本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及肝癌標(biāo)志物lnc-pcdh9-13:1的檢測試劑在制備肝癌診斷的試劑/試劑盒中的應(yīng)用，及以一種診斷肝癌的試劑及試劑盒。

背景技術(shù)：

我國是肝癌大國，肝癌的發(fā)病率和死亡率都占了全球的一半以上。肝癌的準(zhǔn)確診斷具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

現(xiàn)時(shí)，國際上通常用來篩查肝癌的生物標(biāo)志物是血清afp(甲胎蛋白)。但其敏感性只有39％至65％，特異性只有76％至94％。由于其檢測肝癌的敏感性跟特異性不甚理想，因此美國的治療指南不推薦血清afp用于肝癌的診斷。中國跟歐洲的治療指南都指出，正常個(gè)體的afp水平應(yīng)小于20ng/ml，大于400ng/ml則可提示肝癌的診斷。而20至400ng/ml則是診斷的“灰色地帶”。因此利用afp篩查肝癌容易導(dǎo)致誤診漏診。

非編碼rna參與了多種疾病尤其是腫瘤發(fā)生的調(diào)控過程，是近期研究熱點(diǎn)之一。如今，已發(fā)現(xiàn)人體有超過3萬種非編碼rna。非編碼rna雖然不編碼蛋白，但在生命中同樣其中非常重要的作用。例如直接調(diào)節(jié)其他基因的表達(dá)，如基因的活化、沉默、印跡等。在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平調(diào)節(jié)rna或蛋白的表達(dá)水平，或結(jié)構(gòu)等。最終影響著細(xì)胞內(nèi)的各種活動(dòng)。

長鏈非編碼rna是指長度超過200個(gè)核苷酸、具有調(diào)控基因表達(dá)的非編碼rna，越來越多的lncrna(longnon-conding，長非編碼rna)分子被發(fā)現(xiàn)它們不僅對(duì)多種疾病具有診斷及預(yù)測預(yù)后的價(jià)值，同時(shí)可調(diào)控多種rna及蛋白的結(jié)構(gòu)及表達(dá)，在疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用。因此lncrna有望成為腫瘤診斷標(biāo)志物和腫瘤治療物的靶點(diǎn)。

除了血液取樣方式，另一種診斷方式是組織取樣診斷。然而，肝組織取樣對(duì)人體破壞性強(qiáng)，因此，亟須一種沒有創(chuàng)傷式而準(zhǔn)確的診斷方法。

人體唾液腺中存在許多毛細(xì)血管網(wǎng)，因此，唾液是血液循環(huán)的末端產(chǎn)物。血液中存在的分子物質(zhì)，例如dna、rna、蛋白、藥物、病毒等，都能在唾液中找到。因而唾液被認(rèn)為是人體健康狀態(tài)的一面鏡子，能反映出機(jī)體的各種內(nèi)環(huán)境狀態(tài)，例如癌癥、感染、系統(tǒng)性疾病等。美國的食品及藥物管理局(fda)已經(jīng)批準(zhǔn)了利用唾液檢測藥物濫用、hiv感染、激素水平、中毒等試劑在市場上應(yīng)用，現(xiàn)已在全美都已經(jīng)得到普及。在臨床中，于唾液中尋找分子標(biāo)記物是最理想的方法，因?yàn)槭占僖捍嬖诤唵?、方便、無創(chuàng)、經(jīng)濟(jì)、不會(huì)引起患者不安、操作者易于掌握等優(yōu)點(diǎn)。研究已經(jīng)證實(shí)了唾液中的轉(zhuǎn)錄物、蛋白、代謝物和其他分子物質(zhì)能檢測出口腔癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、干燥綜合征等其他口腔或者系統(tǒng)性疾病。體內(nèi)的長鏈非編碼rna(longnon-codingrna，lncrna)與包括肝癌在內(nèi)的多種癌癥的發(fā)病與發(fā)展密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)多種lncrna在肝癌組織中表達(dá)失調(diào)，組織中表達(dá)失調(diào)的lncrna可作為生物標(biāo)記物對(duì)肝癌有較佳的診斷價(jià)值。盡管目前已有大批的肝癌標(biāo)記物被發(fā)現(xiàn)，這些標(biāo)記物存在于組織樣品或血液樣品中，然而，同樣的標(biāo)記物采用唾液樣本取樣，往往是另一個(gè)結(jié)果，不能用作肝癌診斷。這很可能是因?yàn)槟鼙环置诘酵僖褐械臉?biāo)記物本身就很少，并且唾液中存在大量的酶，標(biāo)記物容易降解。但唾液lncrna是否可作為生物標(biāo)記物協(xié)助診斷肝癌，目前尚無報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供lnc-pcdh9-13:1的檢測試劑在制備肝癌診斷試劑/試劑盒中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的還在于同時(shí)提供了一種肝癌診斷的試劑/試劑盒。

本發(fā)明的上述目的通過以下技術(shù)手段實(shí)現(xiàn)：

lnc-pcdh9-13:1為近2年內(nèi)新發(fā)現(xiàn)的lncrna，總長度為972bp，由lnc-pcdh9-13基因所編碼，位于第13號(hào)染色體h19基因組，序列從第6454958堿基至64550555堿基。無突變的lnc-pcdh9-13:1序列如seqidno：1所示。目前，尚未有相關(guān)的研究報(bào)道顯示lnc-pcdh9-13:1與肝癌相關(guān)。

一方面，本發(fā)明提供了lnc-pcdh9-13:1的檢測試劑在制備肝癌診斷試劑/試劑盒中的應(yīng)用；優(yōu)選地，所述的lnc-pcdh9-13:1的序列如seqidno：1所示。

一方面，本發(fā)明提供了lnc-pcdh9-13:1在篩選抗肝癌藥物中的應(yīng)用；

一方面，本發(fā)明提供了一組lncrna引物，所述lncrna引物為lnc-pcdh9-13:1的反轉(zhuǎn)錄引物，包括seqidno：2和seqidno：3所示的引物對(duì)，或者如seqidno：4和seqidno：5所示的引物對(duì)，或者如seqidno：6和seqidno：7所示的引物對(duì)。

一方面，本發(fā)明提供了上述的引物對(duì)在制備肝癌診斷試劑/試劑盒中的應(yīng)用。

一方面，本發(fā)明提供一種肝癌診斷試劑/試劑盒，其特征在于，所述的診斷試劑/試劑盒含有檢測樣本中l(wèi)nc-pcdh9-13:1表達(dá)量的試劑。

本發(fā)明中，所述的試劑/試劑盒檢測的樣本為組織、血液、唾液；優(yōu)選地，為唾液。因?yàn)槭占僖捍嬖诤唵?、方便、無創(chuàng)、經(jīng)濟(jì)、不會(huì)引起患者不安、操作者易于掌握等優(yōu)點(diǎn)。

所述的檢測樣本中l(wèi)nc-pcdh9-13:1表達(dá)量為通過qpcr、基因微陣列對(duì)lnc-pcdh9-13:1進(jìn)行定量分析；作為優(yōu)選的實(shí)施方式，采用qpcr對(duì)lnc-pcdh9-13:1進(jìn)行定量分析。

所述的試劑/試劑盒的檢測結(jié)果為：當(dāng)樣本中的lnc-pcdh9-13:1的表達(dá)量大于1.85時(shí)，肝癌陽性，當(dāng)樣本中的lnc-pcdh9-13:1的表達(dá)量小于1.85時(shí)，肝癌陰性；更優(yōu)選地，當(dāng)唾液中的lnc-pcdh9-13:1的表達(dá)量大于1.85時(shí)，肝癌陽性；當(dāng)唾液中的lnc-pcdh9-13:1的表達(dá)量小于1.85時(shí)，肝癌陰性；所述的lnc-pcdh9-13:1的表達(dá)量是通過qpcr相對(duì)表達(dá)量法測定的，其中內(nèi)參為β-actin。

所述的試劑/試劑盒含有l(wèi)nc-pcdh9-13:1的反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增引物，用于檢測lnc-pcdh9-13:1的表達(dá)量。作為一種實(shí)施方式，所述的擴(kuò)增引物如seqidno：2和seqidno：3所示；作為另一種實(shí)施方式，所述擴(kuò)增引物如seqidno：4和seqidno：5所示；作為另一種實(shí)施方式，所述的擴(kuò)增引物如seqidno：6和seqidno：7所示。所述擴(kuò)增引物通過qpcr檢測lnc-pcdh9-13:1的表達(dá)量。

進(jìn)一步地，所述的試劑/試劑盒還含有蛋白酶；優(yōu)選地，所述的蛋白酶為蛋白酶k；

進(jìn)一步地，所述的試劑/試劑盒還含有酸酚氯仿混合物；優(yōu)選地，所述的酸酚氯仿混合物為鹽酸-苯酚-氯仿混合物；更優(yōu)選地；苯酚與氯仿的體積比為4.5-5.5:1；更優(yōu)選地，所述的酸酚氯仿混合物ph值為4.3-4.7；

進(jìn)一步地，所述的試劑/試劑盒還含有rna酶抑制劑；優(yōu)選地，所述的rna酶抑制劑為焦碳酸二乙酯(depc)。

作為一種試劑/試劑盒的使用方法：其包括提取唾液中總rna后，進(jìn)行l(wèi)nc-pcdh9-13:1的逆轉(zhuǎn)錄，再通過qpcr反應(yīng)檢測lnc-pcdh9-13:1水平。

提取唾液lnc-pcdh9-13:1的方法可采用以下步驟：

s1.取唾液樣本，加入蛋白酶，60-65℃孵育以去除唾液蛋白；

s2.加入酸酚氯仿混合物后，10000-12000g離心4-6分鐘，收集上清；

s3.加入1.2-1.4倍體積的乙醇，再經(jīng)5000-6000g離心20-60秒過濾離心，棄濾液；

s4.加入預(yù)熱的rna抑制酶水，10000-12000g離心20-60秒，收集rna；

s5.對(duì)lnc-pcdh9-13:1進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，再通過引物和qpcr反應(yīng)檢測lnc-pcdh9-13:1水平。

另一方面，本發(fā)明還提供了一種檢測肝癌的芯片，特征在于，所述的芯片包括固相載體以及固定于固相載體上的生物標(biāo)志物lnc-pcdh9-13:1的探針。

所述的lnc-pcdh9-13:1的序列如seqidno：1所示。

另一方面，本發(fā)明還提供了一種肝癌診斷系統(tǒng)：其特征在于，所述的檢測系統(tǒng)含有：

a)檢測構(gòu)件：所述的檢測構(gòu)件用以檢測待測樣本中l(wèi)nc-pcdh9-13:1的表達(dá)量；

b)結(jié)果判斷構(gòu)件：所述的結(jié)果判斷構(gòu)件用于根據(jù)檢測構(gòu)件所檢測的lnc-pcdh9-13:1的表達(dá)量得出肝癌的患病風(fēng)險(xiǎn)高低或是患病風(fēng)險(xiǎn)值；

所述的樣本為組織、血液、唾液；更優(yōu)選地，為唾液；

所述的檢測構(gòu)件為rtpcr構(gòu)件、qpcr構(gòu)件、基因微陣列構(gòu)件、基因表達(dá)序列分析sage構(gòu)件、宏基因組測序構(gòu)件；更優(yōu)選地，為qpcr構(gòu)件；

所述的結(jié)果判斷構(gòu)件為軟件，其含有輸入模塊、分析模塊和輸出模塊；輸入模塊用于輸入lnc-pcdh9-13:1的表達(dá)量；分析模塊用于根據(jù)lnc-pcdh9-13:1的表達(dá)量，分析出肝癌的患病風(fēng)險(xiǎn)高低或是患病風(fēng)險(xiǎn)值；輸出模塊用于輸出分析模塊的分析結(jié)果；

所述的診斷系統(tǒng)中，當(dāng)樣本中的lnc-pcdh9-13:1的表達(dá)量大于1.85時(shí)，診斷結(jié)果為肝癌陽性，當(dāng)樣本中的lnc-pcdh9-13:1的表達(dá)量小于1.85時(shí)，診斷結(jié)果為肝癌陰性；更優(yōu)選地，當(dāng)唾液中的lnc-pcdh9-13:1的表達(dá)量大于1.85時(shí)，診斷結(jié)果肝癌陽性；當(dāng)唾液中的lnc-pcdh9-13:1的表達(dá)量小于1.85時(shí)，診斷結(jié)果肝癌陰性；所述的lnc-pcdh9-13:1的表達(dá)量是通過qpcr相對(duì)表達(dá)量法測定的，其中內(nèi)參為β-actin。

本發(fā)明的一大突破在于，發(fā)現(xiàn)在肝癌患者的血液、組織樣本，尤其是唾液樣本中，均存在大量的lnc-pcdh9-13:1(圖4)。lnc-pcdh9-13:1其穩(wěn)定而大量地存在，能被高重現(xiàn)性地檢出。而健康人群的樣本中，該標(biāo)記物表達(dá)水平非常低。這使得lnc-pcdh9-13:1成為一種良好的樣本尤其是唾液標(biāo)記物，對(duì)于肝癌的檢測或診斷具有突破性的意義。

本發(fā)明以唾液作為樣本來進(jìn)行肝癌標(biāo)記物的檢測，最大的難點(diǎn)在于，需要尋找到能分泌到唾液中的，且在唾液中能穩(wěn)定存在的標(biāo)記物。盡管目前已有大批的肝癌標(biāo)記物被發(fā)現(xiàn)，這些標(biāo)記物存在于組織樣品或血液樣品中，然而，同樣的標(biāo)記物采用唾液樣本取樣，往往是另一個(gè)結(jié)果，不能用作肝癌診斷。這很可能是因?yàn)槟鼙环置诘酵僖褐械臉?biāo)記物本身就很少，并且唾液中存在大量的酶，標(biāo)記物容易降解。而本發(fā)明所發(fā)現(xiàn)的這個(gè)標(biāo)記物不僅存在于組織中，并且存在于唾液中并且可以穩(wěn)定地被檢測，這使得本發(fā)明具有非常突出的取樣優(yōu)勢。

本發(fā)明首先，通過美國agilent基因芯片(圖1a)和qpcr精確定量技術(shù)(圖1b)，發(fā)現(xiàn)lnc-pcdh9-13:1在肝癌組織中表達(dá)顯著升高。同時(shí)，通過生物分析學(xué)發(fā)現(xiàn)lnc-pcdh9-13:1在肝癌等多種癌基因中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用(圖2)。接著利用定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(qpcr)更精確地檢測lnc-pcdh9-13:1，利用生物統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)相對(duì)于健康對(duì)照者，lnc-pcdh9-13:1在肝癌患者的血漿及唾液中的顯著表達(dá)升高。同時(shí)，它在組織、血漿及唾液中的表達(dá)水平互為顯著正相關(guān)(圖3)，提示唾液中的lnc-pcdh9-13:1來源于肝癌組織的分泌。接著發(fā)現(xiàn)相對(duì)與健康對(duì)照者(50例)、乙肝攜帶者(50例)、慢性活動(dòng)性乙肝患者(50例)、肝硬化患者(50例)及在我國及全球致死率排前10位的癌癥患者(除去肝癌，男女分開統(tǒng)計(jì))，lnc-pcdh9-13:1在肝癌患者的唾液中顯著高表達(dá)(圖4、圖5)。提示lnc-pcdh9-13:1對(duì)肝癌的診斷具有良好的特異性。

最后建立預(yù)測診斷肝癌的roc(receiveroperatingcharacteristic)曲線推斷，健康個(gè)體的值應(yīng)小于1.8530245。若受檢個(gè)體的唾液lnc-pcdh9-13:1的表達(dá)水平大于此值，則受檢個(gè)體判定為肝癌的敏感性為85％，特異性為98％。唾液lnc-pcdh9-13:1在成為協(xié)助篩查乙肝相關(guān)性肝癌的標(biāo)志物方面具有良好的前景，收集唾液的取樣方式簡單、方便、無創(chuàng)、價(jià)廉、不會(huì)引起患者不安、操作者易于掌握、受檢者易于接受，且準(zhǔn)確率高，對(duì)肝癌的早診早治，降低死亡率，減輕我國的醫(yī)療負(fù)擔(dān)具有重大的意義。

附圖說明

圖1為基因芯片(圖1a)和qpcr(圖1b)技術(shù)發(fā)現(xiàn)lnc-pcdh9-13:1在肝癌組織中顯著高表達(dá)，其中圓為正常組織的lnc-pcdh9-13:1表達(dá)量，方框?yàn)楦伟┙M織lnc-pcdh9-13:1表達(dá)量。

圖2為生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn)lnc-pcdh9-13:1對(duì)肝癌的癌基因起著重要的調(diào)控作用。

圖3為組織、血漿、唾液lnc-pcdh9-13:1表達(dá)量的相關(guān)性分析。

圖4為不同人群唾液樣本中的lnc-pcdh9-13:1表達(dá)水平。

圖5為唾液lnc-pcdh9-13:1在致死率排全球前10位癌癥患者間的表達(dá)差異性。

圖6為唾液lnc-pcdh9-13:1的qpcr擴(kuò)增曲線(圖6a)和溶解曲線(圖6b)和測序結(jié)果(圖6c)。

圖7為唾液lnc-pcdh9-13:1對(duì)肝癌診斷價(jià)值推斷的roc曲線。

圖8為不同血清afp組別在肝癌患者中的比例。

圖9為不同afp表達(dá)水平肝癌患者的唾液lnc-pcdh9-13:1檢出水平。

具體實(shí)施方式

以下通過具體的實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案，具體實(shí)施例不代表對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。其他人根據(jù)本發(fā)明理念所做出的一些非本質(zhì)的修改和調(diào)整仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明中，“表達(dá)量”用2^-δδct法算出并表示。ct值為qpcr對(duì)每個(gè)標(biāo)本檢測到的數(shù)值。每個(gè)樣本的δct＝lncrna–β-actin；δδct＝每個(gè)樣本的δct-健康對(duì)照組δct的平均值。

實(shí)施例1唾液采集

在唾液采集前，研究個(gè)體需禁食、禁飲、禁煙和禁止口腔清潔2h以上。

為增加唾液收集量，采用2％檸檬酸溶液濕潤無菌棉簽棉花頭，然后將棉花頭放于研究個(gè)體舌頭一側(cè)的后側(cè)壁約5s，吐出唾液后，再將棉簽放到另一側(cè)的舌頭后側(cè)壁。如此反復(fù)收集。唾液收集量需達(dá)5ml以上，收集管使用50ml無菌無酶離心管。4℃、3000g離心15min取上層上清至1.5mleppendoff管，再以4℃、12000g離心10min后再棄沉淀取上清。標(biāo)本處理后均置-80℃保存。

實(shí)施例2唾液總rna的提取

1.將1ml唾液平均分裝在兩支1.5ml的無酶ep管上，即每支ep管都盛有500μl的唾液，然后向每只ep管加入蛋白酶k(20mg/ml)15μl，混勻，放于65℃水浴鍋孵育過夜。因?yàn)橥僖褐泻休^多的消化酶類等蛋白，影響后續(xù)提取唾液rna的效果，因此此法可去除唾液蛋白對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。

2.兩支ep管各加0.5ml的酸酚氯仿混合物(主要成分為鹽酸、苯酚與氯仿)到上述唾液混合液中。

酸酚氯仿的配置

2.1苯酚與氯仿的體積比為5:1

2.2用濃鹽酸調(diào)ph值，ph值定在4.5左右，此ph值最利于提取rna?；靹?。

3.加入后手動(dòng)搖勻30到60秒。

4.室溫下10000g離心5分鐘。離心后中層液體需緊致，否則重新離心。

5.收集上清，需謹(jǐn)慎，不能攪動(dòng)下層液相。

6.將1.2-1.4倍體積的100％乙醇加到上清液中。例如收集到500μl上清，則加625μl無水乙醇。

7.將過濾管放入收集管內(nèi)，將上述混合物加到過濾管中(過濾管和收集管市場上有銷售)。

8.6000g離心30秒。

9.丟棄過濾液。重復(fù)空甩離心1次。保留收集管。

10.將700μl的75％乙醇加到過濾管中，離心15秒。丟棄過濾液。將過濾管重新放入原來的收集管中。

11.重復(fù)第10步，再洗滌一次。

12.丟棄過濾液，將過濾管放入同樣的收集管中?？账﹄x心1分鐘。

13.將過濾管放入新的收集管中。加入95℃預(yù)熱depc水。蓋好蓋子。離心30秒。收集rna。

14.收集洗脫液。洗脫液即溶解有從唾液中提取的總rna。提取后的總rna在-80℃以下保存。

實(shí)施例3唾液lnc-pcdh9-13:1逆轉(zhuǎn)錄及表達(dá)量檢測

唾液中l(wèi)nc-pcdh9-13:1的表達(dá)量采用qpcr儀檢測，相對(duì)定量表示，其中，內(nèi)參為β-actin。

1.唾液lnc-pcdh9-13:1的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

取2μlrna進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。65℃反應(yīng)5min后立即冰浴2min。

在上述2μlrna中分別加入2μl5×rtbuffer、0.5μlenzymemix、0.5μlprimermix(均為toyobo公司產(chǎn)品，貨號(hào)fsk-100)和5μl經(jīng)depc處理的無核酸酶水，然后繼續(xù)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為37℃15min,98℃5min,4℃∞。

2.唾液lnc-pcdh9-13:1的表達(dá)量檢測(qpcr反應(yīng))

取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物3μl作為模板,用sybrpremixextaqⅱ試劑盒(takara公司，貨號(hào)rb820a)進(jìn)行rt-qpcr檢測,20μl反應(yīng)體系中加入9μl的5×sybrpremixbuffer，0.8μl的上游引物，0.8μl的下游引物，和6.4μl經(jīng)depc處理的無酶水。

上游引物序列seqidno:2:

tccaagggcagcaagtaggac

下游引物序列seqidno:3

gctgtgactcgctggagaatg；

所有反應(yīng)采用3復(fù)孔,反應(yīng)條件為95℃2min,然后95℃5s,60℃10s,50個(gè)循環(huán)。溶解曲線設(shè)置：meltcurve:65.0to95.0℃,increment0.5℃for0.05min+plateread。采用bio-radcfx實(shí)時(shí)定量pcr儀進(jìn)行檢測。

實(shí)施例4擴(kuò)增曲線、溶解曲線和測序分析

在以唾液為實(shí)驗(yàn)樣本，經(jīng)過上述總rna提取、反轉(zhuǎn)錄、qpcr反應(yīng)后，進(jìn)行擴(kuò)增、溶解曲線及產(chǎn)物測序分析。

得出lnc-pcdh9-13:1的qpcr擴(kuò)增曲線、溶解曲線及測序結(jié)果如圖6所示。qpcr擴(kuò)增曲線、溶解曲線及測序結(jié)果如圖6可得出：結(jié)果表明經(jīng)上述方法檢測唾液lnc-pcdh9-13:1，能成功特異地檢測出唾液lnc-pcdh9-13:1的表達(dá)水平。

實(shí)施例5唾液樣本中的lnc-pcdh9-13:1表達(dá)水平檢測

收集健康對(duì)照個(gè)體(50例)、乙肝攜帶者(50例)、慢性活動(dòng)性乙肝患者(50例)、肝硬化患者(50例)、肝癌患者(包括早期肝癌患者的術(shù)前(50例)和術(shù)后(50例)、及晚期肝癌(50例))共350例唾液樣本。男女比例1:1。

檢測唾液lnc-pcdh9-13:1在各組中的表達(dá)水平與差異性。唾液處理及檢測方法如實(shí)施例3所示。

結(jié)果如圖4所示。唾液lnc-pcdh9-13:1在肝癌患者中的表達(dá)水平都顯著高于其它對(duì)照組。

通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，構(gòu)建roc曲線，可得出唾液lnc-pcdh9-13:1對(duì)肝癌診斷的敏感性85％，特異性可達(dá)98％。結(jié)果如圖7所示。

作為對(duì)比實(shí)驗(yàn)，發(fā)明人還檢測了所收集的肝癌患者的血清afp水平。在我們收集的肝癌患者中，只有20％的個(gè)體的血清afp水平達(dá)到肝癌的診斷水平，約50％的個(gè)體處于正常水平。結(jié)果如圖8所示。

實(shí)施例6致死率排名前10的癌癥中l(wèi)nc-pcdh9-13:1的表達(dá)量檢測

收集我國和全球致死率排名前十的癌癥患者(具體見圖5)，以及健康對(duì)照組，男女檢測個(gè)體分開統(tǒng)計(jì)。肝癌患者共100例，男女各50例。健康對(duì)照者共50例，男女各25例。其它癌癥患者男女各6例。

檢測唾液lnc-pcdh9-13:1在各組中的表達(dá)水平與差異性。唾液處理及檢測方法如實(shí)施例3所示。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，在我國及全球致死率排前10位的癌癥患者(男女分開統(tǒng)計(jì))，lnc-pcdh9-13:1在肝癌患者的唾液中顯著高表達(dá)提示lnc-pcdh9-13:1對(duì)肝癌的診斷具有良好的特異性。

對(duì)比例其他現(xiàn)有肝癌標(biāo)記物的唾液樣本檢測結(jié)果

血清afp為當(dāng)今世界上現(xiàn)有可協(xié)助肝癌診斷的生物標(biāo)志物。但其敏感性和特異性非常低。發(fā)明人進(jìn)一步分析了不同afp表達(dá)水平患者的唾液lnc-pcdh9-13:1檢出水平，結(jié)果如圖9所示。無論肝癌患者血清的afp表達(dá)水平如何，唾液lnc-pcdh9-13:1均能檢測出肝癌。它在不同afp分組肝癌患者的唾液中都出現(xiàn)顯著性高表達(dá)。唾液lnc-pcdh9-13:1比血清afp對(duì)肝癌更具有診斷價(jià)值。

sequencelisting

<110>中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院

<120>lnc-pcdh9-13:1的檢測試劑在制備肝癌診斷的試劑/試劑盒中的應(yīng)用

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