本發(fā)明屬于免疫學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種伯氏瘧原蟲配子體重組蛋白(rpbg37)及其制備方法和在瘧疾傳播阻斷過程中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

瘧疾是瘧原蟲經(jīng)媒介按蚊傳播的一種嚴(yán)重威脅人類健康的感染性寄生蟲疾病，最新who全球瘧疾報(bào)告指出，僅2015年全球仍有約429000人死于瘧疾。在瘧疾的高密度流行區(qū)，目前可用的抗瘧疾方法已經(jīng)不足以阻斷瘧疾傳播，耐藥蚊蟲與瘧原蟲的增加與流行更加增大了控制瘧疾的難度。因此，國際瘧疾消除專家委員會(huì)(malera)認(rèn)為控制瘧疾傳播的關(guān)鍵措施是研發(fā)新的控制方法，有效地阻斷瘧疾的傳播，而疫苗無疑是完成這項(xiàng)工作的最佳武器。瘧疾疫苗主要分三大類：紅前期疫苗、紅內(nèi)期疫苗以及傳播阻斷疫苗(tbvs)；其中：紅前期疫苗與紅內(nèi)期疫苗可降低瘧疾的感染率與臨床發(fā)病率，但兩者的候選抗原均暴露于人體免疫系統(tǒng)，受到人體免疫壓力等因素的影響，候選抗原存在廣泛的基因多態(tài)性，傳播阻斷疫苗不僅可以阻斷瘧疾流行的傳播，且其候選抗原主要表達(dá)于蚊蟲階段瘧原蟲表面，不受脊椎動(dòng)物免疫系統(tǒng)選擇壓力的影響，顯示出較低的多態(tài)水平，不會(huì)出現(xiàn)抗原變異，更有利于疫苗的免疫效果。因此,tbvs被認(rèn)為是加速瘧疾控制和最終根除瘧疾的新策略。

tbvs的效應(yīng)機(jī)制是以蚊階段瘧原蟲表達(dá)的特異性蟲體表面蛋白作為抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生抗蚊階段瘧原蟲表面蛋白的特異性抗體。當(dāng)蚊吸入被免疫的人血后，抗蚊階段瘧原蟲表面蛋白的特異性抗體與蚊中腸內(nèi)發(fā)育的瘧原蟲發(fā)生特異性結(jié)合，進(jìn)而阻斷蚊體內(nèi)瘧原蟲的進(jìn)一步發(fā)育。因此，tbvs可以阻斷按蚊將瘧原蟲從一個(gè)宿主傳播至另一個(gè)宿主。

tbvs候選抗原主要表達(dá)于瘧原蟲的有性生殖階段，即配子體至動(dòng)合子發(fā)育階段。目前，研究發(fā)現(xiàn)的tbvs候選抗原非常有限，如p230、p48/45、p25和p28。但這幾種瘧原蟲有性階段疫苗候選抗原誘導(dǎo)的特異性抗體尚不能達(dá)到令人滿意的傳播阻斷效果。因此，瘧疾防控的重點(diǎn)策略是迫切需要篩選并增加新型瘧原蟲有性階段候選抗原，并制備重組蛋白，為后續(xù)開發(fā)高效、安全的tbv疫苗提供有效靶點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述存在的問題，本發(fā)明目的在于提供一種伯氏瘧原蟲配子體重組蛋白(rpbg37)及其制備方法和在瘧疾傳播阻斷中的應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的具體方案如下。

本發(fā)明提供的伯氏瘧原蟲配子體重組蛋白(rpbg37)的氨基酸序列為seqidno：1；或與序列seqidno.1限定的氨基酸序列同源性在95-100％編碼相同功能蛋白質(zhì)的氨基酸序列；或seqidno.1所示的氨基酸序列經(jīng)增加、缺失或替換一個(gè)或多個(gè)氨基酸且具有同等活性的衍生的蛋白。所述的合成用于編碼伯氏瘧原蟲配子體重組蛋白具有63個(gè)氨基酸，其位于pbg37全長(zhǎng)蛋白的第26-88位氨基酸殘基位置，其氨基酸序列為seqidno.1：lys-gln-asp-val-tyr-leu-asp-asp-glu-phe-lys-ser-phe-thr-phe-phe-phe-ala-ser-ser-pro-ser-ala-asn-phe-leu-ser-arg-ile-val-his-ser-asn-glu-ala-lys-phe-thr-gln-ile-lys-asn-lys-thr-asp-ile-trp-asn-lys-thr-ile-asp-lys-ala-tyr-ser-ile-asn-gln-val-ser-asn-asn。

本發(fā)明還提供編碼上述伯氏瘧原蟲配子體重組蛋白的基因，由含編碼上述重組蛋白的基因?qū)Φ闹亟M表達(dá)載體也屬于本發(fā)明的范圍，所述的重組表達(dá)載體由含有瘧疾傳播阻斷的重組蛋白的基因原核表達(dá)載體組成，所述的原核載體為pet-32a表達(dá)載體。

所述的編碼該重組蛋白的核苷酸為189bp，其核苷酸序列為seqidno：2：aaacaggatgtttatttggatgatgaattcaaaagtttcacgtttttttttgcttcttccccatcggctaattttttgtcccggattgtccatagcaatgaagcgaaatttacccaaataaaaaacaaaacagatatatggaacaaaacaatagacaaagcatactcaattaatcaggtttcaaataat。

優(yōu)選的，所述的重組表達(dá)載體為大腸桿菌dh-5α表達(dá)菌株。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了上述重組蛋白的制備方法，所述方法包括引物的設(shè)計(jì)、目的基因的擴(kuò)增、重組表達(dá)載體的構(gòu)建、重組蛋白的表達(dá)和純化。

所述的伯氏瘧原蟲配子體重組蛋白pbg37在制備瘧疾傳播阻斷疫苗中的應(yīng)用。

本發(fā)明的顯著效果。

本發(fā)明旨在通過生物信息學(xué)的分析和分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，提供一種新型的具有傳播阻斷效應(yīng)的重組蛋白，以進(jìn)一步提高瘧疾傳播阻斷效果。

本發(fā)明所述的重組蛋白是通過對(duì)伯氏瘧原蟲進(jìn)行生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)出配子體表達(dá)的一種表面蛋白，設(shè)計(jì)截短片段，在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)、純化，并進(jìn)行動(dòng)物免疫，獲得免疫血清，驗(yàn)證其傳播阻斷效應(yīng)。為進(jìn)一步確定其功能,我們還制備了相應(yīng)的抗體和基因敲除蟲株,通過功能實(shí)驗(yàn),明確其傳播阻斷效果。

應(yīng)該明確的是，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)本發(fā)明公開的seqidno.1氨基酸序列，在不影響其蛋白生物活性的前提下，對(duì)于其實(shí)施取代、缺少和/或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)序列比對(duì)同源性在95％以上，所得到所述蛋白的突變體序列。因此，本發(fā)明還包括對(duì)seqidno.1所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺少和/或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸得到高同源性且具有生物活性和相同功能的衍生蛋白。本發(fā)明還提供了一種基因打靶技術(shù)敲除伯氏瘧原蟲配子體蛋白(pbg37)后獲得蟲株δpbg37。由含上述重組蛋白目的基因兩側(cè)同源臂的重組打靶載體也屬于本發(fā)明的范圍，該重組打靶載體分別插入目的基因兩側(cè)同源臂，含有hdhfr耐藥基因用來篩選陽性克隆蟲株。該打靶載體為pl0034表達(dá)載體。本發(fā)明還提供了一種含有上述重組打靶載體的大腸桿菌tg1菌株。

本發(fā)明首次用分子生物學(xué)方式篩選伯氏瘧原蟲配子體蛋白(plasmodiumbergheigametocyte37，pbg37，pbanka_060330)。并確定瘧原蟲有性生殖階段表達(dá)的pbg37的基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。pbg37是分子量為40207da的保守膜蛋白，存在一個(gè)信號(hào)肽、兩個(gè)低度復(fù)雜區(qū)及七個(gè)跨膜區(qū)，與其他瘧原蟲株高度同源。隨后，應(yīng)用原核表達(dá)系統(tǒng)成功地表達(dá)并純化了可溶性的重組蛋白rpbg37，經(jīng)動(dòng)物免疫，收獲免疫血清。利用該血清對(duì)pbg37進(jìn)行定位，為進(jìn)一步功能的研究提供新的理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。然后，利用基因打靶技術(shù)敲除pbg37，獲得pbg37基因敲除型瘧原蟲株δpbg37，并對(duì)δpbg37進(jìn)行了詳細(xì)的表型與生物學(xué)功能研究，明確pbg37基因?qū)Ο懺x生活史的影響；以及利用前期制備的重組蛋白rpbg37獲得的免疫血清，鑒定pbg37的生物學(xué)功能和傳播阻斷效應(yīng)，為瘧疾疫苗的研制開發(fā)打下基礎(chǔ)。

本發(fā)明所利用的基因打靶技術(shù)，其原理是利用活細(xì)胞基因組dna可與外源性dna的同源序列發(fā)生同源重組，對(duì)預(yù)先選擇的基因進(jìn)行定點(diǎn)修飾以達(dá)到改變基因組中某一特定基因的目的。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是能將外源基因引入到瘧原蟲基因組dna的特定片段上，并靶向敲除目的基因，而靶向引入的基因隨基因組dna的復(fù)制而穩(wěn)定復(fù)制，因此可在活體內(nèi)對(duì)某一特定基因的功能進(jìn)行研究，并可在體內(nèi)分析瘧原蟲相應(yīng)蛋白的功能。因鼠瘧整個(gè)生命周期的實(shí)驗(yàn)程序均可以進(jìn)行人工操作，具有明顯的易用性。鼠瘧的基因組與人瘧的基因組約有80％的同源性，所以通過敲除鼠瘧中的靶基因、明確其生物學(xué)功能來推斷相應(yīng)的靶基因在人瘧中的生物學(xué)作用也被廣泛應(yīng)用。

附圖說明

圖1為對(duì)pbg37蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析的結(jié)果示意圖。

圖2為重組質(zhì)粒pet32a-pbg37酶切鑒定。

圖3為重組蛋白rpbg37的sds-page結(jié)果。

圖4為elisa檢測(cè)重組蛋白rpbg37免疫小鼠所得抗血清的抗體滴度水平。

圖5為westernblot檢測(cè)抗血清中抗體的特異性，鑒定pbg37的定位階段。

圖6為ifa檢測(cè)抗血清中抗體識(shí)別天然抗原的能力，鑒定pbg37的定位階段。

圖7為基因敲除載體構(gòu)建模式圖。

圖8為pcr鑒定基因敲除基因型的結(jié)果。

圖9為基因敲除后表型的鑒定。

圖10為重組蛋白rpbg37免疫小鼠所得抗血清體內(nèi)外傳播阻斷效應(yīng)。

具體實(shí)施方式

以下所述是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明限定范圍的前提下，還可以做出若干改進(jìn)，這些改進(jìn)也為本發(fā)明的保護(hù)范圍。

一、試驗(yàn)材料。

1.1菌株及質(zhì)粒：大腸桿菌dh5α，m15和tg1(購自北京鼎國昌盛公司)，大腸桿菌escherichiacolirosetta-gamib(de3)(購自杭州豐?？萍加邢薰?，原核表達(dá)載體pet32a和打靶載體pl0034(購自clontech公司)。

1.2蟲株：伯氏瘧原蟲(p.berghei)(ankastrain2.34)，獲贈(zèng)于日本愛媛大學(xué)。

1.3動(dòng)物：清潔級(jí)balb/c小鼠購自北京維通利華公司。

1.4引物合成服務(wù)由深圳華大科技有限公司提供。

1.5主要試劑和儀器。

主要試劑：胰蛋白胨、酵母提取物購自oxoid公司，氯化鈉購自dm公司，基因組提取試劑盒購自takara公司，質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購自天根生化科技有限公司，dna聚合酶和ligationhigh連接酶購自toyobo公司，限制性內(nèi)切酶購自neb公司，ni-nta為novagen公司產(chǎn)品，最小截留分子量為3500da的透析袋購自millipore公司產(chǎn)品，hrp標(biāo)記的二抗購自北京鼎國昌盛公司，鼠源alexa-488熒光二抗購自invitrogen公司，乙胺嘧啶購自sigma公司，bca定量試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。

主要儀器有：水平電泳儀和垂直電泳儀(上海天能科技有限公司)，酶聯(lián)儀(thermo，multiskanmk3)，高速離心機(jī)(hitachi,cr22gⅲ)。

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)的說明。

實(shí)施例1。

瘧疾傳播阻斷疫苗候選抗原pbg37確定及其重組蛋白的制備。

1.利用分子生物信息學(xué)技術(shù)，鑒定并預(yù)測(cè)pbg37的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和功能。

pbg37(pbanka_060330)基因在瘧原蟲數(shù)據(jù)庫中被描述為“保守的瘧原蟲蛋白，功能未知”。smart分析顯示，pbg37蛋白含有一個(gè)信號(hào)肽、兩個(gè)低度復(fù)雜區(qū)及七個(gè)跨膜區(qū)，為表達(dá)可溶性蛋白，我們避開信號(hào)肽和跨膜區(qū)在b細(xì)胞表位富集區(qū)篩選獲得了一個(gè)片段，即從n端起得第26到88個(gè)氨基酸殘基，共計(jì)63個(gè)氨基酸殘基作為本發(fā)明所設(shè)計(jì)的rpbg37的氨基酸序列，見圖1，圖中顯示該蛋白存在一個(gè)信號(hào)肽，兩個(gè)低度復(fù)雜區(qū)和七個(gè)跨膜區(qū)，第26-88位氨基酸是本發(fā)明表達(dá)的氨基酸序列。

2.重組蛋白表達(dá)載體pet32a-pbg37的構(gòu)建。

2.1瘧原蟲基因組dna的提取。

6-8周齡雌性balb/c小鼠腹腔注射200μl苯肼(6mg/ml),三天后小鼠腹腔感染1×10⁷p.berghei感染的紅細(xì)胞，感染第四天開始檢測(cè)瘧疾血癥，當(dāng)瘧疾血癥達(dá)到30％左右時(shí)，肝素鈉抗凝取心臟血液，按照血液基因組dna提取試劑盒takaradnaextractionkit說明書來提取p.berghei瘧原蟲基因組dna；將提取后的dna測(cè)定濃度后，-20℃保存。

2.2引物設(shè)計(jì)合成。

利用primerpremier5軟件針對(duì)原核表達(dá)載體pet32a(+)設(shè)計(jì)引物，上下游引物5’端分別引入限制性內(nèi)切酶bamhi和noti酶切位點(diǎn),引物序列如下。

pbg37-f(seqidno：3)：ctggatccaaacaggatgtttatttggatgat。

pbg37-r(seqidno：4)：cagcggccgcattatttgaaacctgattaattgagt。

2.3目的基因的pcr擴(kuò)增。

將引物稀釋后以p.berghei基因組dna為模板，以pbg37-f和pbg37-r為引物擴(kuò)增基因片段。

pcr反應(yīng)體系具體為：10μm引物pbg37-f1.5μl、10μm引物pbg37-r1.5μl、2mmdntps5μl、10×緩沖液5μl、25mm硫酸鎂3μl、基因組dna模板1μl、dna聚合酶1μl、超純水補(bǔ)充至50μl。

pcr反應(yīng)程序如下:98℃2min—98℃10sec，56℃30sec，68℃1min，35個(gè)循環(huán)—68℃5min。

2.4pcr產(chǎn)物的回收。

將上述pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切下目的基因片段，按照dna純化試劑盒操作說明進(jìn)行pcr產(chǎn)物的回收。

2.5pet32a-pbg37載體的構(gòu)建。

將所得的回收產(chǎn)物克隆入pmd18-t載體后，轉(zhuǎn)化宿主菌dh-5α，采用菌體pcr方法鑒定陽性克隆，挑取陽性克隆并提取質(zhì)粒后，送華大基因公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)ncbi數(shù)據(jù)庫中的blast工具進(jìn)行比對(duì)。測(cè)序結(jié)果正確的質(zhì)粒及pet32a載體用限制性核酸內(nèi)切酶bamhi和noti進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，條件為37℃反應(yīng)2h，將酶切后的dna片段及載體回收并純化。

酶切反應(yīng)體系具體為：pcr產(chǎn)物35μl、bamhi1μl、noti1μl、10x酶切緩沖液5μl、超純水8μl。

pet32a載體酶切體系：pet32a20μl、bamhi1μl、noti1μl、10x酶切緩沖液5μl、超純水23μl。

用ligationhigh連接酶連接回收后的片段及pet32a載體，16℃連接1h，連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化宿主菌tg1中，采用菌體pcr方法鑒定陽性克隆，并挑取陽性克隆提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定后保存菌種，見圖2，其中，泳道1為dna核苷酸大小標(biāo)準(zhǔn)(dnamarker)；泳道2為質(zhì)粒pet32a-pbg37酶切結(jié)果。酶切后的質(zhì)粒為5866bp，目的基因片段為189bp，與預(yù)期結(jié)果相符。

連接體系如下：pcr產(chǎn)物bamhi、noti雙酶切回收片段9μl、pet32a質(zhì)粒bamhi、noti雙酶切產(chǎn)物1μl、ligationhigh10μl。

3.蛋白表達(dá)、純化與鑒定。

挑取經(jīng)酶切鑒定正確的陽性菌落，37℃搖菌過夜，提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至原核表達(dá)菌株escherichiacolirosetta-gamib(de3)中；取轉(zhuǎn)化成功的菌液按1:100的比例轉(zhuǎn)接到新鮮的lb培養(yǎng)基，37℃搖菌2h后測(cè)定菌液的od值；當(dāng)od值達(dá)到0.6-0.8后，加入iptg至終濃度1.0mm，20℃誘導(dǎo)8h；10000rpm離心10min收菌；菌體加入1×ni-nta結(jié)合緩沖液重懸并進(jìn)行超聲裂解菌體(超聲2s，間隔3s，全程時(shí)間30min，冰上進(jìn)行)，4℃條件下，12000r/min離心5min，取上清液樣品，加至5ml50％鎳氨三乙酸瓊脂糖柱ni-ntahis·bindsuperflow中純化蛋白；將純化后的蛋白放入透析袋中，并在含咪唑的pbs緩沖液中進(jìn)行梯度透析，4℃條件下進(jìn)行，最終的產(chǎn)品溶于純的pbs緩沖液中；10％的聚丙烯酰胺凝膠電泳證明純化成功(目標(biāo)蛋白rpbg37的分子量約為27.9kda)，見圖3，其中，泳道m(xù)為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(蛋白marker)；泳道rpbg37為純化后帶his標(biāo)簽重組蛋白，蛋白分子量為27.9kda，所得蛋白大小與預(yù)期相符。

實(shí)施例2。

免疫血清的制備及蛋白定位。

1.免疫血清的制備。

6-8周齡balb/c雌性小鼠10只，分2組，每組5只。第1組注射實(shí)施例1制備的重組蛋白，第2組為pbs對(duì)照組。用純化的重組蛋白(50μg/小鼠)與弗氏完全佐劑研磨為油包水狀乳劑，100μl/只皮下注射免疫小鼠。于第3周和第5周再分別給予兩次加強(qiáng)免疫，25μg重組蛋白與弗氏不完全佐劑研磨為油包水狀乳劑，100μl/小鼠皮下注射免疫小鼠。第三次免疫后10天收集小鼠血清，elisa檢測(cè)小鼠血清特異性抗體水平，與pbs免疫組相比抗體水平顯著升高(p<0.01)，抗體效價(jià)超過1:64000，見圖4，抗體滴度達(dá)到1:64000，證明重組蛋白具有較強(qiáng)抗原性。

2.pbg37表達(dá)階段的確定。

2.1westernblot鑒定pbg37的表達(dá)階段。

純化的裂殖體、配子體合子和動(dòng)合子用0.15％的皂角苷裂解去除紅細(xì)胞，純度可達(dá)到80％以上，用裂解液(1％tritonx-100,2％sds，pbs溶解，含蛋白酶抑制劑)進(jìn)行裂解30min。5×10⁷/泳道瘧原蟲用10％的sds-page電泳分離。電泳完畢后，4℃60v恒壓轉(zhuǎn)膜3h。以5％脫脂奶粉(tbs溶解)4℃封閉過夜。tbst(0.1mtbs，ph7.4，0.02％tween20)漂洗三次，每次5min。tbst稀釋抗rpbg37鼠血清(1:500)與pvdf膜室溫結(jié)合3h。小鼠抗rpbhsp70蛋白血清(1:500)作為陽性對(duì)照。用tbst將pvdf膜洗滌三次，每次5min。再用tbst稀釋hrp標(biāo)記的山羊抗小鼠igg(1:5000)，孵育pvdf膜，室溫2h。tbst洗滌三次后用ecl發(fā)光方法在熒光圖像分析系統(tǒng)中檢測(cè)。結(jié)果顯示在配子體、合子與動(dòng)合子階段約27.9kda處有特異性條帶，即抗rpbg免疫血清可識(shí)別配子體、合子與動(dòng)合子階段表達(dá)的蛋白，見圖5，其中，泳道sch為裂殖體抗原，泳道gam為配子體抗原，泳道zyg為合子抗原，泳道ook為動(dòng)合子抗原；hsp70為陽性對(duì)照用來定量蛋白的上樣量。在裂殖體抗原泳道沒有特異性條帶，在配子體、合子和動(dòng)合子抗原泳道上37.5kda左右均有特異性條帶，證明pbg37主要在瘧原蟲有性階段表達(dá)。

2.2ifa鑒定pbg37的表達(dá)階段。

純化后的各階段瘧原蟲經(jīng)pbs洗一次后，4％多聚甲醛室溫固定20min，細(xì)胞經(jīng)/不經(jīng)0.1％tritonx-100進(jìn)行透膜10min。用50mm甘氨酸/pbs進(jìn)行漂洗后，細(xì)胞用含5％脫脂奶粉的pbs37℃封閉30min。加入1:500稀釋的抗rpbg37免疫血清或抗pbs21單克隆抗體(陽性對(duì)照)，37℃孵育2h。隨貨加入羊抗鼠alexa-488熒光二抗(1:500稀釋)，37℃孵育60min。dapi染色30min后經(jīng)抗淬滅封片劑goldantifadereagent封片，熒光顯微鏡觀察結(jié)果，adobephotoshop分析，結(jié)果顯示抗rpbg37的免疫血清可識(shí)別配子體、配子、合子、未成熟動(dòng)合子及成熟動(dòng)合子細(xì)胞表面抗原，提示pbg37主要表達(dá)于瘧原蟲的有性生殖階段表面，見圖6，主要包括的瘧原蟲階段有：雌、雄配子體，雌、雄配子，合子，未成熟動(dòng)合子及成熟動(dòng)合子；pbs21標(biāo)記的動(dòng)合子用作陽性對(duì)照；control為pbs免疫的血清標(biāo)記的動(dòng)合子為陰性對(duì)照。bf為亮視野，fitc為綠色熒光，dapi為核染色，merge為fitc和dapi的合成圖像。在裂殖體階段沒有綠色熒光，在雌、雄配子體，雌、雄配子，合子，未成熟動(dòng)合子及成熟動(dòng)合子階段有綠色熒光。證明pbg37主要在瘧原蟲有性階段表達(dá)。

實(shí)施例3。

打靶載體的構(gòu)建與δpbg37瘧原蟲的獲取。

1.基因敲除的打靶載體的構(gòu)建。

應(yīng)用雙交叉同源重組的方法靶向敲除pbg37基因，成功構(gòu)建基因敲除的打靶載體。根據(jù)載體構(gòu)建流程圖所示見圖7，pbg37為目的基因，5’utr和3’utr為目的基因兩側(cè)同源臂，p1、p2、p3、p4及p5為設(shè)計(jì)的鑒定基因敲除基因型的引物。

首先，應(yīng)用pcr方法成功擴(kuò)增出5’utr片段，擴(kuò)增長(zhǎng)度為699bp，上下游引物5’端分別引入限制性內(nèi)切酶hindⅲ和psti酶切位點(diǎn)；引物序列如下：pbg37-5u-f(seqidno：5)：cccaagcttgtgttgaaaatgctatcgaaat；pbg37-5u-r(seqidno：6):aactgcagaaagacctttggatgatttg；將5’utr及pl0034載體通過hindⅲ與psti雙酶切構(gòu)建出質(zhì)粒pl0034-pbg37-5u。

隨后，成功擴(kuò)增出3’utr片段，擴(kuò)增長(zhǎng)度為578bp，上下游引物5’端分別引入限制性內(nèi)切酶xholi和noti酶切位點(diǎn)。引物序列如下：pbg37-3u-f(seqidno：7)：ccgctcgagaagtaaaagccagggaatga；pbg37-3u-r(seqidno：8):cagcggccgccattatagcagttgccgatc；將3’utr及pl0034-pbg-5u通過xholi和noti雙酶切構(gòu)建出重組質(zhì)粒pl0034-pbg37-5u-3u。

重組質(zhì)粒經(jīng)公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與plasmodb瘧原蟲網(wǎng)站公布序列一致。

2.p.berghei裂殖體的培養(yǎng)與分離。

p.berghei感染苯肼處理過的balb/c小鼠，待感染率達(dá)5～10％，乙醚麻醉小鼠，心臟采血并將血液置于裂殖體培養(yǎng)基中(rpmi1640含20％(v/v)胎牛血清(fbs),50mg/l青霉素與鏈霉素,50ml培養(yǎng)基/0.5ml血液)，37℃100rpm培養(yǎng)16小時(shí)。培養(yǎng)物經(jīng)55％的nycodenz密度梯度離心分離，收集中間灰白層裂殖體，pbs清洗2次，取lμl經(jīng)giemsa染色，光鏡下計(jì)數(shù)裂殖體含量與純度。

3.基因敲除型瘧原蟲δpbg37的制備、篩選與鑒定。

pl0034-pbg37-3u-5u打靶質(zhì)粒經(jīng)大量提取后，用hindⅲ和noti進(jìn)行酶切使質(zhì)粒完全線性化。將提純后的線性化質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入純化的裂殖體內(nèi)，并經(jīng)尾靜脈注射給小鼠。pbg37基因?qū)⒈籶l0034載體內(nèi)的藥物壓力選擇標(biāo)記物基因hdhfr與yfcu等替代，即是通過同源重組雙交叉法，達(dá)到完全敲除pbg37基因的目的。線性化質(zhì)粒電轉(zhuǎn)染瘧原蟲24h后，給予小鼠乙胺嘧啶(0.07mg/ml)飲用水，進(jìn)行藥物篩選。第6天開始取尾靜脈血，制備薄血膜片，吉姆薩染色光學(xué)顯微鏡下觀察監(jiān)測(cè)外周血是否有瘧原蟲出現(xiàn)，當(dāng)發(fā)現(xiàn)瘧原蟲后，取少量尾血進(jìn)行外周血pcr鑒定基因型，設(shè)計(jì)pcr鑒定引物如下：p1和p2擴(kuò)增出的是野生型；引物p1和p3擴(kuò)增出的是5’utr同源重組成功的序列；引物p4和p5擴(kuò)增出的是3’utr同源重組成功的序列。序列如下：

p1(seqidno：9)：ggaaggtattaagcaagggg。

p2(seqidno：10)：atcatccaaataaacatcctgt。

p3(seqidno：11)：ctggtgctttgaggggtgag。

p4(seqidno：12)：tttttccttcaatttcggg。

p5(seqidno：13)：taagtttgagatgcccctgc。

pcr鑒定含有重組瘧原蟲基因型出現(xiàn)后，在瘧疾血癥達(dá)到1-3％時(shí)，小鼠尾靜脈取血，用生理鹽水將小鼠血液稀釋，最終稀釋量為1個(gè)irbc/100μl。將稀釋的瘧原蟲經(jīng)尾靜脈注射給10只balb/c小鼠(100μl/只)進(jìn)行克隆。小鼠給予乙胺嘧啶水飲用，感染后的第6天開始監(jiān)測(cè)外周血是否有耐藥蟲株的出現(xiàn)，經(jīng)瘧原蟲感染后的小鼠尾血再次pcr進(jìn)行鑒定pcr鑒定結(jié)果顯示我們成功敲除pbg37基因，見圖8，wt和δpbg37分別為野生型瘧原蟲和敲除型瘧原蟲的基因組,其中，p1和p2擴(kuò)增的是野生的基因型(1902bp)，p1和p3擴(kuò)增的是5’utr重組成功的基因型(1828bp)，p4和p5擴(kuò)增的是3’utr重組成功的基因型(1552bp)。pcr結(jié)果顯示基因敲除成功。

實(shí)施例4。

敲除型瘧原蟲δpbg37表型及功能分析。

6-8周齡的雌性balb/c小鼠，分成兩組，每組5只，苯肼處理小鼠后分別感染5×10⁶個(gè)δpbg37或野生型瘧原蟲，于感染后的第三天giemsa開始計(jì)算瘧疾血癥，配子體血癥與雌、雄配子體比率。同時(shí)尾靜脈取10μl血液置于40μl動(dòng)合子培養(yǎng)液中，瘧原蟲在25℃下培養(yǎng)15min，10min內(nèi)用普通顯微鏡觀察配子出絲數(shù)。將培養(yǎng)物繼續(xù)在19-20℃下培養(yǎng)24h，用抗pbs21抗體與羊抗鼠alexa-488熒光二抗標(biāo)記培養(yǎng)物，在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)合子，未成熟動(dòng)合子及成熟動(dòng)合子數(shù)量。小鼠于感染后的第三天，用饑餓了12h的按蚊吸食血液30min，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組每組至少用30只按蚊，吸血后的按蚊于第14天進(jìn)行解剖，計(jì)數(shù)蚊胃壁的卵囊數(shù)與蚊感染率。δpbg37型瘧原蟲與野生型(wt)瘧原蟲相比，紅細(xì)胞感染率無顯著差異，提示pbg37在瘧原蟲無性生殖階段不發(fā)揮明顯的作用，與pbg37不在裂殖體階段表達(dá)一致。δpbg37型瘧原蟲與野生型相比配子體血癥下降了70.8％，雌雄配子體比例變?yōu)?:1，提示雄性配子體顯著減少。δpbg37型瘧原蟲與野生型瘧原蟲在含有等量雄性配子體的情況下，敲除株δpbg37配子體出絲明顯減少36％(p<0.01)；動(dòng)合子數(shù)下降了45％(p<0.01)。δpbg37型瘧原蟲感染按蚊后，與野生型相比其卵囊數(shù)減少了90.4％(p<0.01)，蚊子感染率下降了23.8％，差異具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖9。其中，圖9中a為配子體率，b為雌雄配子體比例，c為雄性配子體出絲數(shù)量，d為體外培養(yǎng)合子、未成熟動(dòng)合子及成熟動(dòng)合子數(shù)量，e為蚊胃壁卵囊數(shù)量。結(jié)果顯示基因敲除之后配子體率下降，雌雄配子體比例升高，雄性配子體出絲、動(dòng)合子形成數(shù)量及卵囊形成數(shù)量均下降?；蚯贸懺x與野生型瘧原蟲相比，卵囊數(shù)量及蚊蟲感染率，見表1。結(jié)果顯示基因敲除后卵囊數(shù)量顯著下降，蚊蟲感染率也明顯下降。

表1敲除株δpbg37蚊胃壁卵囊形成數(shù)量及蚊蟲感染率。

由此可見，pbg37對(duì)雄配子出絲、動(dòng)合子的發(fā)育以及卵囊的形成均具有至關(guān)重要的作用。

實(shí)施例5。

抗rpbg37抗體傳播阻斷效應(yīng)評(píng)價(jià)。

1.體外傳播阻斷-配子體出絲率及動(dòng)合子形成率抑制實(shí)驗(yàn)。

balb/c雌性小鼠經(jīng)腹腔注射1×10⁶p.berghei感染的紅細(xì)胞，感染第3天，尾靜脈采血檢測(cè)配子體出絲情況，取10μl血液置于90μl動(dòng)合子培養(yǎng)液中，加稀釋的重組蛋白/對(duì)照免疫的小鼠血清(1:5/1:10/1:50)，在25℃下培養(yǎng)15min，10min內(nèi)用普通顯微鏡觀察配子出絲數(shù)。培養(yǎng)液繼續(xù)在19-20℃培養(yǎng)24h，用抗pbs21抗體和羊抗鼠alexa-488熒光二抗標(biāo)記培養(yǎng)物，在熒光顯微鏡下觀察動(dòng)合子形成率。rpbg37免疫血清與瘧原蟲共同培養(yǎng)后使配子體出絲率和動(dòng)合子形成率均減少，且呈抗體劑量依賴模式。與對(duì)照組相比，在動(dòng)合子培養(yǎng)液中分別含1:5，1:10與1:50的免疫血清時(shí)，配子體出絲率分別減少了70％，65％及60％(p<0.05)；動(dòng)合子形成率分別減少了71％，58％及52％(p<0.05)，說明rpbg37免疫血清可明顯阻斷配子體出絲和動(dòng)合子的形成，且呈抗體劑量依賴模式，見圖10，a為抗血清在稀釋倍數(shù)為1:5,1:10和1:50時(shí)阻斷雄性配子體出絲的能力，b為抗血清在稀釋倍數(shù)為1:5,1:10和1:50時(shí)阻斷動(dòng)合子形成的能力。

2.體內(nèi)傳播阻斷-直接膜伺實(shí)驗(yàn)。

經(jīng)rpbg37/pbs免疫的小鼠，于免疫后第十天，小鼠經(jīng)腹腔注射1×10⁶p.berghei感染的紅細(xì)胞，感染第3天，尾靜脈采血檢測(cè)配子體出絲情況，用至少50只按蚊吸取小鼠血液30min，吸血后第14天檢查蚊胃壁上的卵囊形成數(shù)量，見圖10中的c。重組蛋白免疫小鼠與對(duì)照組小鼠相比，卵囊數(shù)量及蚊蟲感染率，見表2，結(jié)果顯示重組蛋白免疫組蚊胃壁卵囊形成數(shù)量與對(duì)照組相比下降了49.1％，蚊感染率也下降了9.2％。

表2：rpbg37免疫小鼠蚊胃壁卵囊形成數(shù)量及蚊蟲感染率。

但實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改和替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

序列表

<110>中國醫(yī)科大學(xué)

<120>一種伯氏瘧原蟲配子體重組蛋白（rpbg37）及其制備方法和在瘧疾傳播阻斷中的應(yīng)用

<160>13

<210>1

<211>63

<212>prt

<213>人工合成

<400>1

lysglnaspvaltyrleuaspaspgluphelysserphethrphephephealaserser

15101520

proseralaasnpheleuserargilevalhisserasnglualalysphethrglnile

2125303540

lysasnlysthraspiletrpasnlysthrileasplysalatyrserileasnglnval

4145505560

serasnasn

6163

<210>2

<211>189

<212>dna

<213>人工合成

<400>2

aaacaggatgtttatttggatgatgaattcaaaagtttcacgtttttttttgcttcttccccatcggcta70

attttttgtcccggattgtccatagcaatgaagcgaaatttacccaaataaaaaacaaaacagatatatg140

gaacaaaacaatagacaaagcatactcaattaatcaggtttcaaataat189

<210>3

<211>32

<212>dna

<213>人工合成

<400>3

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<210>4

<211>36

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<213>人工合成

<400>4

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<210>5

<211>31

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<213>人工合成

<400>5

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<210>6

<211>28

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<210>7

<211>29

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<400>7

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<210>8

<211>30

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<213>人工合成

<400>8

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<210>9

<211>20

<212>dna

<213>人工合成

<400>9

ggaaggtattaagcaagggg20

<210>10

<211>22

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<213>人工合成

<400>10

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<210>11

<211>20

<212>dna

<213>人工合成

<400>11

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<210>12

<211>19

<212>dna

<213>人工合成

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tttttccttcaatttcggg19

<210>13

<211>20

<212>dna

<213>人工合成

<400>13

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