文所述y類核轉錄基因zmnf-ya13編碼的蛋白zmnf-ya13，具有如seqidno:2所示的氨基酸序列，其是由273個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。本發(fā)明進一步提供所述核轉錄因子zmnf-ya13編碼的蛋白的衍生蛋白質(zhì)，即由序列表中seqidno.2的氨基酸殘基經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基取代、缺失或添加而產(chǎn)生的具有相同的生物學功能的衍生蛋白質(zhì)的氨基酸序列。

本發(fā)明的目的之三在于提供一種重組表達載體，該重組表達載體上含有上文所述的堿基序列；且在優(yōu)選的技術方案中，是以ptf101作為表達載體，該植物表達載體含有除草劑的抗性基因，可以利用除草劑對轉基因植株進行篩選。

本發(fā)明的目的之四在于提供一種含有上文所述重組表達載體的宿主細胞，所述宿主細胞優(yōu)選為根癌農(nóng)桿菌eha101菌株。

本發(fā)明的目的之五在于提供上文所述的nf-y類核轉錄因子基因zmnf-ya13在培育耐干旱和提高鉀吸收功能及降低對aba敏感性轉基因植物中的應用。該基因的轉基因植物在干旱及鉀吸收功能明顯提高，且對aba敏感性降低。優(yōu)選的技術方案中，該基因在提高煙草在干旱、鉀吸收性能及降低其對aba敏感性中有較好的應用效果。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明的基因zmnf-ya13具有核轉錄因子的功能，該基因能提高轉基因煙草在干旱脅迫下的葉片相對含水量、提高超氧化物歧化酶的活性、干重、鮮重并促進根系的生長，進而提高植物對于干旱脅迫的耐受性，同時也預示著它在農(nóng)作物耐旱方面的應用價值。在aba脅迫下轉zmnf-ya13基因煙草較野生型煙草的根系更發(fā)達，幼苗生長狀態(tài)更好，同時也預示著該基因在農(nóng)作物降低aba敏感性方面的應用價值。在k⁺耗竭實驗中，轉zmnf-ya13基因煙草較野生型煙草的耗竭液中的k⁺濃度下降得更多，這預示著該基因在農(nóng)作物耐低鉀方面的應用價值。

附圖說明

圖1為zmnf-ya13基因克隆pcr電泳圖，其中：a為保守區(qū)部分片段克隆，m為dl2000marker，泳道1為克隆所得保守區(qū)片段，長度約為662bp；b為3′端部分片段克隆，m為dl2000marker，泳道1為克隆所得3′部分片段，長度約為751kb；c為5′端部分片段克隆，m為dl2000marker，泳道1為克隆所得5′部分片段，長度約為750bp；d為orf全長pcr電泳圖，m為dl5000marker，泳道1為orf加3’utr，全長為1130bp，泳道2為orf，全長852bp。

圖2為本發(fā)明的zmnf-ya13基因編碼的蛋白質(zhì)保守區(qū)域分析圖，zmnf-ya13具有3個保守區(qū)域，dna結合區(qū)、nf-yb/c結合區(qū)及連接區(qū)，表明它屬于nf-ya家族成員。

圖3為本發(fā)明的zmnf-ya13基因編碼的蛋白的進化分析圖，結果顯示nf-ya與nf-yb之間具有顯著的差異；zmnf-ya13與同屬于單子葉植物的小麥的nf-ya10親緣關系最近。

圖4為不同脅迫條件下采用實時定量pcr的方法分析zmnf-ya13基因在玉米地上部分和地下部分的表達結果圖，結果表明該基因不同脅迫條件下在玉米地上及地下部分中均呈現(xiàn)不同程度的上調(diào)或下調(diào)表達。

圖5為采用實時定量pcr的方法分析zmnf-ya13基因在玉米不同的組織器官中的表達結果圖，結果表明該基因在玉米不同組織器官中都有表達，且在雄穗、花絲和種子中表達量較高。

圖6為重組植物表達載體ptf101-zmnf-ya13的結構圖譜，表明該基因可在35s啟動子的調(diào)控下組成型表達，重組載體具有除草劑抗性。

圖7為除草劑篩選后所獲得的陽性轉基因煙草。

圖8為干旱脅迫條件下轉基因以及野生型煙草的生長情況及各項生理指標的檢測結果。

圖9為aba脅迫條件下轉基因及野生型煙草的生長情況。

圖10為轉基因與野生型煙草的k⁺耗竭實驗結果。

具體實施方式

下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的應用范圍。下面實施例中未注明具體實驗條件的試驗方法，通常按照常規(guī)條件或分子克隆中所述條件，或按照產(chǎn)品說明書上所提供的條件。下面是實例中所用的材料、試劑等如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

試驗中使用的試劑盒以及試劑：無縫連接試劑盒：trangene公司，peasy-uniseamlesscloningandaseemblykit；質(zhì)粒提取試劑盒：sangonbiotech公司，sanprep柱式質(zhì)粒dna小量抽提試劑盒。

實施例1zmnf-ya13基因cdna的克隆與分析

(1)玉米總rna提取

稱取50mg鄭58新鮮玉米葉片，于液氮中研磨成粉末。待液氮揮發(fā)完全后，迅速將其轉入含有1ml預冷trizol試劑的離心管中，充分混勻，室溫靜置10min；加入0.2ml氯仿，混合均勻，室溫靜置5min；于4℃低溫離心機中，12000r/min離心15min，將上清液轉移至新的離心管中；加入等體積的異丙醇，充分混勻，室溫靜置10min；于低溫離心機中4℃，12000r/min離心15min；棄上清，加入1.0ml預冷的75％乙醇(depc水配制)，充分洗滌沉淀，4℃，7500rpm離心5min；棄上清，于超凈工作臺中吹干至透明狀，加入適量rnase-free水溶解沉淀。1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測rna的完整性。結果呈現(xiàn)了28s、18s、5s三種典型的rna帶型，各條帶清晰，無明顯的拖尾現(xiàn)象，表明提取的rna無明顯降解，可進一步用于rt-pcr實驗。

(2)單鏈cdna的獲得

以提取的玉米葉片總rna為模板(500ng)，根據(jù)北京全式金公司reversetranscriptase反轉錄說明書進行rt-pcr，得到的單鏈cdna可直接用于2nd-strandcdna的合成或者pcr擴增等。

(3)玉米zmnf-ya13基因部分編碼區(qū)的獲得

1)保守區(qū)引物設計：根據(jù)ncbi上已有的b73玉米zmnf-ya13基因序列，在其高度保守區(qū)設計一對引物，序列分別為表1中的zmnf-ya13-f和zmnf-ya13-r。

2)pcr擴增：以反轉錄獲得的單鏈cdna為模板，zmnf-ya13-f和zmnf-ya13-r為正反向引物，pcr擴增zmnf-ya13基因部分編碼區(qū)。將pcr產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分離(結果如圖1a)，至溴酚藍指示帶位于凝膠2/3處，在紫外燈下切下662bp區(qū)域的凝膠放入1.5ml離心管中，用takara公司(大連)的minibestagarosegeldnaextractionkitver.3.0回收試劑盒進行回收。

3)回收dna片段連接、轉化與測序：采用寶生物pmd18-tvector試劑盒，將回收后的pcr產(chǎn)物直接與t載體相連，連接產(chǎn)物用于大腸桿菌轉化。pcr檢測呈陽性的克隆，送測序，測序后即可確定zmnf-ya13基因的部分片段信息。將陽性克隆的測序結果通過ncbi在線數(shù)據(jù)庫做核酸同源性比對，結果表明克隆所得片段與b73玉米中zmnf-ya13同源性分別為99％。初步推斷克隆所得片段是玉米zmnf-ya13基因編碼區(qū)的部分序列。

(4)race法克隆玉米zmnf-ya13基因3′cdna

1)3′race特異引物的設計：根據(jù)已獲得的玉米zmnf-ya13基因部分cdna片段以及takara(大連)公司的3’-fullracekit提供的引物3’raceouterprimer/3’raceinnerprime，設計一對嵌套pcr引物：3′正向特異性外側引物3-gsp1，巢式特異性內(nèi)側引物3-gsp2，引物序列見表1。

2)單鏈cdna的獲得：按照takara3′race試劑盒操作，反轉錄所得單鏈cdna作為巢式pcr模版。

3)巢式pcr反應：outerpcr反應用外側引物3-gsp1和3′raceouterprimer進行擴增。innerpcr反應以巢式第一輪pcr產(chǎn)物為模板，用內(nèi)側引物3-gsp2和3′raceinnerprimer引物進行巢式擴增。pcr產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分離(結果如圖1b)、切膠回收、連接克隆載體、轉化大腸桿菌感受態(tài)。選取長度為750bp左右的陽性克隆送測序。測序結果通過ncbi數(shù)據(jù)庫做blast比對，結果顯示：該序列與b73玉米zmnf-ya13基因同源性為100％，初步推斷該片段是zmnf-ya13基因3′端部分序列。

(5)5’端pcr法克隆zmnf-ya13基因5′cdna

本實施例中zmnf-ya13基因5′cdna序列采用5’端pcr方法獲得。步驟如下：由于在實驗的過程中發(fā)現(xiàn)鄭58玉米與b73玉米中nf-ya13基因的同源性達到99％，因此在b73玉米的nf-ya135’utr設計引物通過pcr的方法獲得了約750bp的zmnf-ya13基因5′端片段(圖1c)，回收純化目的片段，連接到pmd-18t克隆載體上，連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌dh5α感受態(tài)細胞；挑取單菌落搖菌進行菌液pcr檢測并挑取陽性克隆送測序。通過blast比對，結果表明該序列與b7玉米nf-ya135′端序列的同源性分別為98％，由此可以推斷該序列是玉米nf-ya13基因5′端部分序列。

(6)玉米zmnf-ya13基因編碼區(qū)的獲得

將已克隆得到的保守區(qū)序列、3′端以及5′端進行拼接，通過orffinder預測出zmnf-ya13的全長開放閱讀框(orf)。利用帶有植物表達載體ptft01同源臂的正反向引物，通過pcr的方式分別擴增出zmnf-ya13基因的orf及帶3’utr的orf(圖1d)。將pcr產(chǎn)物送測序公司測序，測序結果與拼接的序列一致。將該基因命名為zmnf-ya13。

(7)生物信息學分析

利用通過clustal將zmnf-ya13與擬南芥、玉米、人及小鼠等nf-ya氨基酸序列進行比對，結果表明，玉米nf-ya13蛋白含有其他物種中nf-ya家族所包含的保守區(qū)域：nf-yb/c結合區(qū)、dna結合區(qū)及中間連接區(qū)(圖2)。系統(tǒng)發(fā)育分析表明zmnf-ya13是典型的核轉錄因子nf-y類家族成員(圖3)，與已報導的其他植物核轉錄因子nf-y具有很高的同源性，其中與擬南芥(arabidopsisthaliana)nf-ya3同源性最高，達到72％，與水稻(oryzasativa)、大豆(solanumlycopersicum)及小麥(triticumaestivum)等的nf-ya同源性介于39％-61％之間(表2)。

表1.zmnf-ya13基因克隆所用引物

注：表1中橫線標注的堿基序列為載體同源臂。

表2.zmnf-ya13與其他高等植物nf-ya家族氨基酸同源性分析

實施例2玉米中zmnf-ya13基因表達模式分析

本實驗所用玉米材料品種為鄭58。

用于研究脅迫處理的玉米處理方式：將玉米種子放置于65℃的水中，充分攪拌，待水至室溫時，將種子置于潮濕避光處萌發(fā)，待種子萌發(fā)5天后，將玉米幼苗種植于裝有等量石英砂的花盆中于恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)條件為溫度24℃/20℃(晝/夜)，光周期16h/8h(晝/夜)，空氣濕度60％。待玉米幼苗長至三葉一心期后選取長勢一致的植株分別進行干旱、nacl、na2co3、冷、aba以及缺鉀脅迫處理。本實驗采用25％peg6000處理24h的方法模擬自然干旱(圖4a，b)；用含有200mmnacl的hoagland營養(yǎng)液澆灌用于鹽脅迫誘導(圖4c，d)；將玉米幼苗置于4℃的冰箱中用于低溫脅迫處理(圖4e，f)；用含有100μmaba的hoagland營養(yǎng)液澆灌用于aba脅迫處理(圖4g，h)；用含有50mmolna2co3的hoagland營養(yǎng)液澆灌用于堿脅迫誘導(圖4k，l)；用不含鉀的hoagland營養(yǎng)液澆灌用于誘導缺鉀脅迫(圖4i，j)。各處理均設三個平行，在處理后的第0h、1h、3h、6h、12h、24h取樣，分別收集地上和地下部分并混合均勻，經(jīng)液氮速凍后于-80℃冰箱中保存，用于后續(xù)rna的提取。

用于研究不同組織器官的玉米材料種植于大連理工大學轉基因試驗基地的溫室內(nèi)。各個組織器官均設三個平行，在玉米散粉后第二天取其根、莖、葉、雄穗、花絲，待種子灌漿后取其種子，經(jīng)液氮速凍后于-80℃冰箱中保存，用于后期rna的提取。

提取的rna反轉錄成cdna，用于后續(xù)qpcr(實時定量pcr檢測)實驗，表3為qpcr過程中所用到的引物序列。其中以zma-mir172及zmu6基因作為qpcr內(nèi)參(mir172-rt為zma-mir172特異性反轉錄引物，其他表內(nèi)引物為zmnf-ya13、zma-mir172及zmu6的上、下游引物)。

表3.zmnf-ya13基因的qrt-pcr擴增引物

結果表明，相對于對照組，地上及地下部分中zmnf-ya13均呈現(xiàn)不同程度的上調(diào)或下調(diào)表達(圖4)。zmnf-ya13在不同的組織器官中都有表達，且在雄穗、花絲和種子中表達量較高(圖5)。

實施例3轉zmnf-ya13基因煙草的獲得

(1)zmnf-ya13基因植物表達載體構建

1)植物表達載體ptf101的獲得：采用生工生物工程有限公司質(zhì)粒小量提取試劑盒提取ptf101植物表達載體的質(zhì)粒，具體方法見說明書。利用smai及spei兩種限制性內(nèi)切酶對ptf101-35s植物表達載體進行雙酶切反應，使其線性化，采用瓊脂糖凝膠電泳對酶切后的產(chǎn)物檢測，切下目標區(qū)域處的凝膠并用膠回收試劑盒進行回收純化。

2)zmnf-ya13編碼區(qū)的獲得：以反轉錄所得單鏈cdna為模板，分別以zmnf-ya13-s及zmnf-ya13-35s-a為正反向引物，擴增zmnf-ya13基因編碼區(qū)。利用1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測pcr結果，切下目標區(qū)域處的凝膠并用膠回收試劑盒進行回收純化。

3)連接：利用無縫克隆試劑盒將回收純化后的植物表達ptf101與zmnf-ya13基因編碼區(qū)進行連接。

4)采用熱激法將連接液轉化大腸桿菌dh5α，pcr檢測篩選出陽性克隆。

圖6為重組植物表達載體ptf101-zmnf-y13的結構圖譜，表明該基因可在35s啟動子的調(diào)控下組成型表達，重組載體具有除草劑抗性。

5)陽性重組質(zhì)粒轉化農(nóng)桿菌：提取ptf101-zmnf-ya13質(zhì)粒，轉化農(nóng)桿菌eha101感受態(tài)細胞。

①根癌農(nóng)桿菌eha101感受態(tài)細胞的制備方法如下：挑取eha101單菌落于含有100mg/l利福平和100mg/l卡那霉素的yeb液體培養(yǎng)基中，28℃，180rpm振蕩培養(yǎng)過夜。取過夜培養(yǎng)的菌體按1:100的比例接種到50mlyeb液體培養(yǎng)基中，28℃，180rpm振蕩培養(yǎng)3-4h至細菌生長對數(shù)期od600＝0.5-0.6左右。取5ml菌液于4℃，4000rpm離心10min，沉淀用5ml預冷的te(ph7.5)洗滌一次，加1ml新鮮的yeb培養(yǎng)基，重新懸浮，分裝，-70℃保存。

②采用凍融法將質(zhì)粒ptf101-zmnf-ya13導入農(nóng)桿菌，方法如下：取一管(0.2ml)根癌農(nóng)桿菌(agribecteriumtumefaciens)eha101菌株感受態(tài)細胞置冰上融化，加入1μg質(zhì)粒ptf101-zmnf-ya13，混勻，然后依次在冰上、液氮中及37℃水浴中放置5min，用yeb液體培養(yǎng)基稀釋至1ml，于28℃，180rpm振蕩培養(yǎng)2-4h；取適量菌液涂布于含有100mg/l利福平、50mg/l卡那霉素和100mg/l壯觀霉素的yeb平板培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)36h左右長出抗性菌落，運用菌液pcr確定陽性克隆。

(2)葉盤轉化法轉化煙草

1)轉化用煙草葉盤的制備：取生長二十天左右的無菌煙草葉片去除主脈，

用無菌剪刀將其剪成1cm²的小塊作為侵染用外植體。

2)轉化用農(nóng)桿菌菌液的制備：將從-80℃冰箱中取出來的含有重組表達載體的農(nóng)桿菌在固體的yeb培養(yǎng)基(yeb+100mg/lrif+50mg/lkan+100mg/lspec)中進行劃線培養(yǎng)。挑取生長狀態(tài)良好的單菌落接種于5ml含有上述抗生素的yeb液體培養(yǎng)基中，28℃，180rpm過夜搖菌20h左右。將過夜活化的農(nóng)桿菌按照1:50的比例加入到不含抗生素的液體yeb中，28℃振蕩培養(yǎng)4～6h至od600約為0.5～0.6。

3)轉化：將剪好的煙草葉片放入上述農(nóng)桿菌菌液中5-10min，期間緩慢搖晃2-3次。侵染結束后將葉片置于無菌的濾紙上以吸干殘余的菌液，遠軸面向上置于分化培養(yǎng)基(ms+6-ba0.5mg/l+naa0.1mg/l)上28℃暗培養(yǎng)2d。

4)抗性芽的篩選及轉基因植株的生根培養(yǎng)：共培養(yǎng)兩天后，葉盤周圍會長

出清晰可見的農(nóng)桿菌菌落，將其轉移到含有雙丙氨膦和頭孢霉素的篩選培

養(yǎng)基上進行篩選，兩周左右即可形成愈傷組織。將煙草愈傷組織轉移到新

的篩選培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)至長出幼芽，用滅菌手術刀切下1-2cm的幼芽，

置于生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)(圖7)。

實施例4干旱脅迫條件下轉基因煙草的生理檢測

將pcr檢測為陽性的t0代轉zmnf-ya13基因煙草l3和l4兩個株系利用無性繁殖的方式進行擴繁，以獲得足夠的苗用于生理實驗。將生長狀態(tài)一致的t0代轉基因煙草與野生型植株(wt)種植于花盆中，并置于恒溫光照培養(yǎng)箱中進行緩苗培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為25℃/23℃(晝/夜)，光周期16h/8h(晝/夜)，空氣濕度60-70％，培養(yǎng)兩周后進行干旱脅迫處理。挑選生長狀態(tài)一致的煙草進行后續(xù)的干旱脅迫實驗(圖8a)。本實驗采用苛扣澆水的方法模擬自然條件下的干旱，干旱處理前給所有植株澆以充足的水分，之后不再澆水。在干旱處理的7d后取樣測定葉片相對含水量(rwc)、sod酶活性、干重、鮮重以及根長等各項生理指標。為保證實驗結果的準確性，各指標的測定均設有三個重復。

實驗結果：干旱脅迫7d后，野生型植株出現(xiàn)了明顯萎蔫現(xiàn)象，而轉zmnf-ya13基因煙草l3和l4株系能夠正常生長(圖8b)。為進一步了解煙草葉片中水分的損失狀況，本研究測定了干旱處理前后野生型及轉基因煙草的rwc。干旱處理之前野生型煙草及轉zmnf-ya13基因煙草l3和l4株系的葉片相對含水量并無顯著差異，其相對含水量分別為80％、78％和81％，在干旱處理7d后，野生型、轉zmnf-ya13基因的煙草l3和l4株系的葉片相對含水量都有所下降，分別為65％、74％和73％，轉基因植株的葉片相對含水量顯著高于野生型植株(圖8c)；在干旱處理前，野生型、轉zmnf-ya13基因的煙草l3和l4株系葉片中sod的活性分別為194u/g、188u/g和150u/g。野生型與轉zmnf-ya13基因煙草l3株系葉片中的sod活性無明顯差別，l4株系煙草葉片中sod活性卻顯著低于野生型植株。干旱處理一周后，野生型、轉zmnf-ya13基因的煙草l3、l4株系葉片中sod活性較干旱處理前都有所提高分別為213u/g、288u/g和274u/g，且轉zmnf-ya13基因的煙草l3和l4株系葉片中sod活性顯著高于野生型植株(圖8d)。植物根部生長可能與植物對干旱的耐受性相關。干旱處理一周后，野生型、轉zmnf-ya13基因煙草l3和l4株系的根長分別為11.67±0.10cm、15.33±0.17cm和15.00±0.14cm，轉基因植株的根長顯著大于野生型植株的根長。植物干鮮重可以直觀的反映出植物的生長狀況。干旱處理一周后，轉基因株系的干鮮重顯著高于野生型植株(圖8e)。

因此，上述實驗結果表明在干旱脅迫下過表達zmnf-ya13基因的煙草具有優(yōu)于野生型植株的表型及生理特性，最終受到較少的傷害。

實施例5aba脅迫條件下轉基因煙草的生根實驗

將pcr檢測為陽性的t0代轉zmnf-ya13基因煙草l3和l4兩個株系運用無性繁殖的方式進行擴繁，以獲得足夠的苗用于生理實驗。將生長狀態(tài)一致的l3、l4及野生型煙草分別在含有3μmaba的ms培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周，進行生根實驗。

實驗結果：從轉基因煙草的生根試驗中可以看出，在aba處理3周后，轉基因煙草l3和l4的根系較野生型煙草株系更發(fā)達，且轉基因煙草比野生型煙草的生長狀態(tài)更好(圖9)。

因此，該實驗結果表明過表達zmnf-ya13基因可能降低轉基因煙草對aba的敏感性。

實施例6轉基因煙草的k⁺耗竭實驗

將pcr檢測為陽性的t0代轉zmnf-ya13基因煙草l3和l4兩個轉基因株系利用無性繁殖方式進行擴繁，以獲得足夠的苗用于生理實驗。煙草在ms培養(yǎng)基中培養(yǎng)3w后，分別選取大小和長勢都一致的轉基因陽性植株和野生型植株各3棵進行鉀饑餓處理48h，饑餓液為缺鉀的1/2hoagland營養(yǎng)液以nah2po4代替kh2po4，以ca(no3)2代替kno3，饑餓處理后進行耗竭實驗(圖10a)。耗竭液為0.2mmcaso4+0.1mmkcl，每4h取一次樣，耗竭時間為32h；饑餓和耗竭期間保持24h通氣。將取出的耗竭液稀釋10倍后用原子吸收方法測定耗竭液中鉀離子濃度。

實驗結果：隨著時間變化，耗竭液中的的k⁺濃度逐漸下降。相對于野生型煙草(wt)，轉基因煙草l3株系的耗竭液中k⁺濃度下降得更快，即k⁺被更高效地吸收(圖10b)。

因此，實驗結果表明過表達zmnf-ya13基因可能提高轉基因煙草的k⁺吸收能力。

sequencelisting

<110>一種nf-y類核轉錄因子基因zmnf-ya13、其編碼的蛋白及其應用

<120>大連理工大學

<130>2011

<160>2

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1147

<212>dna

<213>人工合成

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